Fluid Shear에서 Bovine Serum Albumin에 대한 Candida parapsilosis의 접착

접착은 칸디다의 집락화와 발병에 있어 중요한 첫 번째 단계입니다. 여기에서는 유체 전단 하에서 고정된 단백질에 대한 C. parapsilosis isolates의 접착력을 측정하기 위해 in vitro assay가 설명됩니다. 다중 채널 미세유체 장치는 여러 샘플을 병렬로 비교한 다음 형광 이미징을 사용하여 정량화하는 데 사용됩니다.

C. parapsilosis (Cp)는 특정 집단에서 혈류 감염의 새로운 원인입니다. Cp를 포함한 칸디다 계통은 항진균제의 첫 번째 및 두 번째 라인에 대한 내성을 점점 더 발전시키고 있습니다. Cp는 손과 피부 표면, 위장관에서 자주 격리됩니다. 칸디다에 의한 집락화는 개인을 침습성 혈류 감염에 취약하게 만듭니다. 숙주를 성공적으로 군체화하거나 침입하기 위해서는 효모가 숙주 방어 메커니즘에 의한 제거를 방지하기 위해 신체 표면에 빠르게 부착할 수 있어야 합니다. 여기에서는 상업적으로 이용 가능한 다중 채널 미세유체 장치에서 종말점 접착 분석을 사용하여 생리학적 유체 전단 하에서 고정된 단백질에 대한 Cp의 접착력을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 재현성을 개선하고, 주관성을 최소화하며, 개별 분리물의 형광 정량화를 허용하도록 최적화되어 있습니다. 또한 Cp의 일부 임상 분리물은 포유류 숙주를 모방한 조건에서 성장할 때 접착력이 증가한 반면, 자주 사용되는 실험실 균주인 CDC317은 유체 전단 하에서 비접착성을 보여줍니다.

칸디다균(Candida spp.)은 인간의 피부와 점막에 흔하게 발생하는 공생 유기체로, 면역 저하자들 사이에서 침습성 질병을 유발할 수 있으며 상당한 관련 이환율, 사망률 및 비용 ^1,2,3을 유발할 수 있습니다. C. 알비칸스(C. albicans)가 이러한 감염의 중요한 원인으로 남아 있지만, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis, C. auris와 같은 비알비칸스 종은 특히 취약한 인구 집단에서 점점 더 많이 인식되고 있으며 사용 가능한 항진균제에 대한 내성이 잦습니다⁴. 비알비칸스(non-albicans) 종은 활발히 연구되고 있는 생물학 및 발병기전의 뚜렷한 요소를 나타냅니다.

접착은 집락화와 발병의 중요한 첫 번째 단계입니다. 따라서 이 단계에 대한 간섭은 초기 단계에서 질병 진행을 멈출 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 칸디다 접착 및 침습에 대한 연구는 주로 정적 조건에 초점을 맞추었습니다 ^5,6. 이러한 연구는 질병 ^7,8,9에서 진균 부착물의 구조와 기능을 정의하는 데 도움이 되었습니다. 그러나 혈류, 위장관(GI) 및 요로 및 카테터의 유착은 유착에 고유한 제약을 가하는 유체 전단 흐름 조건에서 발생해야 합니다. 전단 하에서의 접착력은 빠른 캐치 본드 형성과 액체의 움직임으로 인해 발생하는 강한 당기는 힘을 견딜 수 있는 능력을 필요로 합니다 ^10,11. C. albicans adhesin, Als5는 전단 의존성 접착을 촉진하는 것으로 나타났습니다^12,13. CpAls7 (CpALS4800)은 이전에 상피 세포에 대한 Cp의 부착을 매개하는 것으로 나타났으며, 녹아웃은 요로 감염 모델¹⁴에서 독성 감소를 보여주었습니다. 우리는 CpALS4800이 생리학적으로 관련된 유체 전단 조건¹⁵에서 접착을 촉진한다는 것을 입증했습니다.

칸디다 집락화와 발병기전은 동물 모델에서 광범위하게 연구되었습니다 16,17,18. 가장 많이 사용되는 모델은 쥐 점막 및 혈류 감염이지만 갤러리아 유충과 같은 무척추 동물 모델은 저렴한 비용, 빠른 처리량 및 단순성으로 인해 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 동물 모델은 숙주 적응 및 선천성 면역 반응, 효모와 조직 및 미생물총(microbiota)의 상호 작용, 숙주 환경에 대한 효모 반응을 포함하여 병원체와 숙주 모두에서 인간 질병 과정의 여러 단계를 요약합니다. 대조적으로, 체외 접착 분석은 접착 단계와 전단력, 효모의 성장 조건 및 특정 기질에 대한 접착과 같은 변수의 실험적 조작에 특히 초점을 맞출 수 있습니다.

Cp는 인간과 환경적 근원 모두에서 성장할 수 있기 때문에 다양한 환경을 감지하고 반응할 수 있을 것입니다. 이 개념을 뒷받침하기 위해 Cp의 여러 임상 분리물은 표준 효모 성장 배지인 효모-펩톤-포도당(YPD)에서 성장할 때 유체 전단 하에서 낮은 접착력을 보이지만 조직 배양 배지 199(M199)^15,19에서 37°C에서 몇 시간 동안 성장하면 강한 접착력으로 전환됩니다. 여기에는 성장, 유체 전단, 온도 및 기질의 정의된 조건에서 병렬로 실행되는 여러 효모 샘플의 접착력을 측정할 수 있는 중간 처리량 분석에 대한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 분석은 재현성을 극대화하고 Cp의 임상적 분리물 및 실험실에서 실험적으로 조작된 균주를 사용할 수 있도록 설계되었습니다. 소 혈청 알부민(BSA) 기질에 대한 Cp 접착에 대한 본 분석은 임상적 분리물은 다양한 접착력을 나타내는 반면, 일반적으로 사용되는 두 가지 실험실 균주인 CDC317 및 CLIB214은 접착력이 좋지 않음을 보여줍니다.

칸디다 종은 생물안전성 2등급 유기체로 분류되며 적절한 예방 조치에 따라 처리해야 합니다.

1. 임상 균주의 성장 및 유도

1. 1%(m/v) 효모 추출물, 2%(m/v) 펩톤, 2%(m/v) 포도당(YPD) 2%(m/v) 한천 플레이트에 줄무늬 Cp 균주를 만들고 22°C에서 자랍니다.
   참고: 플레이트는 실험실 벤치에 보관하고 다음 주에 재사용할 수 있습니다.
2. 접착 분석 전날, 각 균주의 약 6개 콜로니를 10mL의 YPD 배지가 들어 있는 250mL Erlenmeyer(원뿔형) 플라스크로 옮깁니다. 37°C에서 250rpm으로 설정된 미생물 셰이커에서 하룻밤 동안 성장합니다.
   참고 : Cp는 37 ° C에서 액체 배양에서 고정상에 도달하기 위해 20-24 시간 동안 성장해야합니다.
3. 접착 분석 당일에 다음 단계를 수행합니다.
   1. 삼각 플라스크에서 1mL의 액체 배양액을 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.
   2. 마이크로분리(16,000 x g)에서 최대 속도로 3분 동안 배양물을 원심분리합니다. 펠릿을 1mL의 멸균수에 재현탁시키고 이 단계를 반복하여 총 3회 세척합니다.
   3. 마지막 세척이 끝나면 펠릿을 1mL의 멸균수에 다시 현탁시킵니다. 이 단계와 후속 단계에서 효모 현탁액을 처리하기 위해 1 mL 및 200 μL 크기의 와이드 오리피스 피펫 팁을 사용하십시오.
      알림: Cp의 많은 접착 균주는 삼각 플라스크의 측면에 달라붙으며 제거하려면 기계적으로 긁어내야 합니다.
4. 혈구계 또는 이에 상응하는 장치를 사용하여 효모 세포를 계수합니다. 효모 배양액을 희석하여 50-200개의 효모 세포의 합리적으로 계수 가능한 농도를 얻습니다. 500배 희석액을 사용하여 10mL의 물에 20μL를 넣습니다.
   참고: 대부분의 Cp 균주는 37°C에서 하룻밤 동안 진탕 배양하면 10^{8-10 9} cells/mL로 성장합니다.
5. 효모 배양액을 2mL 마이크로분리 튜브에서 3 x 10⁶ cells/mL의 최종 농도로 2mL의 YPD 또는 Medium 199(M199)로 희석합니다. 37°C 수조에서 3시간 동안 배양합니다.

2. 미세유체 채널의 코팅

1. 칼슘과 마그네슘(HBSS+)을 함유한 Hank's Balanced Salt Solution에 2%(m/v) BSA 용액을 미리 준비합니다. 이를 위해 200mL의 HBSS+ 표면에 BSA 분말 4g을 부드럽게 뿌리고 37°C에서 30-60분 동안 방해받지 않고 배양하여 단백질이 젖도록 한 다음 용해시킵니다. 용액을 필터 멸균하고 4°C에서 보관하십시오.
2. 이 용액 2.5mL를 37°C로 최소 1시간 동안 가열하여 멸균 상태를 유지합니다.
   알림: 마이크로 채널 플레이트의 기포 형성을 줄이려면 온난화가 필요합니다.
3. BSA가 예열되는 동안 미세유체 컨트롤러를 조직 배양 후드로 옮기고 장치를 켜고 소프트웨어를 시작합니다.
4. 유체 계면을 멸균 필드 내에 놓고 70%(v/v) 알코올로 적신 보푸라기가 없는 티슈 페이퍼로 실리콘 개스킷을 부드럽게 청소합니다. 플라스틱이 갈라지거나 갈라지는 것을 방지하기 위해 아크릴 판에 알코올이 장기간 또는 반복적으로 접촉하지 않도록 하십시오.
5. 공기 흐름 시스템으로 후드의 인터페이스(위를 향함)를 자연 건조하여 알코올의 흔적을 모두 제거합니다.
6. 예열된 BSA 용액 100μL를 48웰, 24마이크로채널 플레이트의 각 "출구" 채널(그림 1A)의 중앙 움푹 들어간 곳에 작은 방울로 추가합니다.

그림 1. Microfluidics 분석 레이아웃. (A) "출구"에서 "입구"까지의 역 유체 흐름을 보여주는 한 쌍의 채널. 현미경으로 캡처한 연속적인 타일 필드는 점선으로 표시됩니다(위쪽 채널의 경우 1-10, 아래쪽 채널의 경우 11-20). (B) BSA 코팅 중 역류를 위한 미세유체 컨트롤러 소프트웨어 설정(2.10단계). 제조업체의 허가를 받아 여기에 재현된 스크린샷입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. 인터페이스를 마이크로 채널 플레이트 상단에 놓고 인터페이스의 4개 볼트를 플레이트의 해당 소켓과 정렬합니다.
8. 장갑을 낀 손가락을 사용하여 볼트를 조입니다. 손으로 조일 때 저항이 있으면 정렬 불량을 나타냅니다. 이 경우 인터페이스를 약간 들어 올렸다가 다시 장착하고 볼트 조임을 다시 시작합니다.
9. 볼트가 손가락으로 조여지면 토크 렌치를 사용하여 인터페이스를 더 조입니다.
10. 미세유체역학 소프트웨어 인터페이스(그림 1B)를 사용하여 모드를 수동으로 설정합니다. 두 기둥 세트에 대해 기본 유체 옵션(Water@19degC)을 사용하고 전단을 1dyn/cm^2로 설정합니다.
    1. "배출구" 열(#2,4,6,8)을 활성화하여 액체를 "흡입구"로 펌핑합니다. 실온에서 30분 동안 실행합니다 .
11. 마이크로채널 플레이트의 바닥을 들여다보면서 각 "주입구"를 육안으로 검사하여 BSA 용액의 한 방울이 각 "주입구"에 고였는지 확인합니다. 이는 24개 채널이 모두 성공적으로 습윤 및 충전되었음을 확인합니다.
12. 인터페이스의 잠금을 해제하고 각 웰("주입구" 및 "배출구")을 BSA가 없는 250μL의 HBSS+로 채워 채널의 건조를 방지하고 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다.
    참고: 단백질이 마이크로채널 플레이트의 채널 표면에 균일하게 흡착되려면 최소 48시간이 필요합니다. 단백질 코팅 후, 플레이트는 접착 분석에 사용하기 전에 습한 환경(예: 100% 포화 습도의 조직 배양 인큐베이터)에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다. 더 오랜 기간 동안 증발을 방지하기 위해 플라스틱 필름으로 플레이트를 감쌉니다.

3. 접착 분석

1. YPD 및 M199에서 효모를 배양하는 동안(1.5단계), 각 웰의 중앙 움푹 들어간 곳에서 이어지는 채널을 방해하지 않고 BSA 코팅된 마이크로채널 플레이트의 입구 및 출구 웰을 흡입합니다(그림 1A). 대신, 우물 가장자리에서 흡인하십시오. HBSS+ 1mL를 "배출구" 웰에 추가합니다.
2. 위와 같이 미세유체 인터페이스를 부착합니다(2.5단계). 기본 유체 설정인 Fluid at (Water@19degC) 및 Shear at 2 dyn/cm^2 at room temperature 를 사용하여 채널을 세척하고 결합되지 않은 BSA를 제거합니다. 이 유속으로 2-3시간 동안 세탁하십시오.
3. 마이크로채널 플레이트에서 인터페이스를 제거합니다. 미세유체 장치의 플레이트 히터 장치를 켜고 37°C로 설정되어 있는지 확인합니다.
4. 플레이트의 모든 웰에서 배지를 흡인하고 1.5단계에서 유도 효모 0.5mL를 각 "배출구" 쌍에 추가합니다. 2mL 튜브를 3-6회 뒤집어 효모를 완전히 재현탁시키고 웰에 추가하기 직전에 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. "입구" 웰은 비워 두십시오.
5. 위의 2.5단계와 같이 유체 인터페이스를 마이크로채널 플레이트에 고정합니다. 장치 소프트웨어를 사용하여 유체를 HBSS@37degC로, 전단을 5dyn/cm^2로 설정합니다.
   1. "배출구" 열(#2,4,6,8)을 활성화하여 액체를 "흡입구"로 펌핑합니다. 37°C의 플레이트 히터에서 30분 동안 작동하여 효모가 BSA 코팅 채널에 부착되도록 합니다.
6. 이 시간 동안 세척 버퍼를 준비하십시오. 칼슘과 마그네슘(DPBS+)을 함유한 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 30mL에 효모를 검출하기 위해 형광을 렌더링하기 위해 포함된 5μM의 불화칼슘을 추가합니다. 37°C의 욕조에서 데우십시오.
7. 30분 접착이 끝나면 다른 흐름 조건을 변경하지 않고 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 흐름을 일시 중지합니다 . 인터페이스를 풀고 모든 웰("입구" 및 "출구")을 흡인합니다.
8. 1mL의 calcofluor 세척 버퍼를 "배출구"에 추가합니다. 유체 인터페이스를 다시 연결하고 10분 더 소프트웨어를 사용하여 흐름을 재개합니다. 이 단계는 비접착성 및 느슨하게 결합된 효모를 씻어내는 동시에 채널에서 효모를 형광으로 염색하도록 설계되었습니다.
9. 10분 후 유체 인터페이스를 제거하고 뚜껑으로 교체합니다. 보푸라기가 없는 천으로 마이크로채널 플레이트의 바닥을 부드럽게 청소하고 이미징을 진행합니다.

4. 이미징 및 정량화

1. 마이크로채널 플레이트를 적절한 현미경 스테이지 홀더에 놓습니다. 20x 대물 렌즈를 사용하면 채널이 이미지 높이의 약 절반을 채우도록 시야를 확보할 수 있습니다. 채널 1의 왼쪽 끝을 찾습니다("inlet" 1). 조정 stage가 그림 1A, 위치 1과 같이 채널이 배치되도록 합니다.
2. 채널의 단일 명시야 이미지를 획득합니다. 데이터 분석 중에 면적 측정을 정규화하기 위해 사각형 측정 도구를 사용하여 채널 영역의 면적을 μm² 단위로 측정합니다(토론 참조).
3. DAPI 형광 채널(여기 395nm, 방출 440/40nm)로 전환하면 채널 바닥 표면의 접착 효모에 대한 초점을 조정합니다. 이 평면에서 자동 초점을 잠급니다. 형광 여기 강도를 1.5%로 설정하고 카메라 노출 조건(비닝 2x2, 15ms 노출, 12비트, 게인 4)을 설정하여 이미지 센서의 채도를 방지합니다.
4. 전동 스테이지 및 ND 획득 사용 | 현미경 컨트롤러 소프트웨어의 XY 이미징은 첫 번째 채널 쌍(1/2)의 한 시야(666μm) 떨어진 연속적인 일련의 겹치지 않는 이미지를 자동으로 캡처합니다.
   1. 상단 채널에 대해 왼쪽에서 오른쪽으로 10개의 이미지를 수집하고, 666μm 아래로 이동하고, 하단 채널에 대해 오른쪽에서 왼쪽으로 10개의 이미지를 수집합니다( 그림 1A에 개략적으로 표시된 대로).
   2. 상대 XY 옵션을 사용하면 이미지 위치가 정의되면 채널 시작을 수동으로 정의한 후 각 채널 쌍에 대해 유사한 시리즈를 트리거할 수 있습니다.
   3. DAPI 채널에서 이미지 수집(ND 획득 | λ | DAPI)입니다.
5. 이미지를 모니터링하여 전동 스테이지가 플레이트를 이동할 때 채널이 시야 내에 남아 있는지 확인합니다.
   참고: 채널 쌍의 각 20개 이미지 세트는 ND 획득에 의해 연속된 파일 이름으로 자동 저장됩니다.
6. 자동 스텝 기능(XYZ Navigation | XY 단계)를 사용하여 25750 μm를 "입구"로 이동합니다 3. 4.1단계와 같이 채널 위치를 수동으로 미세 조정합니다. 채널 쌍 3/4의 다음 이미지 세트(ND 획득)를 캡처합니다.
7. 12개의 채널 쌍이 모두 이미지화되고 결과가 12개의 파일에 저장될 때까지 이 프로세스를 반복합니다. 제조업체의 채널 순서는 1-24까지 따릅니다.
8. 12개의 형광 이미지 세트를 모두 단일 파일(파일 | ND 문서 병합). 파일 순서가 12개의 이미지 세트가 캡처된 순서와 일치하는지 확인합니다.
9. 바이너리 사용 | 효모를 형광 수준에 따라 배경에서 분리하는 임계값. 전체 이미지 스택에 동일한 임계값을 적용합니다.
   참고: 12비트 그레이스케일 강도 낮은 임계값은 500이고 높은 임계값은 최대값인 4095로 설정되는 것이 일반적입니다.
10. 임계값 영역 측정(Measure | 측정 수행 | All Frames)을 사용합니다. 보고서 열기(Analysis Controls(분석 컨트롤) | Automated Measurement Results)를 확인하고 데이터를 확인합니다.
    참고: 이렇게 하면 240개의 이미지(12개의 채널 쌍 각각에서 20개의 이미지)에 대한 측정 테이블이 생성되고 각 이미지의 임계값 영역이 BinaryArea [μm²]라고 표시된 열에 나열됩니다.
11. 탭으로 구분된 텍스트 파일로 데이터를 내보냅니다(Export).

프로토콜 섹션에 설명된 방법을 사용하여 6가지 Cp 균주의 접착력을 비교했습니다(표 1)

위의 프로토콜에서 생성된 데이터는 표준 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다. 데이터는 "접착 지수"로 표현되며, 이는 다음과 같이 계산됩니다: 10개의 이미지 각 세트에 대한 BinaryArea 값(단일 채널에 대한 효모 커버리지를 나타냄)은 이미지 전체에 걸쳐 합산되며, 각 채널 쌍의 합산된 면적에 대한 평균 및 표준 편차가 계산됩니다. 4.2단계에서 측정?...

공개 금지.

이 연구는 William and Mary Oh-William and Elsa Zopfi Professorship in Pediatrics for Perinatal Research, Kilguss Research Core 및 National Institutes of Health의 National Institute of General Medical Sciences의 Institutional Development Award(IDeA)의 보조금(보조금 번호 P30GM114750)의 지원을 받았습니다.