流体剪切下 假丝酵母菌近平滑 与牛血清白蛋白的粘附

粘附是 念珠菌定植和发病机制的重要第一步。在这里，描述了一种体外测定法，用于测量 C. parapsilosis 分离株在液体剪切下与固定化蛋白质的粘附。使用多通道微流体设备并行比较多个样品，然后使用荧光成像进行定量。

C. parapsilosis （Cp） 是某些人群血流感染的新兴原因。念珠菌 分支，包括 Cp，对第一线和第二线抗真菌药的耐药性越来越强。Cp 通常从手和皮肤表面以及胃肠道中分离出来。 念珠菌 的定植使个体易患侵袭性血流感染。为了成功定植或侵入宿主，酵母必须能够快速粘附在体表上，以防止被宿主防御机制消除。在这里，我们描述了一种在生理流体剪切下测量 Cp 与固定化蛋白质的粘附的方法，在市售的多通道微流体设备中使用终点粘附测定。该方法经过优化，可提高重现性，最大限度地减少主观性，并允许对单个分离株进行荧光定量。我们还证明，一些 Cp 的临床分离株在模拟哺乳动物宿主的条件下生长时表现出更高的粘附性，而经常使用的实验室菌株 CDC317 在流体剪切下是非粘附性的。

念珠菌属是人体皮肤和粘膜上常见的共生微生物，可导致免疫功能低下者患上侵袭性疾病，相关发病率、死亡率和成本很高 ^1,2,3。尽管白色念珠菌仍然是这些感染的重要原因，但非白色念珠菌种属，如近白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌和耳念珠菌，正越来越多地得到认可，尤其是在脆弱人群中，并且经常对现有的抗真菌药物产生耐药^{性 4}。非白色念珠菌物种呈现不同的生物学和发病机制元素，正在积极研究中。

粘附是定植和发病机制的重要第一步。因此，干扰这一步骤可能提供在早期阻止疾病进展的机会。念珠菌粘附和侵袭的研究主要集中在静态条件^{上 5,6}。这些研究有助于确定疾病中真菌粘附素的结构和功能 ^7,8,9。然而，血液、胃肠道 （GI） 道和尿路以及导管中的粘附必须在流体剪切流的条件下发生，这对粘附施加了独特的限制。剪切力下的粘附力需要快速形成锁紧键，并能够承受由于液体运动而产生的强大拉力^10,11。白色念珠菌粘附素 Als5 已被证明可促进剪切依赖性粘附^12,13。CpAls7 （CpALS4800） 先前已被证明可以介导 Cp 与上皮细胞的粘附，敲除显示尿路感染模型中的毒力降低¹⁴。我们证明 CpALS4800 在生理相关的流体剪切条件下促进粘附¹⁵。

念珠菌定植和发病机制已在动物模型中得到广泛研究 16,17,18。最常用的模型是小鼠粘膜和血流感染，但无脊椎动物模型（如 Galleria 幼虫）因其成本低、通量快和简单而被越来越多地使用。动物模型概括了病原体和宿主中人类疾病过程的许多步骤，包括宿主适应性和先天免疫反应、酵母与组织和微生物群的相互作用以及酵母对宿主环境的反应。相比之下，体外粘附测定允许专门关注粘附步骤，以及剪切力、酵母生长条件和与特定底物的粘附等变量的实验作。

由于 Cp 能够在人类和环境来源中生长，因此它很可能能够感知和响应不同的环境。为了支持这一观点，当在标准酵母生长培养基酵母蛋白胨-葡萄糖 （YPD） 中生长时，Cp 的多种临床分离株在液体剪切下表现出低粘附性，但在组织培养基 199 （M199） 中在 37 °C 下生长数小时时转变为强粘附性^15,19。此处提供了中等通量测定的详细方案，该方案允许在规定的生长、流体剪切、温度和底物条件下测量并行运行的多个酵母样品的粘附性。该检测试剂盒旨在最大限度地提高可重复性，并允许使用 Cp 的临床分离株以及在实验室中通过实验纵的菌株。此处描述的 Cp 粘附于牛血清白蛋白 （BSA） 底物的测定表明，临床分离株表现出一系列粘附，而两种常用的实验室菌株 CDC317 和 CLIB214 表现出较差的粘附。

念珠菌 属被归类为生物安全 2 级生物，应采取适当的预防措施进行处理。

1. 临床菌株的生长和诱导

1. 在 1% （m/v） 酵母提取物、2% （m/v） 蛋白胨、2% （m/v） 葡萄糖 （YPD） 2% （m/v） 琼脂平板上划线 Cp 菌株，并在 22 °C 下生长。
   注意：板可以存放在实验室工作台上，并在下周重复使用。
2. 粘附试验前一天，将每种菌株的大约 6 个菌落转移到含有 10 mL YPD 培养基的 250 mL 锥形瓶中。在37°C下设置为250 rpm的微生物摇床中生长过夜。
   注意：Cp 需要在 37 °C 的液体培养物中生长 20-24 小时才能达到固定相。
3. 在粘附测定当天执行以下步骤。
   1. 将 1 mL 液体培养物从 Erlenmeyer 烧瓶转移到微量离心管中。
   2. 在微量离心机 （16,000 x g） 中以最大速度离心培养物 3 分钟。将沉淀重悬于 1 mL 无菌水中，然后重复此步骤，总共洗涤 3 次。
   3. 在最后一次洗涤结束时，将沉淀重悬于 1 mL 无菌水中。在此步骤和后续步骤中，使用 1 mL 和 200 μL 的大口移液器吸头处理酵母悬浮液。
      注意：许多 Cp 胶粘剂菌株会粘在锥形瓶的侧面，需要机械刮擦才能去除。
4. 使用血细胞计数器或等效设备对酵母细胞进行计数。稀释酵母培养物以达到 50-200 个酵母细胞的合理可计数浓度。使用 500 倍稀释液，将 20 μL 加入 10 mL 水中。
   注：大多数 Cp 菌株在 37 °C 的过夜振荡培养物中可生长至 10^{8-10 9} 个细胞/mL。
5. 在 2 mL 微量离心管中，用 2 mL YPD 或培养基 199 （M199） 稀释酵母培养物，终浓度为 3 x 10⁶ 个细胞/mL。在 37 °C 水浴中孵育 3 小时。

2. 微流体通道的涂层

1. 提前在含钙和镁 （HBSS+） 的 Hank 平衡盐溶液中制备 2% （m/v） BSA 溶液。为此，将 4 g BSA 粉末轻轻撒在 200 mL HBSS+ 的表面，并在 37 °C 下不受干扰地孵育 30-60 分钟，让蛋白质润湿然后溶解。过滤消毒溶液并储存在 4 °C。
2. 将 2.5 mL 该溶液加热至 37 °C 至少 1 小时，保持无菌。
   注意：为了减少微通道板中气泡的形成，必须加热。
3. 当 BSA 加热时，将微流体控制器移至组织培养罩，打开设备并启动软件。
4. 将流路接口置于无菌区域内，用蘸有 70% （v/v） 酒精的无绒纸巾轻轻清洁硅胶垫圈。避免酒精长时间或反复接触亚克力板，以防止塑料开裂或开裂。
5. 使用气流系统风干通风罩中的接口（面朝上），以去除所有酒精痕迹。
6. 将 100 μL 预热的 BSA 溶液作为液滴添加到 48 孔、24 微通道板的每个“出口”通道（图 1A）的中心凹痕中。

图 1.微流体分析布局。 （A） 一对通道，显示从“出口”到“入口”的反向流体流动。显微镜捕获的连续平铺区域用虚线表示（上通道为 1-10，下通道为 11-20）。（B） 设置 BSA 涂层期间逆流的微流体控制器软件（步骤 2.10）。屏幕截图经制造商许可转载于此。 请单击此处查看此图的较大版本。

7. 将接口放在微通道板的顶部，将接口的四个螺栓与微通道板中的相应插座对齐。
8. 用戴手套的手指拧紧螺栓。请注意，对手动拧紧的阻力表示未对准。如果发生这种情况，请稍微抬起接口并重新拔插，然后继续紧固螺栓。
9. 用手拧紧螺栓后，使用扭矩扳手进一步拧紧接口。
10. 使用微流体软件界面（图 1B），将模式设置为 手动。对两组柱使用默认的流体选项 （Water@19degC），并将剪切设置为 1 dyn/cm^2。
    1. 激活“出口”色谱柱 （#2、4、6、8），将液体泵向“入口”。在室温 下运行 30 分钟。
11. 通过微通道板的底部观察，目视检查每个“入口”孔，以确保 BSA 溶液的液滴在每个“入口”中积聚。这证实了所有 24 个通道都已成功润湿和填充。
12. 解开接口，用 250 μL 不含 BSA 的 HBSS+ 加满每个孔（“入口”和“出口”），以防止通道干燥，并将板放入组织培养箱中。
    注意：蛋白质至少需要 48 小时才能均匀吸附到微通道板的通道表面。蛋白质包被后，板可以在潮湿环境（例如具有 100% 饱和湿度的组织培养箱）中储存长达两周，然后再用于粘附测定。对于较长时间，用塑料薄膜包裹板以防止蒸发。

3. 粘附试验

1. 在 YPD 和 M199 中孵育酵母期间（步骤 1.5），吸出 BSA 涂层微通道板的入口和出口孔，而不会干扰从每个孔的中心凹痕延伸的通道（图 1A）。相反，从孔边缘吸出。向“出口”孔中加入 1 mL HBSS+。
2. 如上所述连接微流体接口（步骤 2.5）。在室温下，使用默认流体设置 Fluid at （Water@19degC） 和 Shear at 2 dyn/cm^2 来清洗通道并去除任何未结合的 BSA。以该流速洗涤 2-3 小时。
3. 从微通道板上取下接口。打开微流体设备的板加热器装置并确认它设置为 37 °C。
4. 从板上的所有孔中吸出培养基，并将步骤 1.5 中的诱导酵母添加到每对“出口”中。将 2 mL 试管倒置 3-6 次，完全重悬酵母，并在加入孔之前立即轻轻上下移液。将 “ininlet ”（入口） 孔留空。
5. 如上文步骤 2.5 所示，将液流接口固定到微通道板上。使用设备软件将 Fluid 设置为 HBSS@37degC，并将 Shear 设置为 5 dyn/cm^2。
   1. 激活“出口”色谱柱 （#2、4、6、8），将液体泵向“入口”。在 37 °C 的板加热器上运行 30 分钟，以使酵母粘附在 BSA 涂层的通道上。
6. 在此期间，准备洗涤缓冲液。向 30 mL 含钙和镁 （DPBS + ） 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水中加入 5 μM 钙氟，其中含有以使酵母发出荧光以进行检测。在 37 °C 的浴中加热。
7. 在 30 分钟粘附结束时，使用软件界面 暂停 流路，而不改变其他流路条件。解开接口并吸出所有孔（“入口”和“出口”）。
8. 将 1 mL calcofluor 洗涤缓冲液添加到“出口”中。重新连接流路接口，并使用软件再恢复流速 10 分钟。此步骤旨在洗去非粘附和松散结合的酵母，同时对通道中的酵母进行荧光染色。
9. 10 分钟后，取路接口并盖上盖子。用无绒布轻轻清洁微通道板的底部，然后继续成像。

4. 成像和定量

1. 将微通道板放在合适的显微镜载物台支架中。使用 20 倍物镜，这将允许一个视野，使通道填充大约一半的图像高度。找到通道 1 的左端（在“入口”1 中）。调整载物台，使通道的位置如图 1A 位置 1 所示。
2. 获取通道的单个明场图像。使用矩形测量工具以 μm² 为单位测量通道面积的面积，以便在数据分析期间标准化面积测量（参见讨论）。
3. 切换到 DAPI 荧光通道（激发 395 nm，发射 440/40 nm），将焦点调整到通道底面上的贴壁酵母。将自动对焦锁定在此平面上。将荧光激发强度设置为 1.5% 和相机曝光条件（像素合并 2x2、15 毫秒曝光、12 位、增益 4），以避免图像传感器饱和。
4. 使用电动载物台和 ND 采集 |显微镜控制器软件中的 XY 成像 ，自动捕获一系列连续的非重叠图像，与第一通道对 （1/2） 相隔一个视场 （666 μm）。
   1. 为上通道从左到右收集 10 张图像，向下移动 666 μm，然后从右到左收集另外 10 张图像用于下通道（如图 1A 中的示意图所示）。
   2. 使用 Relative XY 选项，这样一旦定义了图像位置，就可以在手动定义通道开始后为每个通道对触发类似的序列。
   3. 在 DAPI 通道中收集图像 （ND Acquisition | λ |DAPI 的 API API 的 API API 的 API
5. 监控图像以确认当电动载物台移动板时，通道保持在视野内。
   注意：ND 采集时，来自通道对的每组 20 张图像将自动以连续的文件名保存。
6. 使用自动步进功能 （XYZ 导航 |XY 步长），将 25750 μm 向下移动到“入口”3。按照步骤 4.1 手动微调通道位置。捕获通道对 3/4 的下一组图像（ND 采集）。
7. 重复此过程，直到所有 12 个通道对都已成像，结果保存在 12 个文件中。按照制造商的通道顺序从 1 到 24。
8. 将所有 12 组荧光图像合并到一个文件中（文件 |合并 ND 文档）。确认文件顺序与捕获 12 组图像的顺序匹配。
9. 使用 二进制 | 根据荧光水平将酵母从背景中分离的阈值。将相同的阈值应用于整个图像堆栈。
   注意：通常为 12 位灰度强度下限阈值 500，上限设置为最大值 4095。
10. 测量阈值区域 （测量 |执行测量 |所有帧）。打开报表（“分析控件”|”自动测量结果）并检查数据。
    注：这将生成 240 张图像的测量表（12 个通道对中每个通道对 20 张图像），并且每个图像的阈值区域列在标有 BinaryArea [μm²] 的列中。
11. 将数据导出到制表符分隔的文本文件 （Export）。

使用方案部分中描述的方法，比较了 6 种 Cp 菌株的粘附（表 1）

上述协议产生的数据可以使用标准电子表格软件进行分析。数据表示为“粘附指数”，计算如下：将每组 10 张图像的 BinaryArea 值（代表单个通道的酵母覆盖率）在图像中求和，并计算每个通道对的求和面积的平均值和标准差。在步骤 4.2 中测量的通道面积表示酵母可能覆盖的单个视野中的最大可能面积。在该协议中，通道的整个长度记录在 10 个连续图像中，代表近 2.5mm

没有披露。

这项工作得到了 William and Mary Oh-William 和 Elsa Zopfi 围产期儿科研究教授职位、Kilguss 研究核心和美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所的机构发展奖 （IDeA） 的支持，资助号为 P30GM114750。