Adesão de Candida parapsilosis à albumina de soro bovino sob cisalhamento de fluido

A adesão é um primeiro passo importante na colonização e patogênese da Candida. Aqui, um ensaio in vitro é descrito para medir a adesão de isolados de C. parapsilosis a proteínas imobilizadas sob cisalhamento de fluido. Um dispositivo microfluídico multicanal é usado para comparar várias amostras em paralelo, seguido de quantificação usando imagens de fluorescência.

C. parapsilosis (Cp) é uma causa emergente de infecções da corrente sanguínea em certas populações. O clado Candida , incluindo o Cp, está desenvolvendo cada vez mais resistência à primeira e à segunda linha de antifúngicos. A Cp é frequentemente isolada das mãos e das superfícies da pele, bem como do trato gastrointestinal. A colonização por Candida predispõe os indivíduos a infecções invasivas da corrente sanguínea. Para colonizar ou invadir com sucesso o hospedeiro, a levedura deve ser capaz de aderir rapidamente às superfícies do corpo para evitar a eliminação pelos mecanismos de defesa do hospedeiro. Aqui descrevemos um método para medir a adesão de Cp a proteínas imobilizadas sob cisalhamento de fluido fisiológico, usando um ensaio de adesão de ponto final em um dispositivo microfluídico multicanal disponível comercialmente. Este método é otimizado para melhorar a reprodutibilidade, minimizar a subjetividade e permitir a quantificação fluorescente de isolados individuais. Também demonstramos que alguns isolados clínicos de Cp mostram maior adesão quando cultivados em condições que imitam um hospedeiro mamífero, enquanto uma cepa de laboratório frequentemente usada, CDC317, não é adesiva sob cisalhamento de fluido.

Candida spp. são organismos comensais comuns na pele e mucosas humanas que podem levar a doenças invasivas entre os imunocomprometidos com morbidade, mortalidade e custo associados substanciais ^1,2,3. Embora C. albicans continue sendo uma causa importante dessas infecções, espécies não albicans como C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis e C. auris estão sendo cada vez mais reconhecidas, especialmente em populações vulneráveis e com freqüente resistência aos antifúngicos disponíveis⁴. As espécies não-albicans apresentam elementos distintos de biologia e patogênese que estão sob investigação ativa.

A adesão é um primeiro passo importante na colonização e patogênese. A interferência nesta etapa pode, portanto, oferecer uma oportunidade para interromper a progressão da doença em um estágio inicial. Os estudos de adesão e invasão de Candida têm sido predominantemente focados em condições estáticas ^5,6. Esses estudos ajudaram a definir a estrutura e as funções das adesinas fúngicas na doença ^7,8,9. No entanto, a adesão na corrente sanguínea, nos tratos gastrointestinais (GI) e urinários e nos cateteres deve ocorrer sob condições de fluxo de cisalhamento de fluido, o que impõe restrições únicas à adesão. A adesão sob cisalhamento requer rápida formação de ligação de captura e a capacidade de suportar fortes forças de tração produzidas devido ao movimento de líquidos^10,11. A adesina de C. albicans, Als5 demonstrou facilitar a adesão dependente do cisalhamento^12,13. CpAls7 (CpALS4800) demonstrou anteriormente mediar a adesão de Cp às células epiteliais, e um nocaute mostrou diminuição da virulência em um modelo de infecção do trato urinário¹⁴. Demonstramos que o CpALS4800 promove a adesão sob condições de cisalhamento de fluido fisiologicamente relevantes¹⁵.

A colonização e a patogênese da Candida têm sido extensivamente estudadas nos modelos animais 16,17,18. Os modelos mais usados são infecções da mucosa murina e da corrente sanguínea, mas os modelos de invertebrados, como as larvas de Galleria, estão sendo cada vez mais usados devido ao baixo custo, rápido rendimento e simplicidade. Os modelos animais recapitulam muitas etapas do processo da doença humana tanto no patógeno quanto no hospedeiro, incluindo as respostas imunes adaptativas e inatas do hospedeiro, as interações da levedura com os tecidos e a microbiota e as respostas da levedura ao ambiente do hospedeiro. Em contraste, os ensaios de adesão in vitro permitem o foco especificamente na etapa de adesão e na manipulação experimental de variáveis como força de cisalhamento, condições de crescimento da levedura e adesão a substratos específicos.

Como o Cp é capaz de crescer tanto em humanos quanto em fontes ambientais, é provável que seja capaz de detectar e responder a diferentes ambientes. Em apoio a essa noção, vários isolados clínicos de Cp mostram baixa adesão sob cisalhamento de fluido quando cultivados no meio de crescimento de levedura padrão, levedura-peptona-dextrose (YPD), mas mudam para forte adesão quando cultivados por algumas horas a 37 ° C no meio de cultura de tecidos 199 (M199) ^{15 , 19} . Um protocolo detalhado é fornecido aqui para um ensaio de rendimento médio que permite a medição da adesão de várias amostras de levedura que funcionam em paralelo, sob condições definidas de crescimento, cisalhamento de fluido, temperatura e substrato. O ensaio foi projetado para maximizar a reprodutibilidade e permitir o uso de isolados clínicos de Cp, bem como cepas que foram manipuladas experimentalmente em laboratório. O ensaio descrito aqui, para adesão de Cp a um substrato de albumina de soro bovino (BSA), demonstra que os isolados clínicos exibem uma variedade de adesão, enquanto duas cepas de laboratório comumente usadas, CDC317 e CLIB214 mostram baixa adesão.

Candida spp. são classificados como organismos de Nível 2 de Biossegurança e devem ser manuseados com as devidas precauções.

1. Crescimento e indução de cepas clínicas

1. As cepas Streak Cp em 1% (m / v) de extrato de levedura, 2% (m / v) de peptona, 2% (m / v) de dextrose (YPD) e 2% (m / v) de ágar e crescem a 22 ° C.
   NOTA: As placas podem ser armazenadas na bancada do laboratório e reutilizadas na semana seguinte.
2. No dia anterior ao ensaio de adesão, transfira aproximadamente 6 colônias de cada cepa para um frasco Erlenmeyer (cônico) de 250 mL contendo 10 mL de meio YPD. Crescer durante a noite num agitador microbiológico regulado para 250 rpm a 37 °C.
   NOTA: Cp precisa crescer por 20-24 h para atingir a fase estacionária em cultura líquida a 37 °C.
3. Execute as etapas a seguir no dia do ensaio de adesão.
   1. Transferir 1 ml da cultura líquida do Erlenmeyer para um tubo de microcentrífugas.
   2. Centrifugue a cultura a uma velocidade máxima em uma microcentrífuga (16.000 x g) por 3 min. Ressuspenda o pellet em 1 mL de água estéril e repita esta etapa para um total de três lavagens.
   3. No final da última lavagem, ressuspenda o pellet em 1 mL de água estéril. Use pontas de pipeta de orifício largo de tamanhos de 1 mL e 200 μL para manusear suspensões de levedura durante esta e as etapas subsequentes.
      NOTA: Muitas cepas adesivas de Cp grudam nas laterais do frasco Erlenmeyer e requerem raspagem mecânica para serem removidas.
4. Conte as células de levedura usando um hemocitômetro ou dispositivo equivalente. Dilua a cultura de levedura para atingir uma concentração razoavelmente contável de 50-200 células de levedura. Use uma diluição de 500 vezes, colocando 20 μL em 10 mL de água.
   NOTA: A maioria das cepas de Cp cresce até 10^{8-10 9} células / mL em uma cultura de agitação noturna a 37 ° C.
5. Diluir a cultura de levedura com 2 mL de YPD ou Medium 199 (M199), a uma concentração final de 3 x 10⁶ células/mL em um tubo de microcentrífuga de 2 mL. Incubar em banho-maria a 37 °C durante 3 h.

2. Revestimento de canais microfluídicos

1. Prepare com antecedência uma solução a 2% (m/v) de BSA na solução salina balanceada de Hank contendo cálcio e magnésio (HBSS+). Para fazer isso, polvilhe suavemente 4 g de pó de BSA na superfície de 200 mL de HBSS+ e incube a 37 °C por 30-60 min sem perturbações para permitir que a proteína molhe e depois se dissolva. Esterilizar a solução por filtro e conservar a 4 °C.
2. Aqueça 2,5 ml desta solução a 37 °C durante pelo menos 1 h, mantendo-a estéril.
   NOTA: O aquecimento é necessário para reduzir a formação de bolhas na placa de microcanais.
3. Enquanto o BSA está aquecendo, mova o controlador microfluídico para a capa de cultura de tecidos, ligue o dispositivo e inicie o software.
4. Coloque a interface fluídica dentro do campo estéril e limpe suavemente a junta de silicone com um lenço de papel umedecido com álcool 70% (v/v). Evite o contato prolongado ou repetido do álcool com a placa de acrílico para evitar rachaduras ou rachaduras no plástico.
5. Seque ao ar a interface (voltada para cima) no exaustor com um sistema de fluxo de ar para remover todos os vestígios de álcool.
6. Adicione 100 μL da solução de BSA pré-aquecida como uma gota no recuo central de cada um dos canais de "saída" (Figura 1A) de uma placa de 48 poços e 24 microcanais.

Figura 1. Layout do ensaio microfluídico. (A) Um par de canais, mostrando o fluxo reverso de fluido da "saída" para a "entrada". Os campos lado a lado consecutivos capturados pelo microscópio são mostrados por linhas pontilhadas (1-10 para o canal superior e 11-20 para o inferior). (B) Configuração do software do controlador microfluídico para fluxo reverso durante o revestimento BSA (Etapa 2.10). Capturas de tela reproduzidas aqui com permissão do fabricante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Coloque a interface na parte superior da placa de microcanal, alinhando os quatro parafusos da interface com seus soquetes correspondentes na placa.
8. Aperte os parafusos usando os dedos enluvados. Esteja ciente de que a resistência ao aperto manual indica desalinhamento. Se isso ocorrer, levante ligeiramente a interface e recoloque-a e retome a fixação dos parafusos.
9. Quando os parafusos estiverem apertados com os dedos, use a chave de torque para apertar ainda mais a interface.
10. Usando a interface do software de microfluídica (Figura 1B), defina o Modo como Manual. Use a opção Fluido padrão (Water@19degC) para ambos os conjuntos de colunas e defina o cisalhamento para 1 dyn/cm^2.
    1. Ative as colunas "saída" (#2,4,6,8) para bombear o líquido para as "entradas". Execute em temperatura ambiente por 30 min.
11. Inspecione visualmente cada poço de "entrada" espiando pela parte inferior da placa de microcanal para garantir que uma gota da solução BSA tenha se acumulado em cada "entrada". Isso confirma que todos os 24 canais foram molhados e preenchidos com sucesso.
12. Desaperte a interface e encha cada poço ("entradas" e "saídas") com 250 μL de HBSS+ sem BSA para evitar o ressecamento dos canais e coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos.
    NOTA: É necessário um mínimo de 48 h para que as proteínas sejam adsorvidas uniformemente nas superfícies do canal da placa do microcanal. Após o revestimento de proteínas, as placas podem ser armazenadas por até duas semanas em um ambiente úmido (como uma incubadora de cultura de tecidos com 100% de umidade de saturação) antes do uso em ensaios de adesão. Por períodos mais longos, embrulhe as placas em filme plástico para evitar a evaporação.

3. Ensaio de adesão

1. Durante a incubação de leveduras em YPD e M199 (etapa 1.5), aspire os poços de entrada e saída da placa de microcanal revestida com BSA, sem perturbar o canal que sai do recuo central de cada poço (Figura 1A). Em vez disso, aspire da borda do poço. Adicione 1 mL de HBSS+ aos poços de "saída".
2. Conecte a interface microfluídica como acima (etapa 2.5). Use a configuração de fluido padrão Fluido em (Water@19degC) e Cisalhamento em 2 dyn/cm^2 à temperatura ambiente para lavar o canal e remover qualquer BSA não ligado. Lave por 2-3 h nesta vazão.
3. Remova a interface da placa de microcanal. Ligue a unidade de aquecimento de placas do dispositivo microfluídico e confirme se está regulada para 37 °C.
4. Aspire o meio de todos os poços na placa e adicione 0,5 mL de levedura induzida da etapa 1.5 a cada par de "saídas". Ressuspenda o fermento completamente invertendo os tubos de 2 mL 3-6 vezes e pipete suavemente para cima e para baixo imediatamente antes da adição aos poços. Deixe os poços de "entrada" vazios.
5. Fixe a interface fluídica à placa de microcanal como na etapa 2.5 acima. Use o software do dispositivo para definir Fluido para HBSS@37degC e Cisalhamento para 5 dyn/cm^2.
   1. Ative as colunas "saída" (#2,4,6,8) para bombear o líquido para as "entradas". Execute o aquecedor de placas a 37 ° C por 30 min, para permitir que o fermento adira ao canal revestido com BSA.
6. Durante esse tempo, prepare o tampão de lavagem. A 30 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco contendo cálcio e magnésio (DPBS+) adicione 5 μM de calcofluor, que é incluído para tornar a levedura fluorescente para sua detecção. Aquecer em banho a 37 °C.
7. Ao final da adesão de 30 minutos, pause o fluxo usando a interface do software sem alterar outras condições de fluxo. Desaperte a interface e aspire todos os poços ("entradas" e "saídas").
8. Adicione 1 mL de tampão de lavagem calcofluor às "saídas". Reconecte a interface fluídica e retome o fluxo usando o software por mais 10 min. Esta etapa foi projetada para lavar o fermento não aderente e fracamente ligado e, simultaneamente, manchar o fermento com fluorescência no canal.
9. Após 10 min, remova a interface de fluidos e substitua por uma tampa. Limpe suavemente a parte inferior da placa de microcanal com um pano sem fiapos e prossiga para a geração de imagens.

4. Imagem e quantificação

1. Coloque a placa de microcanal em um suporte de microscópio apropriado. Use uma lente objetiva de 20x, que permitirá um campo de visão tal que o canal preencha aproximadamente metade da altura da imagem. Localize a extremidade esquerda do canal 1 (na "entrada" 1). Ajuste o stage para que o canal fique posicionado como na Figura 1A, posição 1.
2. Adquira uma única imagem de campo claro do canal. Meça a área da área do canal em μm², usando a ferramenta de medição de retângulo para normalizar as medições de área durante a análise de dados (consulte Discussão).
3. Mudando para o canal fluorescente DAPI (excitação 395 nm, emissão 440/40 nm) ajuste o foco para a levedura aderente na superfície inferior do canal. Bloqueie o foco automático neste plano. Defina a intensidade de excitação de fluorescência para 1,5% e as condições de exposição da câmara (binning 2x2, exposição de 15 ms, 12 bits, ganho 4) para evitar a saturação do sensor de imagem.
4. Usando o estágio motorizado e a aquisição ND | A imagem XY no software do controlador do microscópio captura automaticamente uma série consecutiva de imagens não sobrepostas espaçadas em um campo de visão (666 μm) do primeiro par de canais (1/2).
   1. Colete 10 imagens da esquerda para a direita para o canal superior, desloque para baixo 666 μm e colete outras 10 da direita para a esquerda para o canal inferior (conforme mostrado esquematicamente na Figura 1A).
   2. Use a opção XY relativa , para que, uma vez definidas as posições da imagem, uma série semelhante possa ser acionada para cada par de canais, após o início do canal ser definido manualmente.
   3. Coletar imagens no canal DAPI (ND Acquisition | λ | DAPI).
5. Monitore as imagens para confirmar se o canal permanece dentro do campo de visão à medida que a platina motorizada move a placa.
   NOTA: Cada conjunto de 20 imagens de um par de canais será salvo automaticamente com um nome de arquivo consecutivo por aquisição ND.
6. Usar a função de passo automático (Navegação XYZ | Passo XY) para mover 25750 μm para baixo até "entrada" 3. Ajuste a posição do canal manualmente como na etapa 4.1. Capture o próximo conjunto de imagens (ND Acquisition) do par de canais 3/4.
7. Repita esse processo até que todos os 12 pares de canais tenham sido criados, com os resultados salvos em 12 arquivos. Siga a ordem dos canais do fabricante de 1 a 24.
8. Mesclar todos os 12 conjuntos de imagens fluorescentes em um único arquivo (Arquivo | Mesclar documentos ND). Confirme se a ordem dos arquivos corresponde à ordem em que os 12 conjuntos de imagens foram capturados.
9. Usar binário | Limite para separar a levedura do fundo com base em seu nível de fluorescência. Aplique o mesmo limite a toda a pilha de imagens.
   NOTA: Um limite baixo de intensidade de escala de cinza de 12 bits de 500 e um limite alto definido como o máximo de 4095 são típicos.
10. Medir a área limite (Medir | Realizar medição | Todos os quadros). Abra o relatório (Controles de análise | Resultados de medição automatizados) e verificar dados.
    NOTA: Isso gerará uma tabela de medições para 240 imagens (20 imagens de cada um dos 12 pares de canais) e a área limite para cada imagem é listada na coluna rotulada BinaryArea [μm²].
11. Exporte dados para um arquivo de texto delimitado por tabulação (Exportar).

Usando os métodos descritos na seção Protocolo, a adesão de 6 cepas de Cp foi comparada (Tabela 1)

Os dados resultantes do protocolo acima podem ser analisados usando um software de planilha padrão. Os dados são expressos como "índice de adesão", que é calculado da seguinte forma: O valor BinaryArea para cada conjunto de 10 imagens (representando a cobertura de levedura para um único canal) é somado entre as imagens e a média e o desvio padrão são calculados para a área somada de cada par de canais. A área do canal medida na etapa 4.2 representa a área máxima possível e...

Sem divulgações.

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Cátedra William e Mary Oh-William e Elsa Zopfi em Pediatria para Pesquisa Perinatal, o Kilguss Research Core e um Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de concessão P30GM114750.