Adhérence de Candida parapsilosis à l’albumine sérique bovine sous cisaillement fluide

L’adhésion est une première étape importante dans la colonisation et la pathogenèse de Candida. Ici, un test in vitro est décrit pour mesurer l’adhésion des isolats de C. parapsilosis aux protéines immobilisées sous cisaillement fluide. Un dispositif microfluidique multicanaux est utilisé pour comparer plusieurs échantillons en parallèle, suivi d’une quantification à l’aide de l’imagerie par fluorescence.

C. parapsilosis (Cp) est une cause émergente d’infections du sang dans certaines populations. Le clade des Candida , y compris Cp, développe de plus en plus de résistance à la première et à la deuxième ligne d’antifongiques. Cp est souvent isolé des mains et des surfaces cutanées, ainsi que du tractus gastro-intestinal. La colonisation par Candida prédispose les individus aux infections invasives du sang. Pour réussir à coloniser ou à envahir l’hôte, la levure doit être capable d’adhérer rapidement aux surfaces du corps afin d’éviter l’élimination par les mécanismes de défense de l’hôte. Nous décrivons ici une méthode pour mesurer l’adhésion de Cp à des protéines immobilisées sous cisaillement physiologique des fluides, en utilisant un test d’adhésion final dans un dispositif microfluidique multicanaux disponible dans le commerce. Cette méthode est optimisée pour améliorer la reproductibilité, minimiser la subjectivité et permettre la quantification fluorescente des isolats individuels. Nous démontrons également que certains isolats cliniques de Cp présentent une adhérence accrue lorsqu’ils sont cultivés dans des conditions imitant un hôte mammifère, alors qu’une souche de laboratoire fréquemment utilisée, CDC317, n’est pas adhésive sous cisaillement fluide.

Candida spp. sont des organismes commensales communs sur la peau humaine et les muqueuses qui peuvent entraîner des maladies invasives chez les personnes immunodéprimées avec une morbidité, une mortalité et un coût associés substantiels ^1,2,3. Bien que C. albicans reste une cause importante de ces infections, des espèces non albicans telles que C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis et C. auris sont de plus en plus reconnues, en particulier dans les populations vulnérables et avec une résistance fréquente aux médicaments antifongiques disponibles⁴. Les espèces non albicanes présentent des éléments distincts de biologie et de pathogenèse qui font l’objet d’études actives.

L’adhésion est une première étape importante dans la colonisation et la pathogenèse. L’interférence avec cette étape peut donc offrir une opportunité d’arrêter la progression de la maladie à un stade précoce. Les études sur l’adhésion et l’invasion de Candida ont été principalement axées sur les conditions statiques ^5,6. Ces études ont aidé à définir la structure et les fonctions des adhésines fongiques dans la maladie ^7,8,9. Cependant, l’adhérence dans la circulation sanguine, les voies gastro-intestinales (GI) et les voies urinaires, ainsi que dans les cathéters doit se produire dans des conditions d’écoulement par cisaillement des fluides qui imposent des contraintes uniques à l’adhésion. L’adhérence sous cisaillement nécessite une formation rapide d’une liaison d’accrochage et la capacité de résister à de fortes forces de traction produites par le mouvement des liquides^10,11. Il a été démontré que l’adhésine de C. albicans, Als5, facilite l’adhésion dépendante du cisaillement^12,13. Il a déjà été démontré que CpAls7 (CpALS4800) médie l’adhésion de Cp aux cellules épithéliales, et un knock-out a montré une virulence réduite dans un modèle d’infection des voies urinaires¹⁴. Nous avons démontré que le CpALS4800 favorise l’adhérence dans des conditions de cisaillement des fluides physiologiquement pertinentes¹⁵.

La colonisation et la pathogenèse de Candida ont été largement étudiées dans les modèles animaux 16,17,18. Les modèles les plus fréquemment utilisés sont les infections de la muqueuse murine et de la circulation sanguine, mais les modèles d’invertébrés, tels que les larves de Galleria, sont de plus en plus utilisés en raison de leur faible coût, de leur débit rapide et de leur simplicité. Les modèles animaux récapitulent de nombreuses étapes du processus de maladie humaine chez l’agent pathogène et l’hôte, y compris les réponses immunitaires adaptatives et innées de l’hôte, les interactions de la levure avec les tissus et le microbiote, et les réponses de la levure à l’environnement de l’hôte. En revanche, les essais d’adhésion in vitro permettent de se concentrer spécifiquement sur l’étape d’adhésion et sur la manipulation expérimentale de variables telles que la force de cisaillement, les conditions de croissance de la levure et l’adhésion à des substrats spécifiques.

Parce que Cp est capable de se développer à la fois chez les humains et les sources environnementales, il est probable qu’il soit capable de détecter et de répondre à différents environnements. À l’appui de cette notion, de multiples isolats cliniques de Cp montrent une faible adhérence sous cisaillement fluide lorsqu’ils sont cultivés dans le milieu de croissance standard de levure, levure-peptone-dextrose (YPD), mais passent à une forte adhérence lorsqu’ils sont cultivés pendant quelques heures à 37 °C dans le milieu de culture tissulaire 199 (M199)^15,19. Un protocole détaillé est fourni ici pour un test à débit moyen qui permet de mesurer l’adhésion de plusieurs échantillons de levure qui fonctionnent en parallèle, dans des conditions définies de croissance, de cisaillement des fluides, de température et de substrat. Le test a été conçu pour maximiser la reproductibilité et pour permettre l’utilisation d’isolats cliniques de Cp, ainsi que de souches qui ont été manipulées expérimentalement en laboratoire. L’essai décrit ici, pour l’adhésion de Cp à un substrat d’albumine sérique bovine (BSA), démontre que les isolats cliniques présentent une gamme d’adhérence, tandis que deux souches de laboratoire couramment utilisées, CDC317 et CLIB214 présentent une faible adhérence.

Les espèces du genre Candida sont classées comme organismes de niveau de biosécurité 2 et doivent être manipulées avec les précautions appropriées.

1. Croissance et induction de souches cliniques

1. Striez les souches de Cp sur 1 % (m/v) d’extrait de levure, 2 % (m/v) de peptone, 2 % (m/v) de dextrose (YPD), 2 % (m/v) de gélose et cultivez à 22 °C.
   REMARQUE : Les plaques peuvent être stockées sur la paillasse du laboratoire et réutilisées au cours de la semaine suivante.
2. La veille de l’essai d’adhésion, transférer environ 6 colonies de chaque souche dans un erlenmeyer (conique) de 250 mL contenant 10 mL de milieu YPD. Cultiver pendant la nuit dans un agitateur microbiologique réglé à 250 tr/min à 37 °C.
   REMARQUE : Le Cp doit croître pendant 20 à 24 h pour atteindre la phase stationnaire en culture liquide à 37 °C.
3. Effectuez les étapes suivantes le jour du test d’adhérence.
   1. Transvaser 1 mL de la culture liquide de l’erlenmeyer dans un tube à microfuge.
   2. Centrifuger la culture à vitesse maximale dans un microfuge (16 000 x g) pendant 3 min. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL d’eau stérile et répétez cette étape pour un total de trois lavages.
   3. À la fin du dernier lavage, remettre la pastille en suspension dans 1 mL d’eau stérile. Utilisez des pointes de pipette à large orifice de 1 mL et 200 μL pour manipuler les suspensions de levure pendant cette étape et les suivantes.
      REMARQUE : De nombreuses souches adhésives de Cp collent aux côtés de l’erlenmeyer et nécessitent un grattage mécanique pour être enlevées.
4. Comptez les cellules de levure à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un appareil équivalent. Diluez la culture de levure pour obtenir une concentration raisonnablement dénombrable de 50 à 200 cellules de levure. Utilisez une dilution de 500 fois, en mettant 20 μL dans 10 mL d’eau.
   REMARQUE : La plupart des souches de Cp atteignent 10,^8-10,⁹ cellules/mL dans une culture agitée pendant la nuit à 37 °C.
5. Diluer la culture de levure avec 2 mL de YPD ou Medium 199 (M199), à une concentration finale de 3 x 10⁶ cellules/mL dans un tube de microfuge de 2 mL. Incuber au bain-marie à 37 °C pendant 3 h.

2. Revêtement des canaux microfluidiques

1. Préparez à l’avance une solution à 2 % (m/v) de BSA dans une solution saline équilibrée de Hank’s contenant du calcium et du magnésium (HBSS+). Pour ce faire, saupoudrez doucement 4 g de poudre BSA sur la surface de 200 mL de HBSS+ et incubez à 37 °C pendant 30 à 60 minutes sans être dérangé pour permettre à la protéine de mouiller puis de se dissoudre. Filtrez-stérilisez la solution et conservez-la à 4 °C.
2. Réchauffez 2,5 ml de cette solution à 37 °C pendant au moins 1 h, en la maintenant stérile.
   REMARQUE : Le réchauffement est nécessaire pour réduire la formation de bulles dans la plaque à microcanaux.
3. Pendant que le BSA se réchauffe, déplacez le contrôleur microfluidique vers le capot de culture tissulaire, allumez l’appareil et démarrez le logiciel.
4. Placez l’interface fluidique dans le champ stérile et nettoyez délicatement le joint en silicone avec un papier de soie non pelucheux imbibé d’alcool à 70 % (v/v). Évitez tout contact prolongé ou répété de l’alcool avec la plaque acrylique pour éviter les fissures ou les fissures du plastique.
5. Faites sécher à l’air libre l’interface (vers le haut) dans la hotte avec un système de circulation d’air pour éliminer toute trace d’alcool.
6. Ajouter 100 μL de la solution de BSA préchauffée sous forme de gouttelette dans l’indentation centrale de chacun des canaux de « sortie » (figure 1A) d’une plaque à 48 puits à 24 microcanaux.

Graphique 1. Disposition du test de microfluidique. (A) Une paire de canaux, montrant l’écoulement inverse du fluide de la « sortie » à l'"entrée ». Les champs en mosaïque consécutifs capturés par le microscope sont représentés par des lignes pointillées (1-10 pour le canal supérieur et 11-20 pour le canal inférieur). (B) Configuration du logiciel de contrôle microfluidique pour l’écoulement inverse pendant le revêtement BSA (étape 2.10). Captures d’écran reproduites ici avec l’autorisation du fabricant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

7. Placez l’interface sur le dessus de la plaque à microcanaux, en alignant les quatre boulons de l’interface avec leurs douilles correspondantes dans la plaque.
8. Serrez les boulons à l’aide de doigts gantés. Sachez que la résistance au serrage à la main indique un désalignement. Si cela se produit, soulevez légèrement l’interface et réinstallez-la, puis reprenez la fixation des boulons.
9. Lorsque les boulons sont serrés à la main, utilisez la clé dynamométrique pour resserrer davantage l’interface.
10. À l’aide de l’interface du logiciel microfluidique (Figure 1B), réglez le mode sur Manuel. Utilisez l’option Fluide par défaut (Water@19degC) pour les deux ensembles de poteaux et définissez le cisaillement à 1 dyn/cm^2.
    1. Activez les colonnes « sortie » (#2,4,6,8) pour pomper le liquide vers les « entrées ». Faire fonctionner à température ambiante pendant 30 min.
11. Inspectez visuellement chaque puits d’entrée en regardant à travers le bas de la plaque à microcanaux pour vous assurer qu’une gouttelette de la solution BSA s’est accumulée dans chaque « entrée ». Cela confirme que les 24 canaux ont été mouillés et remplis avec succès.
12. Détachez l’interface et remplissez chaque puits (« entrées » et « sorties ») avec 250 μL de HBSS+ sans BSA pour éviter le dessèchement des canaux et placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire.
    REMARQUE : Un minimum de 48 h est nécessaire pour que les protéines soient adsorbées uniformément sur les surfaces des canaux de la plaque à microcanaux. Après l’enrobage des protéines, les plaques peuvent être stockées jusqu’à deux semaines dans un environnement humide (tel qu’un incubateur de culture tissulaire avec une humidité saturante à 100 %) avant d’être utilisées dans des tests d’adhésion. Pour de plus longues périodes, enveloppez les plaques dans un film plastique pour éviter l’évaporation.

3. Dosage de l’adhérence

1. Pendant l’incubation de levures dans YPD et M199 (étape 1.5), aspirez les puits d’entrée et de sortie de la plaque de microcanaux revêtue de BSA, sans perturber le canal qui part de l’indentation centrale de chaque puits (Figure 1A). Au lieu de cela, aspirez par le bord du puits. Ajouter 1 mL de HBSS+ dans les puits de sortie.
2. Fixez l’interface microfluidique comme ci-dessus (étape 2.5). Utilisez le réglage de fluide par défaut Fluid à (Water@19degC) et Shear à 2 dyn/cm^2 à température ambiante pour laver le canal et retirer tout BSA non lié. Laver pendant 2-3 h à ce débit.
3. Retirez l’interface de la plaque à microcanaux. Allumez l’unité de chauffage des plaques de l’appareil microfluidique et vérifiez qu’elle est réglée sur 37 °C.
4. Aspirez le milieu de tous les puits de la plaque et ajoutez 0,5 mL de levure induite de l’étape 1.5 à chaque paire de « sorties ». Remettez complètement la levure en suspension en inversant les tubes de 2 ml 3 à 6 fois, et pipetez doucement de haut en bas immédiatement avant l’ajout dans les puits. Laissez les puits d’entrée vides.
5. Fixez l’interface fluidique à la plaque à microcanaux comme à l’étape 2.5 ci-dessus. Utilisez le logiciel de l’appareil pour régler Fluid sur HBSS@37degC et Shear sur 5 dyn/cm^2.
   1. Activez les colonnes « sortie » (#2,4,6,8) pour pomper le liquide vers les « entrées ». Fonctionnement sur plaque chauffante à 37 °C pendant 30 min, pour permettre à la levure d’adhérer au canal revêtu de BSA.
6. Pendant ce temps, préparez le tampon de lavage. À 30 ml de solution saline tamponnée au phosphate contenant du calcium et du magnésium de Dulbecco (DPBS+), ajoutez 5 μM de calcofluor, qui est inclus pour rendre la levure fluorescente pour leur détection. Réchauffer dans un bain à 37 °C.
7. À la fin de l’adhérence de 30 minutes, mettez le flux en pause à l’aide de l’interface du logiciel sans modifier les autres conditions d’écoulement. Détachez l’interface et aspirez tous les puits (« entrées » et « sorties »).
8. Ajouter 1 mL de tampon de lavage au calcofluor dans les « sorties ». Reconnectez l’interface fluidique et reprenez le flux à l’aide du logiciel pendant 10 minutes supplémentaires. Cette étape est conçue pour éliminer les levures non adhérentes et faiblement liées, et colorer simultanément les levures par fluorescence dans le canal.
9. Au bout de 10 min, retirez l’interface fluidique et remplacez-la par un couvercle. Nettoyez délicatement le bas de la plaque à microcanaux avec une lingette non pelucheuse et procédez à l’imagerie.

4. Imagerie et quantification

1. Placez la plaque à microcanaux dans un support de platine de microscope approprié. Utilisez un objectif 20x, qui permettra un champ de vision tel que le canal remplisse environ la moitié de la hauteur de l’image. Localisez l’extrémité gauche du canal 1 (dans « entrée » 1). Ajustez la platine de manière à ce que le canal soit positionné comme sur la figure 1A, position 1.
2. Acquérez une seule image en fond clair de la chaîne. Mesurer l’aire de l’aire du canal en μm², à l’aide de l’outil de mesure rectangulaire afin de normaliser les mesures de surface lors de l’analyse des données (voir Discussion).
3. Le passage au canal fluorescent DAPI (excitation 395 nm, émission 440/40 nm) permet d’ajuster la mise au point sur la levure adhérente sur la surface inférieure du canal. Verrouillez l’autofocus à ce plan. Réglez l’intensité de l’excitation de fluorescence sur 1,5 % et les conditions d’exposition de l’appareil photo (binning 2x2, exposition 15 ms, 12 bits, gain 4) pour éviter la saturation du capteur d’image.
4. Utilisation de la platine motorisée et de l’acquisition ND | L’imagerie XY dans le logiciel de contrôle du microscope capture automatiquement une série consécutive d’images non superposées espacées d’un champ de vision (666 μm) de la première paire de canaux (1/2).
   1. Collecter 10 images de gauche à droite pour le canal supérieur, décaler de 666 μm vers le bas et collecter 10 autres images de droite à gauche pour le canal inférieur (comme le montre schématiquement la figure 1A).
   2. Utilisez l’option XY relatif , de sorte qu’une fois les positions d’image définies, une série similaire puisse être déclenchée pour chaque paire de couches, après que le début de la couche ait été défini manuellement.
   3. Collecter des images dans le canal DAPI (ND Acquisition | λ | DAPI).
5. Surveillez les images pour confirmer que le canal reste dans le champ de vision lorsque la platine motorisée déplace la plaque.
   REMARQUE : Chaque ensemble de 20 images d’une paire de canaux sera automatiquement enregistré avec un nom de fichier consécutif par acquisition ND.
6. Utiliser la fonction de pas automatique (XYZ Navigation | XY) pour descendre de 25750 μm jusqu’à « l’entrée » 3. Ajustez manuellement la position du canal comme à l’étape 4.1. Capturez la prochaine série d’images (acquisition ND) de la paire de canaux 3/4.
7. Répétez ce processus jusqu’à ce que les 12 paires de canaux aient été imagées, avec les résultats enregistrés dans 12 fichiers. Suivez l’ordre des canaux du fabricant de 1 à 24.
8. Fusionnez les 12 ensembles d’images fluorescentes en un seul fichier (Fichier | Fusionner les documents ND). Vérifiez que l’ordre des fichiers correspond à l’ordre dans lequel les 12 ensembles d’images ont été capturés.
9. Utiliser le binaire | Seuil pour séparer les levures de l’arrière-plan en fonction de leur niveau de fluorescence. Appliquez le même seuil à l’ensemble de la pile d’images.
   REMARQUE : Un seuil faible d’intensité en niveaux de gris de 12 bits de 500 et un seuil élevé défini sur le maximum de 4095 sont typiques.
10. Mesurer la surface de seuil (Mesurer | Effectuer des mesures | Tous les cadres). Ouvrez le rapport (Contrôles d’analyse | Résultats de mesure automatisés) et vérifier les données.
    REMARQUE : Cela générera un tableau de mesures pour 240 images (20 images de chacune des 12 paires de canaux), et la zone de seuil pour chaque image est répertoriée dans la colonne intitulée BinaryArea [μm²].
11. Exporter les données vers un fichier texte délimité par des tabulations (Exporter).

À l’aide des méthodes décrites dans la section Protocole, l’adhésion de 6 souches de Cp a été comparée (Tableau 1)

Les données résultant du protocole ci-dessus peuvent être analysées à l’aide d’un tableur standard. Les données sont exprimées sous forme d'« indice d’adhésion », qui est calculé comme suit : la valeur BinaryArea pour chaque ensemble de 10 images (représentant la couverture de levure pour un seul canal) est additionnée sur les images, et la moyenne et l’écart-type sont calculés pour l’aire additionnée de chaque paire de canaux. L’aire du canal mesurée à l’...

Aucune divulgation.

Ce travail a été soutenu par une subvention de la chaire William et Mary Oh-William et Elsa Zopfi en pédiatrie pour la recherche périnatale, le Kilguss Research Core et une bourse de développement institutionnel (IDeA) de l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health au titre de la subvention numéro P30GM114750.