Adhäsion von Candida parapsilosis an Rinderserumalbumin unter Flüssigkeitsscherung

Die Adhäsion ist ein wichtiger erster Schritt bei der Besiedlung und Pathogenese von Candida. In dieser Arbeit wird ein in vitro Assay beschrieben, um die Adhäsion von C. parapsilosis-Isolaten an immobilisierte Proteine unter Flüssigkeitsscherung zu messen. Ein Mehrkanal-Mikrofluidikgerät wird verwendet, um mehrere Proben parallel zu vergleichen, gefolgt von der Quantifizierung mittels Fluoreszenzbildgebung.

C. parapsilosis (Cp) ist eine neu auftretende Ursache für Blutbahninfektionen in bestimmten Bevölkerungsgruppen. Die Candida-Klade , zu der auch Cp gehört, entwickelt zunehmend Resistenzen gegen die erste und die zweite Linie von Antimykotika. Cp wird häufig aus Händen und Hautoberflächen sowie aus dem Magen-Darm-Trakt isoliert. Die Besiedlung durch Candida prädisponiert Individuen für invasive Blutbahninfektionen. Um den Wirt erfolgreich zu besiedeln oder in ihn einzudringen, muss die Hefe in der Lage sein, schnell an den Körperoberflächen zu haften, um eine Eliminierung durch die Abwehrmechanismen des Wirts zu verhindern. Hier beschreiben wir eine Methode zur Messung der Adhäsion von Cp an immobilisierte Proteine unter physiologischer Flüssigkeitsscherung unter Verwendung eines Endpunkt-Adhäsionsassays in einem kommerziell erhältlichen Mehrkanal-Mikrofluidikgerät. Diese Methode ist optimiert, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, die Subjektivität zu minimieren und die Fluoreszenzquantifizierung einzelner Isolate zu ermöglichen. Wir zeigen auch, dass einige klinische Isolate von Cp eine erhöhte Adhäsion zeigen, wenn sie unter Bedingungen gezüchtet werden, die einen Säugetierwirt nachahmen, während ein häufig verwendeter Laborstamm, CDC317, unter Flüssigkeitsscherung nicht adhäsiv ist.

Candida spp. sind häufige kommensale Organismen auf der menschlichen Haut und Schleimhäute, die bei immungeschwächten Menschen zu invasiven Erkrankungen mit erheblicher Morbidität, Mortalität und Kosten führen können ^1,2,3. Obwohl C. albicans nach wie vor eine wichtige Ursache für diese Infektionen ist, werden Nicht-Albians-Spezies wie C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis und C. auris zunehmend erkannt, insbesondere in gefährdeten Populationen und mit häufigen Resistenzen gegen verfügbare Antimykotika⁴. Nicht-Albians-Arten weisen unterschiedliche Elemente der Biologie und Pathogenese auf, die aktiv untersucht werden.

Die Adhäsion ist ein wichtiger erster Schritt bei der Besiedlung und Pathogenese. Ein Eingriff in diesen Schritt kann daher die Möglichkeit bieten, das Fortschreiten der Krankheit frühzeitig zu stoppen. Studien zur Adhäsion und Invasion von Candida konzentrierten sich hauptsächlich auf statische Bedingungen ^5,6. Diese Studien haben dazu beigetragen, die Struktur und Funktionen von Pilzadhäsinen bei Krankheiten^zu definieren ^7,8,9. Adhäsionen im Blutkreislauf, im Magen-Darm-Trakt (GI) und in den Harnwegen sowie in Kathetern müssen jedoch unter Bedingungen einer Flüssigkeitsscherströmung auftreten, die der Adhäsion besondere Einschränkungen auferlegt. Die Adhäsion unter Scherung erfordert eine schnelle Bildung von Fangverbindungen und die Fähigkeit, starken Zugkräften standzuhalten, die durch die Bewegung von Flüssigkeiten erzeugt^{werden 10,11}. Es wurde gezeigt, dass das C. albicans-Adhäsin Als5 die scherabhängige Adhäsion erleichtert^12,13. Es wurde bereits gezeigt, dass CpAls7 (CpALS4800) die Adhäsion von Cp an Epithelzellen vermittelt, und ein Knockout zeigte eine verminderte Virulenz in einem Harnwegsinfektionsmodell¹⁴. Wir konnten zeigen, dass CpALS4800 die Adhäsion unter physiologisch relevanten Fluidscherbedingungen fördert¹⁵.

Die Candida-Besiedlung und -Pathogenese wurden in den Tiermodellen^{ausführlich untersucht 16,17,18}. Die am häufigsten verwendeten Modelle sind murine Schleimhaut- und Blutbahninfektionen, aber auch wirbellose Modelle wie Galleria-Larven werden aufgrund der geringen Kosten, des schnellen Durchsatzes und der Einfachheit zunehmend verwendet. Tiermodelle rekapitulieren viele Schritte des menschlichen Krankheitsprozesses sowohl im Erreger als auch im Wirt, einschließlich der adaptiven und angeborenen Immunreaktionen des Wirts, der Wechselwirkungen von Hefe mit Geweben und der Mikrobiota sowie der Hefereaktionen auf die Wirtsumgebung. Im Gegensatz dazu ermöglichen In-vitro-Adhäsionsassays die Fokussierung speziell auf den Adhäsionsschritt und auf die experimentelle Manipulation von Variablen wie Scherkraft, Wachstumsbedingungen der Hefe und Adhäsion an bestimmten Substraten.

Da Cp in der Lage ist, sowohl beim Menschen als auch in der Umwelt zu wachsen, ist es wahrscheinlich in der Lage, verschiedene Umgebungen wahrzunehmen und darauf zu reagieren. Zur Unterstützung dieser Annahme zeigen mehrere klinische Isolate von Cp eine geringe Adhäsion unter Flüssigkeitsscherung, wenn sie in dem Standard-Hefewachstumsmedium Hefe-Pepton-Dextrose (YPD) gezüchtet werden, wechseln jedoch zu einer starken Adhäsion, wenn sie einige Stunden lang bei 37 °C im Gewebekulturmedium gezüchtet werden 199 (M199)^15,19. Hier wird ein detailliertes Protokoll für einen Assay mit mittlerem Durchsatz bereitgestellt, der die Messung der Adhäsion mehrerer Hefeproben ermöglicht, die parallel laufen, unter definierten Wachstumsbedingungen, Flüssigkeitsscherung, Temperatur und Substrat. Der Assay wurde entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu maximieren und die Verwendung klinischer Cp-Isolate sowie von Stämmen zu ermöglichen, die im Labor experimentell manipuliert wurden. Der hier beschriebene Assay für die Cp-Adhäsion an ein Rinderserumalbumin (BSA)-Substrat zeigt, dass klinische Isolate eine Reihe von Adhäsionen aufweisen, während zwei häufig verwendete Laborstämme, CDC317 und CLIB214, eine schlechte Adhäsion aufweisen.

Candida spp. sind als Organismen der Biosicherheitsstufe 2 eingestuft und sollten mit geeigneten Vorsichtsmaßnahmen gehandhabt werden.

1. Wachstum und Induktion klinischer Stämme

1. Streak Cp stämmt auf 1% (m/v) Hefeextrakt, 2% (m/v) Pepton, 2% (m/v) Dextrose (YPD) und 2% (m/v) Agarplatten und wächst bei 22 °C.
   HINWEIS: Die Platten können auf dem Labortisch gelagert und in der folgenden Woche wiederverwendet werden.
2. Am Tag vor dem Adhäsionstest werden etwa 6 Kolonien jedes Stammes in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben mit 10 ml YPD-Medium überführt. Anbau über Nacht in einem mikrobiologischen Shaker mit 250 U/min bei 37 °C.
   HINWEIS: Cp muss 20-24 Stunden wachsen, um die stationäre Phase in der Flüssigkultur bei 37 °C zu erreichen.
3. Führen Sie die folgenden Schritte am Tag des Adhäsionstests durch.
   1. 1 ml der Flüssigkultur aus dem Erlenmeyerkolben wird in ein Mikrofuge-Röhrchen überführt.
   2. Zentrifugieren Sie die Kultur bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrofuge (16.000 x g) für 3 min. Suspendieren Sie das Pellet in 1 ml sterilem Wasser und wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt drei Wäschen.
   3. Am Ende der letzten Wäsche resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml sterilem Wasser. Verwenden Sie Pipettenspitzen mit breiter Öffnung in den Größen 1 ml und 200 μl für die Handhabung von Hefesuspensionen während dieses und der nachfolgenden Schritte.
      HINWEIS: Viele Adhäsivstämme von Cp haften an den Seiten des Erlenmeyerkolbens und müssen mechanisch abgeschabt werden, um sie zu entfernen.
4. Zählen Sie Hefezellen mit einem Hämozytometer oder einem gleichwertigen Gerät. Verdünnen Sie die Hefekultur, um eine einigermaßen zählbare Konzentration von 50-200 Hefezellen zu erreichen. Verwenden Sie eine 500-fache Verdünnung, indem Sie 20 μl in 10 mL Wasser geben.
   HINWEIS: Die meisten Cp-Stämme wachsen in einer über Nacht bei 37 °C geschüttelten Kultur auf 10^{8-10 9} Zellen/ml.
5. Die Hefekultur wird mit 2 mL YPD oder Medium 199 (M199) in einer Endkonzentration von 3 x 10⁶ Zellen/mL in einem 2 mL Mikrofuge-Röhrchen verdünnt. In einem 37 °C warmen Wasserbad 3 h inkubieren.

2. Beschichtung von mikrofluidischen Kanälen

1. Bereiten Sie im Voraus eine 2%ige (m/v) BSA-Lösung in Hank's Balanced Salt Solution vor, die Calcium und Magnesium (HBSS+) enthält. Streuen Sie dazu vorsichtig 4 g BSA-Pulver auf die Oberfläche von 200 mL HBSS+ und inkubieren Sie bei 37 °C für 30-60 min ungestört, damit das Protein nass werden und sich dann auflösen kann. Die Lösung filtrieren und bei 4 °C lagern.
2. Erwärmen Sie 2,5 mL dieser Lösung mindestens 1 h lang auf 37 °C und halten Sie sie steril.
   HINWEIS: Eine Erwärmung ist notwendig, um die Blasenbildung in der Mikrokanalplatte zu reduzieren.
3. Während sich die BSA erwärmt, bewegen Sie den Mikrofluidik-Controller an die Gewebekulturhaube, schalten Sie das Gerät ein und starten Sie die Software.
4. Platzieren Sie die Fluidik-Schnittstelle im Sterilfeld und reinigen Sie die Silikondichtung vorsichtig mit einem fusselfreien Seidenpapier, das mit 70 % (v/v) Alkohol benetzt ist. Vermeiden Sie einen längeren oder wiederholten Kontakt von Alkohol mit der Acrylplatte, um Rissbildung oder Rissbildung des Kunststoffs zu vermeiden.
5. Trocknen Sie die Schnittstelle (mit der Vorderseite nach oben) in der Motorhaube an der Luft, mit einem Luftstromsystem, um alle Spuren von Alkohol zu entfernen.
6. Geben Sie 100 μl der vorgewärmten BSA-Lösung als Tröpfchen in die zentrale Vertiefung jedes "Auslass"-Kanals (Abbildung 1A) einer 48-Well-Platte mit 24 Mikrokanälen.

Abbildung 1. Layout des Mikrofluidik-Assays. (A) Ein Paar Kanäle, die den umgekehrten Flüssigkeitsfluss vom "Auslass" zum "Einlass" anzeigen. Die aufeinanderfolgenden gekachelten Felder, die vom Mikroskop erfasst werden, werden durch gestrichelte Linien dargestellt (1-10 für den oberen Kanal und 11-20 für den unteren). (B) Einrichtung einer Mikrofluidik-Controller-Software für den Rückfluss während der BSA-Beschichtung (Schritt 2.10). Screenshots werden hier mit Genehmigung des Herstellers wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

7. Platzieren Sie die Schnittstelle auf der Oberseite der Mikrokanalplatte, und richten Sie die vier Schrauben der Schnittstelle an den entsprechenden Buchsen in der Platte aus.
8. Ziehen Sie die Schrauben mit behandschuhten Fingern fest. Beachten Sie, dass der Widerstand gegen Festziehen von Hand auf eine Fehlausrichtung hinweist. Heben Sie in diesem Fall die Schnittstelle leicht an, setzen Sie sie wieder ein, und setzen Sie die Schrauben wieder ein.
9. Wenn die Schrauben fingerfest angezogen sind, verwenden Sie den Drehmomentschlüssel, um die Schnittstelle weiter festzuziehen.
10. Stellen Sie über die Mikrofluidik-Softwareschnittstelle (Abbildung 1B) den Modus auf Manuell ein. Verwenden Sie die Standardoption Fluid (Water@19degC) für beide Stützensätze, und stellen Sie die Schubkraft auf 1 dyn/cm^2 ein.
    1. Aktivieren Sie die "Auslass"-Säulen (#2,4,6,8), um Flüssigkeit in Richtung "Einlässe" zu pumpen. 30 min bei Raumtemperatur laufen lassen.
11. Überprüfen Sie jeden "Einlass" gut, indem Sie durch den Boden der Mikrokanalplatte blicken, um sicherzustellen, dass sich ein Tröpfchen der BSA-Lösung in jedem "Einlass" angesammelt hat. Dies bestätigt, dass alle 24 Kanäle erfolgreich benetzt und gefüllt wurden.
12. Lösen Sie die Schnittstelle und füllen Sie jede Vertiefung ("Einlässe" und "Auslässe") mit 250 μl HBSS+ ohne BSA auf, um ein Austrocknen der Kanäle zu verhindern, und stellen Sie die Platte in einen Gewebekultur-Inkubator.
    HINWEIS: Es sind mindestens 48 Stunden erforderlich, damit Proteine gleichmäßig an den Kanaloberflächen der Mikrokanalplatte adsorbiert werden. Nach der Proteinbeschichtung können die Platten bis zu zwei Wochen in einer feuchten Umgebung (z. B. in einem Gewebekultur-Inkubator mit 100 % gesättigter Luftfeuchtigkeit) gelagert werden, bevor sie in Adhäsionsassays verwendet werden. Wickeln Sie die Platten über längere Zeiträume in Plastikfolie ein, um eine Verdunstung zu verhindern.

3. Adhäsions-Assay

1. Während der Hefeinkubation in YPD und M199 (Schritt 1.5) aspirieren Sie die Einlass- und Auslasswellen der BSA-beschichteten Mikrokanalplatte, ohne den Kanal zu stören, der von der zentralen Vertiefung jeder Vertiefung verläuft (Abbildung 1A). Saugen Sie stattdessen vom Rand der Vertiefung an. Geben Sie 1 ml HBSS+ in die "Auslass"-Vertiefungen.
2. Bringen Sie die Mikrofluidik-Schnittstelle wie oben (Schritt 2.5) an. Verwenden Sie die Standardflüssigkeitseinstellung Flüssigkeit bei (Water@19degC) und Scherung bei 2 dyn/cm^2 bei Raumtemperatur, um den Kanal zu waschen und ungebundenes BSA zu entfernen. Bei dieser Durchflussmenge 2-3 h waschen.
3. Entfernen Sie die Schnittstelle von der Mikrokanalplatte. Schalten Sie die Plattenheizung des Mikrofluidikgeräts ein und vergewissern Sie sich, dass sie auf 37 °C eingestellt ist.
4. Aspirieren Sie das Medium aus allen Vertiefungen auf der Platte und fügen Sie 0,5 ml induzierte Hefe aus Schritt 1,5 zu jedem Paar "Auslässe" hinzu. Resuspendieren Sie die Hefe vollständig, indem Sie die 2-ml-Röhrchen 3-6 Mal umdrehen und unmittelbar vor der Zugabe in die Vertiefungen vorsichtig auf und ab pipettieren. Lassen Sie die "Einlass"-Vertiefungen leer.
5. Befestigen Sie die Fluidikschnittstelle an der Mikrokanalplatte wie in Schritt 2.5 oben. Verwenden Sie die Gerätesoftware, um Fluid auf HBSS@37degC und Shear auf 5 dyn/cm^2 einzustellen.
   1. Aktivieren Sie die "Auslass"-Säulen (#2,4,6,8), um Flüssigkeit in Richtung "Einlässe" zu pumpen. Auf der Plattenheizung 30 min bei 37 °C laufen lassen, damit die Hefe am BSA-beschichteten Kanal haften kann.
6. Bereiten Sie während dieser Zeit den Waschpuffer vor. Zu 30 ml der phosphatgepufferten Kochsalzlösung von Dulbecco, die Calcium und Magnesium (DPBS+) enthält, fügen Sie 5 μM Calcofluor hinzu, das enthalten ist, um die Hefe für ihren Nachweis fluoreszierend zu machen. In einem Bad bei 37 °C erwärmen.
7. Am Ende der 30-minütigen Adhäsion pausieren Sie den Durchfluss über die Softwareschnittstelle, ohne andere Durchflussbedingungen zu ändern. Lösen Sie die Schnittstelle und saugen Sie alle Vertiefungen ("Einlässe" und "Auslässe") an.
8. Geben Sie 1 ml Calcofluor-Waschpuffer in die "Auslässe". Bringen Sie die Fluidikschnittstelle wieder an und setzen Sie den Fluss mit der Software für weitere 10 Minuten fort. Dieser Schritt dient dazu, nicht anhaftende und lose gebundene Hefen wegzuspülen und gleichzeitig die Hefe im Kanal fluoreszierend zu färben.
9. Entfernen Sie nach 10 Minuten die Fluidikschnittstelle und ersetzen Sie sie durch einen Deckel. Reinigen Sie den Boden der Mikrokanalplatte vorsichtig mit einem fusselfreien Tuch und fahren Sie mit der Bildgebung fort.

4. Bildgebung und Quantifizierung

1. Platzieren Sie die Mikrokanalplatte in einer geeigneten Mikroskoptischhalterung. Verwenden Sie ein 20-fach-Objektiv, das ein Sichtfeld ermöglicht, so dass der Kanal etwa die Hälfte der Bildhöhe ausfüllt. Suchen Sie das linke Ende von Kanal 1 (in "Einlass" 1). Stellen Sie den Tisch so ein, dass der Kanal wie in Abbildung 1A, Position 1 positioniert ist.
2. Erfassen Sie ein einzelnes Hellfeldbild des Kanals. Messen Sie die Fläche der Kanalfläche in^{μm 2} mit dem Rechteck-Messwerkzeug, um die Flächenmessungen während der Datenanalyse zu normalisieren (siehe Diskussion).
3. Durch Umschalten auf den DAPI-Fluoreszenzkanal (Anregung 395 nm, Emission 440/40 nm) wird der Fokus auf anhaftende Hefe auf der Unterseite des Kanals eingestellt. Sperren Sie den Autofokus auf dieser Ebene. Stellen Sie die Intensität der Fluoreszenzanregung auf 1,5 % und die Belichtungsbedingungen der Kamera (Binning 2x2, 15 ms Belichtung, 12 Bit, Verstärkung 4) ein, um eine Sättigung des Bildsensors zu vermeiden.
4. Verwendung des motorisierten Tisches und der ND-Erfassung | Die XY-Bildgebung in der Mikroskop-Controller-Software erfasst automatisch eine aufeinanderfolgende Reihe von nicht überlappenden Bildern, die einen Sichtfeldabstand (666 μm) des ersten Kanalpaares (1/2) voneinander entfernt sind.
   1. Sammeln Sie 10 Bilder von links nach rechts für den oberen Kanal, verschieben Sie 666 μm nach unten und sammeln Sie weitere 10 Bilder von rechts nach links für den unteren Kanal (wie schematisch in Abbildung 1A dargestellt).
   2. Verwenden Sie die Option Relativer XY-Effekt , sodass nach dem Definieren der Bildpositionen für jedes Kanalpaar eine ähnliche Serie ausgelöst werden kann, nachdem der Start des Kanals manuell definiert wurde.
   3. Erfassen von Bildern im DAPI-Kanal (ND-Erfassung | λ | DAPI).
5. Überwachen Sie die Bilder, um sicherzustellen, dass der Kanal innerhalb des Sichtfelds bleibt, während der motorisierte Tisch die Platte bewegt.
   HINWEIS: Jeder Satz von 20 Bildern aus einem Kanalpaar wird bei der ND-Erfassung automatisch mit einem fortlaufenden Dateinamen gespeichert.
6. Verwenden Sie die Autostep-Funktion (XYZ Navigation | XY-Schritt), um 25750 μm nach unten zum "Einlass" 3 zu bewegen. Passen Sie die Kanalposition manuell an, wie in Schritt 4.1 beschrieben. Erfassen Sie den nächsten Satz von Bildern (ND Acquisition) des Kanalpaares 3/4.
7. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle 12 Kanalpaare abgebildet und die Ergebnisse in 12 Dateien gespeichert wurden. Befolgen Sie die Reihenfolge der Kanäle vom Hersteller von 1 bis 24.
8. Führen Sie alle 12 Sätze von Fluoreszenzbildern in einer einzigen Datei zusammen (Datei | ND-Belege zusammenführen). Vergewissern Sie sich, dass die Dateireihenfolge mit der Reihenfolge übereinstimmt, in der die 12 Bildsätze aufgenommen wurden.
9. Binärdatei verwenden | Schwellenwert zur Trennung der Hefe vom Hintergrund basierend auf ihrem Fluoreszenzgrad. Wenden Sie denselben Schwellenwert auf den gesamten Bilderstapel an.
   HINWEIS: Typisch ist ein niedriger Schwellenwert für die Graustufenintensität von 12 Bit von 500 und ein hoher Schwellenwert von maximal 4095.
10. Messen Sie den Schwellenwertbereich (Messen | Messung durchführen | Alle Frames). Öffnen Sie den Bericht (Steuerelemente für die Analyse | Automatisierte Messergebnisse) und überprüfen Sie die Daten.
    HINWEIS: Dadurch wird eine Messtabelle für 240 Bilder (20 Bilder aus jedem von 12 Kanalpaaren) erstellt, und der Schwellenwertbereich für jedes Bild wird in der Spalte mit der Bezeichnung BinaryArea [μm²] aufgeführt.
11. Exportieren Sie Daten in eine tabulatorgetrennte Textdatei (Exportieren).

Unter Verwendung der im Protokollabschnitt beschriebenen Methoden wurde die Adhäsion von 6 Cp-Stämmen verglichen (Tabelle 1)

Die Daten, die sich aus dem oben genannten Protokoll ergeben, können mit einer Standard-Tabellenkalkulationssoftware analysiert werden. Die Daten werden als "Adhäsionsindex" ausgedrückt, der wie folgt berechnet wird: Der BinaryArea-Wert für jeden Satz von 10 Bildern (der die Hefebedeckung für einen einzelnen Kanal darstellt) wird über die Bilder summiert, und der Mittelwert und die Standardabweichung werden für die summierte Fläche jedes Kanalpaares berechnet. Die in Schritt 4.2 ...

Keine Offenlegungen.

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der William and Mary Oh-William and Elsa Zopfi Professorship in Pediatrics for Perinatal Research, des Kilguss Research Core und einen Institutional Development Award (IDeA) des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer P30GM114750 unterstützt.