流体せん断下でのウシ血清アルブミンへの カンジダ・パラプシロス症 の接着

接着は、 カンジダ菌のコロニー形成と病因形成における重要な第一歩です。ここでは、C . parapsilosis 分離株の流体せん断下での固定化タンパク質への接着を測定するためのin vitroアッセイについて説明する。マルチチャンネルマイクロ流体デバイスを使用して、複数のサンプルを並行して比較し、続いて蛍光イメージングを使用して定量化します。

C. parapsilosis (Cp)は、特定の集団における血流感染の新たな原因です。Cpを含むカンジダ クレードは、抗真菌剤の第1および第2選択に対する耐性をますます発達させています。Cpは、手や皮膚の表面、および消化管から分離されることがよくあります。 カンジダ菌 によるコロニー形成は、個人を侵襲的な血流感染症にかかりやすくします。宿主のコロニー形成または侵入を成功させるためには、酵母は宿主防御メカニズムによる排除を防ぐために、体表面に迅速に付着できなければなりません。ここでは、市販のマルチチャンネルマイクロ流体デバイスのエンドポイント接着アッセイを使用して、生理流体せん断下での固定化タンパク質へのCpの接着を測定する方法について説明します。この分析法は、再現性の向上、主観性の最小化、および個々の分離株の蛍光定量を可能にするように最適化されています。また、Cpの一部の臨床分離株は、哺乳類の宿主を模倣した条件で増殖すると接着性が増加するのに対し、頻繁に使用される実験室株であるCDC317は、流体せん断下で非接着性であることも示しています。

カンジダ属は、ヒトの皮膚や粘膜によく見られる共生生物であり、免疫不全の人々の間で侵襲性疾患を引き起こす可能性があり、関連する罹患率、死亡率、およびコスト^1,2,3がかなり高くなります。C. albicansは依然としてこれらの感染の重要な原因ですが、C. parapsilosis、C. glabrata、C. krusei、C. tropicalis、C. aurisなどの非アルビカンス種は、特に脆弱な集団で、利用可能な抗^{真菌薬に対して}頻繁に耐性を持つことで、ますます認識されるようになっています4。非アルビカンス種は、活発な研究が進められている生物学と病因の明確な要素を示しています。

接着は、コロニー形成と病因形成の重要な第一歩です。したがって、このステップへの干渉は、病気の進行を早期に止める機会を提供する可能性があります。カンジダの付着と浸潤に関する研究は、主に静的な条件に焦点を当ててきました^5,6。これらの研究は、疾患^7,8,9における真菌性アドヘシンの構造と機能を定義するのに役立ちました。ただし、血流、胃腸(GI)管、尿路、およびカテーテルでの接着は、接着に独自の制約を課す流体せん断流の条件下で行う必要があります。せん断下での接着には、急速なキャッチボンドの形成と、液体^10,11の動きによって生じる強い引っ張り力に耐える能力が必要です。C. albicansは、Als5を接着し、せん断依存性の接着を促進することが示されています^12,13。CpAls7(CpALS4800)は、Cpの上皮細胞への接着を媒介することが以前に示されており、ノックアウトは尿路感染症モデル¹⁴で病原性の低下を示しました。我々は、CpALS4800が生理学的に関連性のある流体せん断条件下で接着を促進することを実証した¹⁵。

カンジダのコロニー形成と病因は、動物モデル16,17,18で広く研究されています。最も頻繁に使用されるモデルはマウスの粘膜および血流の感染症ですが、ガレリア幼虫などの無脊椎動物モデルは、低コスト、迅速なスループット、およびシンプルさのためにますます使用されています。動物モデルは、宿主の適応免疫応答と自然免疫応答、酵母と組織および微生物叢との相互作用、宿主環境に対する酵母の応答など、病原体と宿主の両方におけるヒトの疾患プロセスの多くのステップを再現しています。対照的に、in vitro接着アッセイでは、接着ステップに特化して、せん断力、酵母の増殖条件、特定の基質への接着などの変数の実験的操作に焦点を当てることができます。

Cpは、人間と環境源の両方で成長することができるため、さまざまな環境を感知して応答できる可能性があります。この考えを支持するために、Cpの複数の臨床分離株は、標準的な酵母増殖培地である酵母-ペプトン-デキストロース(YPD)で増殖すると、流体せん断下で低い接着性を示すが、組織培養培地199(M199)^15,19で37°Cで数時間増殖すると強い接着性に切り替わる。ここでは、成長、流体せん断、温度、および基質の定義された条件下で、並行して実行される複数の酵母サンプルの接着の測定を可能にするミディアムスループットアッセイの詳細なプロトコルを提供します。このアッセイは、再現性を最大化し、Cpの臨床分離株、および実験室で実験的に操作された株を使用できるように設計されています。ここで説明するアッセイは、ウシ血清アルブミン(BSA)基質へのCp接着について、臨床分離株がさまざまな接着を示すのに対し、一般的に使用される2つのラボ株、CDC317およびCLIB214は接着不良を示すことを示しています。

カンジダ 属菌はバイオセーフティーレベル2の生物に分類されており、適切な予防措置を講じて取り扱う必要があります。

1. 臨床株の増殖と誘導

1. 1%(m/v)酵母抽出物、2%(m/v)ペプトン、2%(m/v)デキストロース(YPD)2%(m/v)寒天プレート上でStreak Cpを菌株化し、22°Cで増殖します。
   注:プレートはラボベンチに保管し、次の週に再利用することができます。
2. 接着アッセイの前日に、各株の約6コロニーを、10 mLのYPD培地を含む250 mLの三角(円錐形)フラスコに移します。250 rpm、37°Cに設定された微量シェーカーで一晩増殖させます。
   注:Cpは、37°Cの液体培養で固定相に到達するために、20〜24時間成長する必要があります。
3. 接着アッセイ当日に以下の手順を行ってください。
   1. 3角フラスコから1 mLの液体培養液をマイクロチューブに移します。
   2. 培養物をマイクロフュージ(16,000 x g)で最高速度で3分間遠心分離します。ペレットを1 mLの滅菌水に再懸濁し、この手順を合計3回の洗浄で繰り返します。
   3. 最後の洗浄の終わりに、ペレットを1mLの滅菌水に再懸濁します。1 mLおよび200 μLサイズのワイドオリフィスピペットチップを使用して、このステップおよび後続のステップで酵母懸濁液を取り扱います。
      注:Cpの多くの付着力は、三角フラスコの側面に付着し、除去するために機械的な削り取りが必要です。
4. 血球計算盤または同等のデバイスを使用して酵母細胞をカウントします。酵母培養物を希釈して、50〜200個の酵母細胞の適度なカウント可能な濃度を達成します。500倍希釈し、20μLを10mLの水に入れます。
   注:ほとんどのCp株は、37°Cで一晩振とう培養すると、10^{8-10 9} 細胞/mLに増殖します。
5. 酵母培養物を2 mLのYPDまたは培地199(M199)で、最終濃度3 x 10⁶ 細胞/mLで2 mLのマイクロフュージチューブで希釈します。37°Cの水浴中で3時間インキュベートします。

2. マイクロ流体チャネルのコーティング

1. カルシウムとマグネシウムを含むハンク平衡塩溶液(HBSS+)にBSAの2%(m / v)溶液を事前に調製します。これを行うには、200 mLのHBSS+の表面に4 gのBSA粉末を静かに振りかけ、37°Cで30〜60分間邪魔されずにインキュベートして、タンパク質を湿らせてから溶解させます。溶液をフィルター滅菌し、4°Cで保存します。
2. この溶液2.5 mLを37°Cで少なくとも1時間温め、無菌状態に保ちます。
   注:マイクロチャネルプレート内の気泡形成を減らすには、加温が必要です。
3. BSAが温まっている間に、マイクロ流体コントローラーを組織培養フードに移動し、デバイスの電源を入れてソフトウェアを起動します。
4. 流体界面を無菌フィールド内に置き、70%(v / v)アルコールで濡らした糸くずの出ないティッシュペーパーでシリコンガスケットを優しく清掃します。プラスチックのひび割れやひび割れを防ぐために、アルコールをアクリル板に長時間または繰り返し接触させないでください。
5. フード内の界面を上向きにしてエアフローシステムで風乾し、アルコールの痕跡をすべて取り除きます。
6. 予熱したBSA溶液100 μLを、48ウェル、24マイクロチャネルプレートの各「アウトレット」チャネル(図1A)の中央くぼみに液滴として加えます。

図 1.マイクロ流体アッセイのレイアウト。 (A)「出口」から「入口」への逆流を示す一対のチャネル。顕微鏡で撮影された連続したタイル状の視野は、点線で示されています(上部チャネルは1〜10、下部チャネルは11〜20)。(B)BSAコーティング中の逆流用のマイクロ流体コントローラーソフトウェアのセットアップ(ステップ2.10)。スクリーンショットはメーカーの許可を得てここに転載しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

7. インターフェースをマイクロチャネルプレートの上部に配置し、インターフェースの4本のボルトをプレート内の対応するソケットに合わせます。
8. 手袋をはめた指でボルトを締めます。手で締める抵抗はズレを示していることに注意してください。これが発生した場合は、インターフェイスを少し持ち上げて取り付け直し、ボルトの固定を再開します。
9. ボルトが指で締められている場合は、トルクレンチを使用してインターフェースをさらに締めます。
10. マイクロ流体ソフトウェアインターフェース(図1B)を使用して、モードを 手動に設定します。両方の柱のセットにデフォルトの流体オプション(Water@19degC)を使用し、せん断を 1 dyn/cm^2に設定します。
    1. 「アウトレット」カラム(#2,4,6,8)をアクティブにして、液体を「インレット」に向けてポンプで送ります。室温で30分間 運転 します。
11. マイクロチャネルプレートの底部を覗き込んで、各「インレット」を目視で検査し、BSA溶液の液滴が各「インレット」に溜まっていることを確認します。これにより、24チャンネルすべてが正常に濡れて充填されたことが確認されます。
12. インターフェースを緩め、各ウェル(「インレット」および「アウトレット」)にBSAを含まないHBSS+250 μLを補充して、チャネルの乾燥を防ぎ、プレートを組織培養インキュベーターに入れます。
    注:タンパク質がマイクロチャネルプレートのチャネル表面に均一に吸着されるためには、最低48時間が必要です。タンパク質コーティング後、接着アッセイで使用する前に、プレートを湿度の高い環境(飽和湿度100%の組織培養インキュベーターなど)で最大2週間保存できます。長時間の場合は、蒸発を防ぐためにプレートをプラスチックフィルムで包みます。

3. 接着アッセイ

1. YPDおよびM199での酵母インキュベーション中(ステップ1.5)では、BSAコーティングされたマイクロチャネルプレートの入口と出口のウェルを吸引します。これは、各ウェルの中央のくぼみから伸びるチャネルを乱すことなく行います(図1A)。代わりに、井戸の端から吸引します。HBSS+を1 mLを「アウトレット」ウェルに加えます。
2. 上記のようにマイクロ流体インターフェースを取り付けます(手順2.5)。デフォルトの流体設定である「流体」(Water@19degC)と「せん断」(2 dyn/cm^2 ) を室温で使用して、チャネルを洗浄し、結合していない BSA を除去します。この流速で2〜3時間洗浄します。
3. マイクロチャネルプレートからインターフェースを取り外します。マイクロ流体デバイスのプレートヒーターユニットの電源を入れ、37°Cに設定されていることを確認します。
4. プレート上のすべてのウェルから培地を吸引し、ステップ 1.5 で誘導した 0.5 mL の酵母を「アウトレット」の各ペアに加えます。2mLチューブを3〜6回反転させて酵母を完全に再懸濁し、ウェルに添加する直前に静かにピペットで上下させます。「入口」ウェルは空のままにします。
5. 上記のステップ2.5のように、流体インターフェースをマイクロチャネルプレートに固定します。デバイス ソフトウェアを使用して、流体を HBSS@37degC に設定し、せん断を 5 dyn/cm^2 に設定します。
   1. 「アウトレット」カラム(#2,4,6,8)をアクティブにして、液体を「インレット」に向けてポンプで送ります。プレートヒーターを37°Cで30分間運転し、酵母をBSAコーティングチャネルに付着させます。
6. この間に、洗浄バッファーを調製します。カルシウムとマグネシウムを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS+)30 mLに、酵母を蛍光で検出するために含まれている5 μMのカルコフルオロを加えます。37°Cのお風呂で温めます。
7. 30分間の接着が終了したら、他のフロー条件を変更せずに、ソフトウェアインターフェースを使用してフローを 一時停止 します。インターフェースを緩め、すべてのウェル(「インレット」と「アウトレット」)を吸引します。
8. 1 mLのcalcofluor洗浄バッファーを「アウトレット」に加えます。流路系インターフェースを再度取り付け、ソフトウェアを使用してさらに 10 分間フローを再開します。このステップは、非接着性で緩く結合した酵母を洗い流すと同時に、チャネル内の酵母を蛍光染色するように設計されています。
9. 10分後、流路系インターフェースを取り外し、蓋と交換します。糸くずの出ないワイプでマイクロチャネルプレートの底をやさしく清掃し、イメージングに進みます。

4. イメージングと定量

1. マイクロチャンネルプレートを適切な顕微鏡ステージホルダーに入れます。20倍の対物レンズを使用すると、チャネルが画像の高さの約半分を占めるような視野が可能になります。チャネル 1 の左端 ("inlet" 1) を見つけます。チャネルが 図 1A の位置 1 のように配置されるようにステージを調整します。
2. チャネルの 1 つの明視野画像を取得します。データ解析中に面積測定値を正規化するために、長方形測定ツールを使用して、チャネル面積の面積を^{μm 2}で測定します(ディスカッションを参照)。
3. DAPI蛍光チャンネル(励起395 nm、発光440/40 nm)に切り替えると、チャンネルの底面の付着酵母に焦点が合います。この平面でオートフォーカスをロックします。蛍光励起強度を 1.5% に設定し、カメラの露出条件 (ビニング 2x2、15 ミリ秒露光、12 ビット、ゲイン 4) を設定して、イメージ センサーの飽和を回避します。
4. 電動ステージと NDアクイジションの使い方 |顕微鏡コントローラーソフトウェアのXYイメージング は、最初のチャンネルペア(1/2)の1つの視野(666μm)の間隔(666μm)で連続した一連の非重なり合う画像を自動的にキャプチャします。
   1. 上部チャネルで左から右に10個の画像を収集し、666μmシフトダウンして、下部チャネルで右から左にさらに10個収集します( 図1Aに概略的に示すように)。
   2. 「相対 XY」オプションを使用すると、画像の位置が定義されると、チャネルの開始を手動で定義した後で、各チャネルペアに対して同様のシリーズをトリガーできます。
   3. DAPIチャンネルで画像を収集(ND Acquisition | λ |DAPI) です。
5. 画像を監視して、電動ステージがプレートを移動するときにチャネルが視野内に留まることを確認します。
   注:チャンネルペアからの20枚の画像の各セットは、 ND取得によって連続したファイル名で自動的に保存されます。
6. オートステップ機能(XYZナビゲーション|XYステップ)で25750μmを「インレット」3まで下に移動します。手順4.1のように、チャネル位置を手動で微調整します。チャネルペア3/4の次の画像セット(ND取得)をキャプチャします。
7. このプロセスを繰り返して、12個のチャンネルペアがすべてイメージ化され、結果が12個のファイルに保存されます。メーカーの 1 から 24 までのチャネルの順序に従います。
8. 12セットの蛍光画像すべてを1つのファイルにマージします(ファイル|ND ドキュメントのマージ)。ファイルの順序が、12 セットの画像がキャプチャされた順序と一致していることを確認します。
9. バイナリを使用する |酵母を蛍光レベルに基づいて背景から分離するしきい値。画像のスタック全体に同じしきい値を適用します。
   注: 12 ビットのグレースケール強度の下限しきい値は 500 で、上限しきい値は最大 4095 に設定されたのが一般的です。
10. 閾値領域を計測します(Measure |測定を行う |All Frames)をクリックします。レポートを開きます (Analysis Controls |自動測定結果)とチェックデータ。
    注:これにより、240枚の画像(12のチャンネルペアのそれぞれから20枚の画像)の測定値のテーブルが生成され、各画像のしきい値領域が BinaryArea [μm²]というラベルの付いた列にリストされます。
11. データをタブ区切りのテキストファイルにエクスポートします(エクスポート)。

プロトコールのセクションで説明した方法を使用して、6つのCp株の接着性を比較しました(表1)

上記のプロトコルから得られたデータは、標準のスプレッドシートソフトウェアを使用して分析できます。データは「接着指数」として表され、次のように計算されます:10枚の画像の各セットのBinaryArea値(1つのチャネルの酵母カバレッジを表す)が画像全体で合計され、平均と標準偏差が各チャネルペアの合計面積に対して計算されます。ステップ4.2で測定されたチ?...

開示はありません。

この研究は、William and Mary Oh-William and Elsa Zopfi Professorship in Pediatrics for Perinatal Research、Kilguss Research Core、およびNational Institutes of HealthのNational Institute of General Medical SciencesからのInstitutional Development Award(IDeA)の助成金(P30GM114750)によって支援されました。