Adhesión de Candida parapsilosis a la albúmina sérica bovina bajo cizallamiento fluido

La adhesión es un primer paso importante en la colonización y patogénesis de Candida. Aquí, se describe un ensayo in vitro para medir la adhesión de aislados de C. parapsilosis a proteínas inmovilizadas bajo cizallamiento de fluidos. Se utiliza un dispositivo de microfluídica multicanal para comparar varias muestras en paralelo, seguido de la cuantificación mediante imágenes de fluorescencia.

C. parapsilosis (Cp) es una causa emergente de infecciones del torrente sanguíneo en ciertas poblaciones. El clado Candida , incluida la Cp, está desarrollando cada vez más resistencia a la primera y segunda línea de antifúngicos. La CPU se aísla con frecuencia de las manos y las superficies de la piel, así como del tracto gastrointestinal. La colonización por Candida predispone a las personas a infecciones invasivas del torrente sanguíneo. Para colonizar o invadir con éxito al huésped, la levadura debe ser capaz de adherirse rápidamente a las superficies del cuerpo para evitar la eliminación por los mecanismos de defensa del huésped. Aquí describimos un método para medir la adhesión de Cp a proteínas inmovilizadas bajo cizallamiento de fluido fisiológico, utilizando un ensayo de adhesión de punto final en un dispositivo microfluídico multicanal disponible comercialmente. Este método está optimizado para mejorar la reproducibilidad, minimizar la subjetividad y permitir la cuantificación fluorescente de aislados individuales. También demostramos que algunos aislados clínicos de Cp muestran una mayor adherencia cuando se cultivan en condiciones que imitan a un huésped mamífero, mientras que una cepa de laboratorio de uso frecuente, CDC317, no es adhesiva bajo cizallamiento de fluidos.

Candida spp. son organismos comensales comunes en la piel y las mucosas humanas que pueden conducir a enfermedades invasivas entre las personas inmunocomprometidas con una morbilidad, mortalidad y costo asociados sustanciales ^1,2,3. Aunque C. albicans sigue siendo una causa importante de estas infecciones, cada vez se reconocen más especies no albicans como C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis y C. auris, especialmente en poblaciones vulnerables y con resistencia frecuente a los fármacos antifúngicos disponibles⁴. Las especies no albicans presentan distintos elementos de biología y patogénesis que están bajo investigación activa.

La adhesión es un primer paso importante en la colonización y la patogénesis. Por lo tanto, la interferencia con este paso puede ofrecer una oportunidad para detener la progresión de la enfermedad en una etapa temprana. Los estudios de adhesión e invasión de Candida se han centrado principalmente en condiciones estáticas ^5,6. Estos estudios han ayudado a definir la estructura y funciones de las adhesinas fúngicas en la enfermedad ^7,8,9. Sin embargo, la adhesión en el torrente sanguíneo, los tractos gastrointestinal (GI) y los tractos urinarios, y en los catéteres debe ocurrir en condiciones de flujo de cizallamiento de fluido que impone limitaciones únicas a la adhesión. La adherencia bajo cizallamiento requiere una rápida formación de enlaces de captura y la capacidad de soportar fuertes fuerzas de tracción producidas por el movimiento de líquidos^10,11. Se ha demostrado que la adhesina de C. albicans, Als5, facilita la adhesión dependiente del cizallamiento^12,13. Se ha demostrado previamente que CpAls7 (CpALS4800) media la adhesión de Cp a las células epiteliales, y un knockout mostró una disminución de la virulencia en un modelo de infección del tracto urinario¹⁴. Demostramos que CpALS4800 promueve la adhesión en condiciones de cizallamiento de fluidos fisiológicamente relevantes¹⁵.

La colonización y patogenia de Candida ha sido ampliamente estudiada en modelos animales 16,17,18. Los modelos más utilizados son las infecciones murinas de la mucosa y del torrente sanguíneo, pero los modelos de invertebrados, como las larvas de Galleria, se utilizan cada vez más debido al bajo costo, el rápido rendimiento y la simplicidad. Los modelos animales recapitulan muchos pasos del proceso de enfermedad humana tanto en el patógeno como en el huésped, incluidas las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas del huésped, las interacciones de la levadura con los tejidos y la microbiota, y las respuestas de la levadura al entorno del huésped. Por el contrario, los ensayos de adhesión in vitro permiten centrarse específicamente en la etapa de adhesión y en la manipulación experimental de variables como la fuerza de cizallamiento, las condiciones de crecimiento de la levadura y la adhesión a sustratos específicos.

Debido a que el Cp es capaz de crecer tanto en los seres humanos como en las fuentes ambientales, es probable que sea capaz de detectar y responder a diferentes entornos. En apoyo de esta noción, múltiples aislados clínicos de Cp muestran una baja adherencia bajo cizallamiento del fluido cuando se cultivan en el medio de crecimiento de levadura estándar, levadura-peptona-dextrosa (YPD), pero cambian a una fuerte adhesión cuando se cultivan durante unas horas a 37 °C en el medio de cultivo de tejidos 199 (M199)^15,19. Aquí se proporciona un protocolo detallado para un ensayo de rendimiento medio que permite la medición de la adhesión de múltiples muestras de levadura que se ejecutan en paralelo, en condiciones definidas de crecimiento, cizallamiento del fluido, temperatura y sustrato. El ensayo ha sido diseñado para maximizar la reproducibilidad y permitir el uso de aislados clínicos de Cp, así como cepas que han sido manipuladas experimentalmente en el laboratorio. El ensayo descrito aquí, para la adhesión de Cp a un sustrato de albúmina sérica bovina (BSA), demuestra que los aislados clínicos exhiben un rango de adherencia, mientras que dos cepas de laboratorio comúnmente utilizadas, CDC317 y CLIB214 muestran una adherencia deficiente.

Las especies de Candida están clasificadas como organismos de nivel 2 de bioseguridad y deben manipularse tomando las precauciones adecuadas.

1. Crecimiento e inducción de cepas clínicas

1. Streak Cp se tensa en placas de agar al 1% (m/v) de extracto de levadura, 2% (m/v) de peptona, 2% (m/v) de dextrosa (YPD) y 2% (m/v) y crece a 22 °C.
   NOTA: Las placas pueden almacenarse en la mesa de laboratorio y reutilizarse durante la semana siguiente.
2. El día anterior al ensayo de adhesión, transfiera aproximadamente 6 colonias de cada cepa a un matraz Erlenmeyer (cónico) de 250 mL que contenga 10 mL de medio YPD. Cultivar durante la noche en un agitador microbiológico ajustado a 250 rpm a 37 °C.
   NOTA: El Cp necesita crecer durante 20-24 h para alcanzar la fase estacionaria en cultivo líquido a 37 °C.
3. Realice los siguientes pasos el día del ensayo de adhesión.
   1. Transfiera 1 mL del cultivo líquido del matraz Erlenmeyer a un tubo de microfuga.
   2. Centrifugar el cultivo a velocidad máxima en un microfuge (16.000 x g) durante 3 min. Vuelva a suspender el pellet en 1 ml de agua estéril y repita este paso durante un total de tres lavados.
   3. Al final del último lavado, vuelva a suspender el pellet en 1 mL de agua estéril. Utilice puntas de pipeta de orificio ancho de 1 ml y 200 μl para manipular suspensiones de levadura durante este paso y los siguientes.
      NOTA: Muchas cepas adhesivas de Cp se adhieren a los lados del matraz Erlenmeyer y requieren un raspado mecánico para eliminarlas.
4. Cuente las células de levadura con un hemocitómetro o un dispositivo equivalente. Diluya el cultivo de levadura para lograr una concentración razonablemente contable de 50-200 células de levadura. Utilice una dilución de 500 veces, poniendo 20 μL en 10 mL de agua.
   NOTA: La mayoría de las cepas de Cp crecen hasta 10^{8-10 9} células/mL en un cultivo agitado durante la noche a 37 °C.
5. Diluir el cultivo de levadura con 2 mL de YPD o Medio 199 (M199), a una concentración final de 3 x 10⁶ células/mL en un tubo de microfuga de 2 mL. Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 3 h.

2. Recubrimiento de canales microfluídicos

1. Prepare con anticipación una solución al 2% (m/v) de BSA en la solución salina equilibrada de Hank que contiene calcio y magnesio (HBSS+). Para ello, espolvoree suavemente 4 g de polvo de BSA sobre la superficie de 200 ml de HBSS+ e incube a 37 °C durante 30-60 minutos sin perturbaciones para permitir que la proteína se humedezca y luego se disuelva. Filtrar-esterilizar la solución y almacenar a 4 °C.
2. Calentar 2,5 mL de esta solución a 37 °C durante al menos 1 h, manteniéndola estéril.
   NOTA: El calentamiento es necesario para reducir la formación de burbujas en la placa de microcanal.
3. Mientras el BSA se calienta, mueva el controlador de microfluídica a la campana de cultivo de tejidos, encienda el dispositivo e inicie el software.
4. Coloque la interfaz fluídica dentro del campo estéril y limpie suavemente la junta de silicona con un papel de seda sin pelusa humedecido con alcohol al 70% (v/v). Evite el contacto prolongado o repetido del alcohol con la placa acrílica para evitar que el plástico se agriete o agriete.
5. Seque al aire la interfaz (hacia arriba) en el capó con un sistema de flujo de aire para eliminar todos los restos de alcohol.
6. Agregue 100 μL de la solución BSA precalentada como una gota en la hendidura central de cada uno de los canales de "salida" (Figura 1A) de una placa de 48 pocillos y 24 microcanales.

Figura 1. Diseño de ensayos de microfluídica. (A) Un par de canales, que muestran el flujo de fluido inverso desde la "salida" hasta la "entrada". Los campos consecutivos en mosaico capturados por el microscopio se muestran mediante líneas punteadas (1-10 para el canal superior y 11-20 para el inferior). (B) Configuración del software del controlador de microfluídica para el flujo inverso durante el recubrimiento BSA (Paso 2.10). Capturas de pantalla reproducidas aquí con permiso del fabricante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Coloque la interfaz en la parte superior de la placa de microcanal, alineando los cuatro pernos de la interfaz con sus casquillos correspondientes en la placa.
8. Apriete los pernos con los dedos enguantados. Tenga en cuenta que la resistencia al apriete manual indica una desalineación. Si esto ocurre, levante ligeramente la interfaz y vuelva a colocarla, y reanude la fijación de los pernos.
9. Cuando los pernos estén apretados con los dedos, use la llave dinamométrica para apretar aún más la interfaz.
10. Usando la interfaz del software de microfluídica (Figura 1B), establezca el Modo en Manual. Utilice la opción predeterminada Fluido (Water@19degC) para ambos conjuntos de columnas y establezca el cortante en 1 dyn/cm^2.
    1. Active las columnas de "salida" (# 2,4,6,8) para bombear líquido hacia las "entradas". Deje funcionar a temperatura ambiente durante 30 min.
11. Inspeccione visualmente cada pocillo de "entrada" mirando a través de la parte inferior de la placa de microcanal para asegurarse de que una gota de la solución BSA se haya acumulado en cada "entrada". Esto confirma que los 24 canales se humedecieron y llenaron con éxito.
12. Afloje la interfaz y rellene cada pocillo ("entradas" y "salidas") con 250 μL de HBSS+ sin BSA para evitar que se sequen los canales y coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos.
    NOTA: Se requiere un mínimo de 48 h para que las proteínas se adsorban uniformemente a las superficies de los canales de la placa de microcanales. Después del recubrimiento de proteínas, las placas pueden almacenarse hasta dos semanas en un ambiente húmedo (como una incubadora de cultivo de tejidos con una humedad saturante del 100%) antes de su uso en ensayos de adhesión. Durante períodos más largos, envuelva las placas en una película de plástico para evitar la evaporación.

3. Ensayo de adherencia

1. Durante la incubación de levaduras en YPD y M199 (paso 1.5), aspire los pocillos de entrada y salida de la placa de microcanal recubierta con BSA, sin alterar el canal que va desde la hendidura central de cada pocillo (Figura 1A). En su lugar, aspire desde el borde del pozo. Agregue 1 mL de HBSS+ a los pocillos de "salida".
2. Conecte la interfaz de microfluídica como se indicó anteriormente (paso 2.5). Utilice la configuración de fluido predeterminada Fluido a (Water@19degC) y Cizallamiento a 2 dyn/cm^2 a temperatura ambiente para lavar el canal y eliminar cualquier BSA no unido. Lavar durante 2-3 h a este caudal.
3. Retire la interfaz de la placa de microcanal. Encienda la unidad de calentamiento de placas del dispositivo de microfluídica y confirme que esté configurada a 37 °C.
4. Aspire el medio de todos los pocillos de la placa y añada 0,5 mL de levadura inducida del paso 1,5 a cada par de "salidas". Vuelva a suspender la levadura por completo invirtiendo los tubos de 2 ml de 3 a 6 veces, y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo inmediatamente antes de la adición a los pocillos. Deje vacíos los pozos de "entrada".
5. Fije la interfaz de fluidos a la placa de microcanales como en el paso 2.5 anterior. Utilice el software del dispositivo para establecer el fluido en HBSS@37degC y el corte en 5 dyn/cm^2.
   1. Active las columnas de "salida" (# 2,4,6,8) para bombear líquido hacia las "entradas". Enciéndalo en el calentador de placas a 37 °C durante 30 minutos, para permitir que la levadura se adhiera al canal recubierto de BSA.
6. Durante este tiempo, prepare el tampón de lavado. A los 30 mL de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contiene calcio y magnesio (DPBS+) se añaden 5 μM de calcofluor, que se incluye para hacer que la levadura sea fluorescente para su detección. Calentar en un baño a 37 °C.
7. Al final de los 30 minutos de adhesión, detenga el flujo utilizando la interfaz del software sin alterar otras condiciones de flujo. Desenganche la interfaz y aspire todos los pozos ("entradas" y "salidas").
8. Agregue 1 mL de tampón de lavado de calcofluor a las "salidas". Vuelva a conectar la interfaz de fluidos y reanude el flujo usando el software durante otros 10 minutos. Este paso está diseñado para lavar la levadura no adherente y poco unida, y al mismo tiempo teñir la levadura con fluorescencia en el canal.
9. Después de 10 minutos, retire la interfaz de fluidos y reemplácela con una tapa. Limpie suavemente la parte inferior de la placa de microcanal con una toallita sin pelusa y proceda a la toma de imágenes.

4. Obtención de imágenes y cuantificación

1. Coloque la placa de microcanal en un soporte de platina de microscopio adecuado. Utilice una lente de objetivo de 20x, que permitirá un campo de visión tal que el canal llene aproximadamente la mitad de la altura de la imagen. Ubique el extremo izquierdo del canal 1 (en la "entrada" 1). Ajuste la etapa para que el canal se coloque como en la Figura 1A, posición 1.
2. Adquiera una sola imagen de campo claro del canal. Mida el área del área del canal en μm², utilizando la herramienta de medición rectangular para normalizar las mediciones de área durante el análisis de datos (consulte la Discusión).
3. Al cambiar al canal fluorescente DAPI (excitación 395 nm, emisión 440/40 nm) se ajusta el enfoque a la levadura adherente en la superficie inferior del canal. Bloquea el enfoque automático en este plano. Ajuste la intensidad de excitación de fluorescencia al 1,5 % y las condiciones de exposición de la cámara (agrupación 2x2, exposición de 15 ms, 12 bits, ganancia 4) para evitar la saturación del sensor de imagen.
4. Uso de la platina motorizada y ND Adquisición | XY Imaging en el software del controlador del microscopio, capture automáticamente una serie consecutiva de imágenes no superpuestas espaciadas por un campo de visión (666 μm) del primer par de canales (1/2).
   1. Recoja 10 imágenes de izquierda a derecha para el canal superior, desplácese hacia abajo 666 μm y recoja otras 10 de derecha a izquierda para el canal inferior (como se muestra esquemáticamente en la Figura 1A).
   2. Utilice la opción XY relativo , de modo que una vez definidas las posiciones de la imagen, se pueda activar una serie similar para cada par de canales, después de que se defina manualmente el inicio del canal.
   3. Recopilación de imágenes en el canal DAPI (Adquisición ND | λ | DAPI).
5. Monitoree las imágenes para confirmar que el canal permanece dentro del campo de visión a medida que la platina motorizada mueve la placa.
   NOTA: Cada conjunto de 20 imágenes de un par de canales se guardará automáticamente con un nombre de archivo consecutivo mediante la adquisición de ND.
6. Utilice la función de paso automático (XYZ Navigation | Paso XY) para mover 25750 μm hacia abajo hasta la "entrada" 3. Ajuste la posición del canal manualmente como en el paso 4.1. Capture el siguiente conjunto de imágenes (adquisición ND) del par de canales 3/4.
7. Repita este proceso, hasta que se hayan creado imágenes de los 12 pares de canales, con los resultados guardados en 12 archivos. Siga el pedido del fabricante de los canales del 1 al 24.
8. Combine los 12 conjuntos de imágenes fluorescentes en un solo archivo (Archivo | Fusionar documentos ND). Confirme que el orden de los archivos coincida con el orden en el que se capturaron los 12 conjuntos de imágenes.
9. Usar binario | Umbral para separar las levaduras del fondo en función de su nivel de fluorescencia. Aplique el mismo umbral a toda la pila de imágenes.
   NOTA: Es típico un umbral bajo de intensidad de grises de 12 bits de 500 y un umbral alto establecido en el máximo de 4095.
10. Mida el área del umbral (Medir | Realizar medición | Todos los marcos). Abra el informe (Controles de análisis | Resultados de medición automatizados) y datos de comprobación.
    NOTA: Esto generará una tabla de medidas para 240 imágenes (20 imágenes de cada uno de los 12 pares de canales), y el área de umbral para cada imagen se muestra en la columna etiquetada como BinaryArea [μm²].
11. Exportar datos a un archivo de texto delimitado por tabuladores (Exportar).

Utilizando los métodos descritos en la sección de Protocolo, se comparó la adherencia de 6 cepas de Cp (Tabla 1)

Los datos resultantes del protocolo anterior se pueden analizar utilizando un software de hoja de cálculo estándar. Los datos se expresan como "índice de adhesión", que se calcula de la siguiente manera: el valor de BinaryArea para cada conjunto de 10 imágenes (que representa la cobertura de levadura para un solo canal) se suma entre las imágenes, y la media y la desviación estándar se calculan para el área sumada de cada par de canales. El área del canal medida en el paso 4.2 ...

Sin divulgaciones.

Este trabajo fue apoyado por una beca de la Cátedra William and Mary Oh-William y Elsa Zopfi en Pediatría para la Investigación Perinatal, el Núcleo de Investigación Kilguss, y un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo la subvención número P30GM114750.