Candida parapsilosis'in Sıvı Kesme Altında Sığır Serum Albüminine Yapışması

Adezyon Candida için kolonizasyon ve patogenezde önemli bir ilk adımdır. Burada, C. parapsilosis izolatlarının sıvı kesme altında hareketsiz proteinlere yapışmasını ölçmek için bir in vitro test tarif edilmiştir. Birden fazla numuneyi paralel olarak karşılaştırmak için çok kanallı bir mikroakışkan cihaz kullanılır, ardından floresan görüntüleme kullanılarak miktar tayini yapılır.

C. parapsilosis (Cp), bazı popülasyonlarda kan dolaşımı enfeksiyonlarının yeni ortaya çıkan bir nedenidir. Cp de dahil olmak üzere Candida sınıfı, birinci ve ikinci antifungal hattına karşı giderek daha fazla direnç geliştirmektedir. Cp sıklıkla ellerden ve cilt yüzeylerinden ve ayrıca GI yolundan izole edilir. Candida tarafından kolonizasyon, bireyleri invaziv kan dolaşımı enfeksiyonlarına yatkın hale getirir. Konakçıyı başarılı bir şekilde kolonileştirmek veya istila etmek için maya, konak savunma mekanizmaları tarafından elimine edilmesini önlemek için vücut yüzeylerine hızla yapışabilmelidir. Burada, ticari olarak temin edilebilen çok kanallı bir mikroakışkan cihazda bir uç nokta yapışma testi kullanarak, fizyolojik sıvı kesme altında Cp'nin hareketsiz hale getirilmiş proteinlere yapışmasını ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tekrarlanabilirliği iyileştirmek, öznelliği en aza indirmek ve tek tek izolatların floresan miktar tayinine izin vermek için optimize edilmiştir. Ayrıca, Cp'nin bazı klinik izolatlarının, bir memeli konakçıyı taklit eden koşullarda yetiştirildiğinde artan yapışma gösterdiğini, buna karşın sık kullanılan bir laboratuvar suşu olan CDC317'nin sıvı kesme altında yapışkan olmadığını gösterdik.

Candida spp. insan derisi ve mukozasında yaygın olarak görülen kommensal organizmalardır ve immün sistemi baskılanmış kişiler arasında invaziv hastalıklara yol açabilir ve önemli morbidite, mortalite ve maliyet ^1,2,3 ile ilişkilidir. C. albicans bu enfeksiyonların önemli bir nedeni olmaya devam etse de, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis ve C. auris gibi albicans olmayan türler, özellikle hassas popülasyonlarda ve mevcut antifungal ilaçlara sık direnç göstererek giderek daha fazla tanınmaktadır⁴. Albicans olmayan türler, aktif olarak araştırılmakta olan biyoloji ve patogenezin farklı unsurlarını sunar.

Adezyon kolonizasyon ve patogenezde önemli bir ilk adımdır. Bu nedenle, bu adıma müdahale, hastalığın ilerlemesini erken bir aşamada durdurmak için bir fırsat sunabilir. Candida adezyonu ve invazyonu ile ilgili çalışmalar ağırlıklı olarak statik koşullara odaklanmıştır ^5,6. Bu çalışmalar, hastalık ^7,8,9'daki mantar adezinlerinin yapısını ve işlevlerini tanımlamaya yardımcı olmuştur. Bununla birlikte, kan dolaşımında, gastrointestinal (GI) yollarda ve idrar yollarında ve kateterlerde yapışma, yapışma üzerine benzersiz kısıtlamalar getiren sıvı kesme akışı koşulları altında meydana gelmelidir. Kesme altında yapışma, hızlı yakalama bağı oluşumu ve sıvıların hareketi nedeniyle oluşan güçlü çekme kuvvetlerine dayanma kabiliyeti gerektirir^10,11. C. albicans adhezin, Als5'in kaymaya bağlı yapışmayı kolaylaştırdığı gösterilmiştir^12,13. CpAls7'nin (CpALS4800) daha önce Cp'nin epitel hücrelerine yapışmasına aracılık ettiği gösterilmiştir ve bir nakavt, idrar yolu enfeksiyonu modeli^14'te virülansın azaldığını göstermiştir. CpALS4800'ün fizyolojik olarak ilgili sıvı kesme koşulları^{altında yapışmayı} desteklediğini gösterdik 15.

Candida kolonizasyonu ve patogenezi hayvan modellerinde kapsamlı bir şekilde incelenmiştir 16,17,18. En sık kullanılan modeller murin mukozaları ve kan dolaşımı enfeksiyonlarıdır, ancak Galleria larvaları gibi omurgasız modeller, düşük maliyet, hızlı verim ve basitlik nedeniyle giderek daha fazla kullanılmaktadır. Hayvan modelleri, konakçı adaptif ve doğuştan gelen bağışıklık tepkileri, mayanın dokular ve mikrobiyota ile etkileşimleri ve konakçı ortama maya tepkileri dahil olmak üzere hem patojen hem de konakçıda insan hastalık sürecinin birçok adımını özetler. Buna karşılık, in vitro yapışma deneyleri, özellikle yapışma adımına ve kesme kuvveti, mayanın büyüme koşulları ve belirli substratlara yapışma gibi değişkenlerin deneysel manipülasyonuna odaklanmaya izin verir.

Cp hem insanlarda hem de çevresel kaynaklarda büyüme yeteneğine sahip olduğundan, farklı ortamları algılama ve bunlara yanıt verme yeteneğine sahip olması muhtemeldir. Bu görüşü desteklemek için, Cp'nin çoklu klinik izolatları, standart maya büyüme ortamı olan maya-pepton-dekstroz (YPD) içinde büyütüldüğünde sıvı kesme altında düşük yapışma gösterir, ancak doku kültürü ortamında 37 ° C'de birkaç saat büyütüldüğünde güçlü yapışmaya geçer 199 (M199) ^15,19. Burada, tanımlanmış büyüme, sıvı kesme, sıcaklık ve substrat koşulları altında paralel olarak çalışan birden fazla maya numunesinin yapışmasının ölçülmesine izin veren bir orta verim testi için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Tahlil, tekrarlanabilirliği en üst düzeye çıkarmak ve Cp'nin klinik izolatlarının yanı sıra laboratuvarda deneysel olarak manipüle edilmiş suşların kullanımına izin vermek için tasarlanmıştır. Burada tarif edildiği gibi, bir sığır serum albümini (BSA) substratına Cp yapışması için yapılan tahlil, klinik izolatların bir dizi yapışma sergilediğini, buna karşın yaygın olarak kullanılan iki laboratuvar suşunun, CDC317 ve CLIB214'nin zayıf yapışma gösterdiğini göstermektedir.

Candida spp. Biyogüvenlik Seviye 2 organizmalar olarak sınıflandırılır ve uygun önlemler kullanılarak ele alınmalıdır.

1. Klinik suşların büyümesi ve indüksiyonu

1. %1 (m/h) maya ekstraktı, %2 (m/h) pepton, %2 (m/h) dekstroz (YPD) %2 (m/h) agar plakaları üzerinde çizgi Cp suşları ve 22 °C'de büyür.
   NOT: Plakalar laboratuvar tezgahında saklanabilir ve bir sonraki hafta boyunca yeniden kullanılabilir.
2. Yapışma testinden bir gün önce, her suşun yaklaşık 6 kolonunu 10 mL YPD ortamı içeren 250 mL Erlenmeyer (konik) bir şişeye aktarın. 37 °C'de 250 rpm'ye ayarlanmış bir mikrobiyolojik çalkalayıcıda gece boyunca büyütün.
   NOT: Cp'nin 37 ° C'de sıvı kültürde sabit faza ulaşması için 20-24 saat büyümesi gerekir.
3. Yapışma testinin yapıldığı gün aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
   1. 1 mL sıvı kültürü Erlenmeyer şişesinden bir mikrofüj tüpüne aktarın.
   2. Kültürü 3 dakika boyunca bir mikrofüjde (16.000 x g) maksimum hızda santrifüjleyin. Peleti 1 mL steril suda tekrar süspanse edin ve bu adımı toplam üç yıkama için tekrarlayın.
   3. Son yıkamanın sonunda, peleti 1 mL steril suda tekrar süspanse edin. Bu ve sonraki adımlar sırasında maya süspansiyonlarını işlemek için 1 mL ve 200 μL boyutlarında geniş delikli pipet uçları kullanın.
      NOT: Birçok yapışkan Cp suşu, Erlenmeyer şişesinin kenarlarına yapışır ve çıkarılması için mekanik kazıma gerektirir.
4. Bir hemositometre veya eşdeğer bir cihaz kullanarak maya hücrelerini sayın. 50-200 maya hücresinin makul bir şekilde sayılabilir bir konsantrasyonunu elde etmek için maya kültürünü seyreltin. 10 mL suya 20 μL koyarak 500 kat seyreltme kullanın.
   NOT: Çoğu Cp suşu, 37 ° C'de gece boyunca çalkalama kültüründe 10^{8-10 9} hücre / mL'ye kadar büyür.
5. Maya kültürünü, 2 mL'lik bir mikrofüj tüpünde 3 x 10⁶ hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyonda 2 mL YPD veya Orta 199 (M199) ile seyreltin. 37 ° C'lik bir su banyosunda 3 saat inkübe edin.

2. Mikroakışkan kanalların kaplanması

1. Kalsiyum ve magnezyum (HBSS +) içeren Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinde önceden% 2 (m / h) BSA çözeltisi hazırlayın. Bunu yapmak için, 200 mL HBSS+ yüzeyine 4 g BSA tozunu hafifçe serpin ve proteinin ıslanmasını ve ardından çözülmesini sağlamak için 37 ° C'de 30-60 dakika boyunca inkübe edin. Solüsyonu filtreyle sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
2. Bu çözeltinin 2,5 mL'sini en az 1 saat boyunca 37 °C'ye ısıtın ve steril tutun.
   NOT: Mikrokanal plakasındaki kabarcık oluşumunu azaltmak için ısıtma gereklidir.
3. BSA ısınırken, mikroakışkan denetleyiciyi doku kültürü başlığına taşıyın, cihazı açın ve yazılımı başlatın.
4. Fluidics arayüzünü steril alana yerleştirin ve silikon contayı %70 (h/h) alkolle ıslatılmış tüy bırakmayan bir kağıt mendille nazikçe temizleyin. Plastiğin çatlamasını veya çatlamasını önlemek için alkolün akrilik plaka ile uzun süreli veya tekrar tekrar temasından kaçının.
5. Tüm alkol izlerini gidermek için davlumbazdaki arayüzü (yukarı bakacak şekilde) bir hava akışı sistemi ile havayla kurutun.
6. 100 oyuklu, 48 mikrokanallı bir plakanın "çıkış" kanalının (Şekil 1A) her birinin merkezi girintisine bir damlacık olarak önceden ısıtılmış 24 μL BSA çözeltisi ekleyin.

Şekil 1. Mikroakışkanlar tahlil düzeni. (A) "Çıkıştan" "girişe" ters sıvı akışını gösteren bir çift kanal. Mikroskop tarafından yakalanan ardışık döşenmiş alanlar noktalı çizgilerle gösterilir (üst kanal için 1-10 ve alt kanal için 11-20). (B) BSA kaplama sırasında ters akış için mikroakışkan kontrolör yazılımının kurulumu (Adım 2.10). Ekran görüntüleri, üreticinin izniyle burada çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

7. Arayüzü, arayüzün dört cıvatasını plakadaki karşılık gelen soketleriyle hizalayarak mikrokanal plakasının üstüne yerleştirin.
8. Eldivenli parmakları kullanarak cıvataları sıkın. Elle sıkmaya karşı direncin yanlış hizalamayı gösterdiğini unutmayın. Böyle bir durumda, arayüzü hafifçe kaldırın ve yeniden oturtun ve cıvataları sıkmaya devam edin.
9. Cıvatalar parmak gibi sıkı olduğunda, arayüzü daha da sıkmak için tork anahtarını kullanın.
10. Mikroakışkan yazılım arayüzünü kullanarak (Şekil 1B), Modu Manuel olarak ayarlayın. Her iki sütun kümesi için varsayılan Akışkan seçeneğini (Water@19degC) kullanın ve yamultmayı 1 dyn/cm^2 olarak ayarlayın.
    1. Sıvıyı "girişlere" doğru pompalamak için "çıkış" sütunlarını (#2,4,6,8) etkinleştirin. 30 dakika oda sıcaklığında çalıştırın .
11. Her bir "girişte" bir BSA çözeltisi damlacığının biriktiğinden emin olmak için mikrokanal plakasının altından bakarak her bir "girişi" iyi bir şekilde görsel olarak inceleyin. Bu, 24 kanalın tamamının başarıyla ıslatıldığını ve doldurulduğunu doğrular.
12. Arayüzü açın ve kanalların kurumasını önlemek için her bir oyuğa ("girişler" ve "çıkışlar") BSA içermeyen 250 μL HBSS+ ile doldurun ve plakayı bir doku kültürü inkübatörüne koyun.
    NOT: Proteinlerin mikrokanal plakasının kanal yüzeylerine düzgün bir şekilde adsorbe edilmesi için en az 48 saat gereklidir. Protein kaplamasından sonra plakalar, yapışma deneylerinde kullanılmadan önce nemli bir ortamda (% 100 doymuş neme sahip bir doku kültürü inkübatörü gibi) iki haftaya kadar saklanabilir. Daha uzun süreler boyunca, buharlaşmayı önlemek için plakaları plastik filme sarın.

3. Yapışma testi

1. YPD ve M199'da maya inkübasyonu sırasında (adım 1.5), BSA kaplı mikrokanal plakasının giriş ve çıkış kuyularını, her bir oyuğun merkezi girintisinden geçen kanalı bozmadan aspire edin (Şekil 1A). Bunun yerine, kuyunun kenarından aspire edin. "Çıkış" kuyucuklarına 1 mL HBSS+ ekleyin.
2. Mikroakışkanlar arayüzünü yukarıdaki gibi takın (adım 2.5). Kanalı yıkamak ve bağlanmamış BSA'yı çıkarmak için varsayılan sıvı ayarını (Water@19degC) 'de sıvı ve oda sıcaklığında 2 dyn/cm^2'de Kesme özelliğini kullanın. Bu akış hızında 2-3 saat yıkayın.
3. Arayüzü mikrokanal plakasından çıkarın. Mikroakışkan cihazın plakalı ısıtıcı ünitesini açın ve 37 °C'ye ayarlandığını onaylayın.
4. Ortamı plakadaki tüm oyuklardan aspire edin ve her bir "çıkış" çiftine adım 1.5'ten 0.5 mL indüklenmiş maya ekleyin. 2 mL'lik tüpleri 3-6 kez ters çevirerek mayayı tamamen yeniden süspanse edin ve kuyucuklara eklemeden hemen önce hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. "Giriş" kuyularını boş bırakın.
5. Akışkan arayüzünü yukarıdaki adım 2.5'te olduğu gibi mikrokanal plakasına sabitleyin. Sıvıyı HBSS@37degC ve Kesmeyi 5 dyn/cm^2 olarak ayarlamak için cihaz yazılımını kullanın.
   1. Sıvıyı "girişlere" doğru pompalamak için "çıkış" sütunlarını (#2,4,6,8) etkinleştirin. Mayanın BSA kaplı kanala yapışmasını sağlamak için plakalı ısıtıcıda 37 °C'de 30 dakika çalıştırın.
6. Bu süre zarfında yıkama tamponunu hazırlayın. Dulbecco'nun kalsiyum ve magnezyum (DPBS+) içeren fosfat tamponlu tuzlu suyunun 30 mL'sine, mayanın tespiti için floresan hale getirmek üzere dahil edilen 5 μM kalkoflor ekleyin. 37 °C'lik bir banyoda ısıtın.
7. 30 dakikalık yapışmanın sonunda, diğer akış koşullarını değiştirmeden yazılım arayüzünü kullanarak akışı duraklatın . Arayüzü açın ve tüm kuyucukları ("girişler" ve "çıkışlar") aspire edin.
8. "Çıkışlara" 1 mL calcofluor yıkama tamponu ekleyin. Fluidics arayüzünü yeniden takın ve yazılımı kullanarak akışa 10 dakika daha devam edin. Bu adım, yapışmayan ve gevşek bağlı mayayı yıkamak ve aynı anda kanaldaki mayayı floresan olarak lekelemek için tasarlanmıştır.
9. 10 dakika sonra, akışkan arayüzünü çıkarın ve bir kapakla değiştirin. Mikrokanal plakasının altını tüy bırakmayan bir mendille nazikçe temizleyin ve görüntülemeye devam edin.

4. Görüntüleme ve niceleme

1. Mikrokanal plakasını uygun bir mikroskop tablası tutucusuna yerleştirin. Kanalın görüntü yüksekliğinin yaklaşık yarısını dolduracak şekilde bir görüş alanına izin verecek 20x objektif lens kullanın. Kanal 1'in sol ucunu bulun ("giriş" 1'de). S'yi, kanal Şekil 1A, konum 1'deki gibi konumlandırılacak şekilde ayarlayın.
2. Kanalın tek bir parlak alan görüntüsünü elde edin. Veri analizi sırasında alan ölçümlerini normalleştirmek için dikdörtgen ölçüm aracını kullanarak kanal alanının alanını μm² cinsinden ölçün (bkz. Tartışma).
3. DAPI floresan kanalına geçiş (uyarma 395 nm, emisyon 440/40 nm) odağı kanalın alt yüzeyindeki yapışkan mayaya ayarlayın. Otomatik odaklamayı bu düzlemde kilitleyin. Görüntü sensörünün doygunluğunu önlemek için floresan uyarma yoğunluğunu %1,5'e ve kamera pozlama koşullarını (gruplama 2x2, 15 ms pozlama, 12 bit, kazanç 4) ayarlayın.
4. Motorlu tablayı ve ND Edinimini kullanma | Mikroskop kontrolör yazılımındaki XY Görüntüleme , ilk kanal çiftinin (1/2) bir görüş alanı (666 μm) aralıklı ardışık örtüşmeyen görüntü serisini otomatik olarak yakalar.
   1. Üst kanal için soldan sağa 10 görüntü toplayın, 666 μm aşağı kaydırın ve alt kanal için sağdan sola 10 görüntü daha toplayın ( Şekil 1A'da şematik olarak gösterildiği gibi).
   2. Göreli XY seçeneğini kullanın, böylece görüntü konumları tanımlandıktan sonra, kanalın başlangıcı manuel olarak tanımlandıktan sonra her kanal çifti için benzer bir seri tetiklenebilir.
   3. Görüntüleri DAPI kanalında toplayın (ND Alımı | λ | DAPI) olarak adlandırılır.
5. Motorlu tabla plakayı hareket ettirirken kanalın görüş alanı içinde kaldığını doğrulamak için görüntüleri izleyin.
   NOT: Bir kanal çiftinden gelen her 20 görüntü seti, ND alımı tarafından otomatik olarak ardışık bir dosya adıyla kaydedilecektir.
6. Otomatik adım işlevini kullanın (XYZ Navigasyon | XY adımı) 25750 μm'yi "girişe" 3 hareket ettirmek için. Kanal konumuna adım 4.1'deki gibi manuel olarak ince ayar yapın. Kanal çifti 3/4'ün bir sonraki görüntü setini (ND Alımı) yakalayın.
7. 12 kanal çiftinin tümü görüntülenene ve sonuçlar 12 dosyaya kaydedilene kadar bu işlemi tekrarlayın. Üreticinin 1-24 arasındaki kanal siparişini takip edin.
8. 12 floresan görüntü setinin tümünü tek bir dosyada birleştirin (Dosya | ND Belgelerini Birleştir). Dosya sırasının, 12 görüntü kümesinin yakalanma sırasıyla eşleştiğini onaylayın.
9. İkili Kullan | Mayayı floresan seviyelerine göre arka plandan ayırmak için eşik. Aynı eşiği tüm görüntü yığınına uygulayın.
   NOT: 12 bit gri tonlamalı yoğunluk düşük eşiği 500 ve yüksek eşik maksimum 4095'e ayarlanmıştır.
10. Eşik alanını ölçme (Ölçme | Ölçüm Gerçekleştirin | Tüm Çerçeveler). Raporu açın (Analiz Kontrolleri | Otomatik Ölçüm Sonuçları) ve verileri kontrol edin.
    NOT: Bu, 240 görüntü (12 kanal çiftinin her birinden 20 görüntü) için bir ölçüm tablosu oluşturur ve her görüntü için eşik alanı BinaryArea [μm²] etiketli sütunda listelenir.
11. Verileri sekmeyle ayrılmış bir metin dosyasına aktarın (Dışa Aktar).

Protokol bölümünde açıklanan yöntemler kullanılarak, 6 Cp suşunun yapışması karşılaştırıldı (Tablo 1)

Yukarıdaki protokolden elde edilen veriler, standart bir elektronik tablo yazılımı kullanılarak analiz edilebilir. Veriler, aşağıdaki gibi hesaplanan "yapışma indeksi" olarak ifade edilir: Her 10 görüntü seti için BinaryArea değeri (tek bir kanal için maya kapsamını temsil eder) görüntüler boyunca toplanır ve her kanal çiftinin toplam alanı için ortalama ve standart sapma hesaplanır. Adım 4.2'de ölçülen kanal alanı, mayada kaplanabilecek tek bir görüş al...

Açıklama yok.

Bu çalışma, William ve Mary Oh-William ve Elsa Zopfi Perinatal Araştırma Pediatri Profesörlüğü, Kilguss Araştırma Çekirdeği ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden P30GM114750 numaralı hibe kapsamında bir Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) ile desteklenmiştir.