Адгезия Candida parapsilosis к бычьему сывороточному альбумину под действием жидкостного сдвига

Адгезия является важным первым шагом в колонизации и патогенезе для Candida. В данной работе описан анализ in vitro для измерения адгезии изолятов C. parapsilosis к иммобилизованным белкам при сдвиге жидкости. Многоканальное микрофлюидное устройство используется для параллельного сравнения нескольких образцов с последующей количественной оценкой с помощью флуоресцентной визуализации.

C. parapsilosis (Cp) является новой причиной инфекций кровотока в некоторых группах населения. Клада Candida , в том числе и Cp, все чаще развивает устойчивость к первой и второй линии противогрибковых препаратов. ЦП часто выделяют из рук и поверхностей кожи, а также из желудочно-кишечного тракта. Колонизация Candida предрасполагает людей к инвазивным инфекциям кровотока. Чтобы успешно колонизировать или вторгнуться в организм хозяина, дрожжи должны быть в состоянии быстро прилипать к поверхностям тела, чтобы предотвратить их выведение защитными механизмами хозяина. Здесь мы описываем метод измерения адгезии Cp к иммобилизованным белкам при сдвиге физиологической жидкости с использованием анализа адгезии в конечной точке в коммерчески доступном многоканальном микрофлюидном устройстве. Этот метод оптимизирован для улучшения воспроизводимости, минимизации субъективности и возможности количественного определения отдельных изолятов с флуоресцентной лампой. Мы также демонстрируем, что некоторые клинические изоляты Cp демонстрируют повышенную адгезию при выращивании в условиях, имитирующих млекопитающего-хозяина, в то время как часто используемый лабораторный штамм, CDC317, не адгезивный при сдвиге жидкости.

Candida spp. являются распространенными комменсальными организмами на коже и слизистых оболочках человека, которые могут приводить к инвазивным заболеваниям среди людей с ослабленным иммунитетом со значительной заболеваемостью, смертностью и стоимостью ^1,2,3. Несмотря на то, что C. albicans остается важной причиной этих инфекций, такие виды, как C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis и C. auris, получают все большее признание, особенно в уязвимых группах населения и с частой устойчивостью к доступным противогрибковым препаратам⁴. Виды, не относящиеся к альбиканам, представляют собой различные элементы биологии и патогенеза, которые находятся в стадии активного изучения.

Адгезия является важным первым шагом в колонизации и патогенезе. Таким образом, вмешательство в этот этап может дать возможность остановить прогрессирование заболевания на ранней стадии. Исследования адгезии и инвазии Candida были преимущественно сосредоточены на статических условиях ^5,6. Эти исследования помогли определить структуру и функции грибковых адгезинов при заболевании ^7,8,9. Тем не менее, адгезия в кровотоке, желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) и мочевыводящих путях, а также в катетерах должна происходить в условиях сдвигового потока жидкости, который накладывает уникальные ограничения на адгезию. Адгезия при сдвиге требует быстрого образования улавливающей связи и способности выдерживать сильные тяговые усилия, возникающие из-за движения жидкостей^10,11. Было показано, что адгезин C. albicans, Als5 способствует адгезии, зависящей от сдвига^12,13. Ранее было показано, что CpAls7 (CpALS4800) опосредует адгезию Cp к эпителиальным клеткам, а нокаут показал снижение вирулентности в модели инфекции мочевыводящих путей¹⁴. Мы продемонстрировали, что CpALS4800 способствует адгезии в физиологически значимых условиях сдвига жидкости¹⁵.

Колонизация и патогенез Candida были широко изучены на животных моделях 16,17,18. Наиболее часто используемыми моделями являются инфекции слизистой оболочки и кровотока мышей, но модели беспозвоночных, такие как личинки Galleria, используются все чаще из-за низкой стоимости, быстрой производительности и простоты. Животные модели повторяют многие этапы процесса заболевания человека как у патогена, так и у хозяина, включая адаптивные и врожденные иммунные реакции хозяина, взаимодействие дрожжей с тканями и микробиотой, а также реакцию дрожжей на окружающую среду хозяина. В отличие от этого, анализы адгезии in vitro позволяют сосредоточиться именно на стадии адгезии и на экспериментальных манипуляциях с такими переменными, как сила сдвига, условия роста дрожжей и адгезия к конкретным субстратам.

Поскольку Cp способен расти как в организме человека, так и в источниках окружающей среды, он, вероятно, способен ощущать и реагировать на различные условия окружающей среды. В поддержку этого предположения можно привести тот факт, что многочисленные клинические изоляты Cp демонстрируют низкую адгезию при сдвиге жидкости при выращивании в стандартной среде для роста дрожжей, дрожжевом пептон-декстрозе (YPD), но переходят к сильной адгезии при выращивании в течение нескольких часов при 37 °C в среде для тканевых культур 199 (M199)^15,19. Здесь представлен подробный протокол для анализа производительности среды, который позволяет измерить адгезию нескольких образцов дрожжей, которые работают параллельно, при определенных условиях роста, сдвига жидкости, температуры и субстрата. Анализ был разработан для обеспечения максимальной воспроизводимости и использования клинических изолятов Cp, а также штаммов, которые были экспериментально обработаны в лаборатории. Описанный здесь анализ адгезии Cp к субстрату бычьего сывороточного альбумина (BSA) демонстрирует, что клинические изоляты демонстрируют диапазон адгезии, в то время как два широко используемых лабораторных штамма, CDC317 и CLIB214 демонстрируют слабую адгезию.

Candida spp. классифицируются как организмы уровня биобезопасности 2, и с ними следует обращаться с соблюдением соответствующих мер предосторожности.

1. Рост и индукция клинических штаммов

1. Streak Cp напрягается на 1% (м/об) дрожжевого экстракта, 2% (м/об) пептона, 2% (м/об) декстрозы (YPD) и 2% (м/об) агаровых пластинах и растет при 22 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Планшеты можно хранить на лабораторном столе и использовать повторно в течение следующей недели.
2. За день до анализа адгезии перенесите примерно 6 колоний каждого штамма в колбу Эрленмейера объемом 250 мл (конусообразную), содержащую 10 мл среды YPD. Выращивайте в течение ночи в микробиологическом шейкере, настроенном на 250 об/мин при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Cp необходимо расти в течение 20-24 часов, чтобы достичь стационарной фазы в жидкой культуре при 37 °C.
3. В день проведения анализа на адгезию выполните следующие действия.
   1. Перенесите 1 мл жидкой культуры из колбы Эрленмейера в пробирку для микрофугирования.
   2. Центрифугируйте культуру с максимальной скоростью в микрофуге (16 000 x g) в течение 3 минут. Повторно суспензируйте гранулу в 1 мл стерильной воды и повторите этот шаг в общей сложности три стирки.
   3. По окончании последней промывки повторно суспендируйте гранулу в 1 мл стерильной воды. Используйте наконечники для пипеток с широким отверстием объемом 1 мл и 200 мкл для работы с дрожжевыми суспензиями на этом и последующих этапах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Многие штаммы клея Cp прилипают к стенкам колбы Эрленмейера, и для их удаления требуется механическое соскабливание.
4. Подсчитайте дрожжевые клетки с помощью гемоцитометра или аналогичного прибора. Разбавьте дрожжевую культуру до достижения разумно исчисляемой концентрации 50-200 дрожжевых клеток. Используйте 500-кратное разбавление, добавив 20 μL в 10 мл воды.
   Примечание: Большинство штаммов Cp вырастают до 10^{8-10 9} клеток/мл в культуре ночного встряхивания при 37 °C.
5. Разведите дрожжевую культуру с 2 мл YPD или средой 199 (M199) в конечной концентрации 3 x 10⁶ клеток/мл в микрофуге объемом 2 мл. Выдерживать на водяной бане при температуре 37 °C в течение 3 часов.

2. Покрытие микрофлюидных каналов

1. Заранее приготовьте 2% (м/в) раствор BSA в сбалансированном солевом растворе Хэнка, содержащем кальций и магний (HBSS+). Для этого аккуратно рассыпьте 4 г порошка BSA на поверхность 200 мл HBSS+ и инкубируйте при 37 °C в течение 30-60 минут, не беспокоя, чтобы белок намок, а затем растворился. Процедить-стерилизовать раствор и хранить при температуре 4 °C.
2. Нагрейте 2,5 мл этого раствора до 37 °C в течение не менее 1 часа, сохраняя его стерильным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прогревание необходимо для уменьшения образования пузырьков в микроканальной пластине.
3. Пока БСА нагревается, переместите контроллер микрофлюидики в колпак для культуры тканей, включите прибор и запустите программное обеспечение.
4. Поместите интерфейс жидкости в стерильное поле и аккуратно очистите силиконовую прокладку безворсовой папиросной бумагой, смоченной 70% (v/v) спиртом. Избегайте длительного или многократного контакта спирта с акриловой пластиной, чтобы предотвратить образование растрескивания или растрескивания пластика.
5. Высушите на воздухе интерфейс (лицевой стороной вверх) в капоте с помощью системы обдува, чтобы удалить все следы алкоголя.
6. Добавьте 100 мкл предварительно подогретого раствора БСА в виде капли в центральное углубление каждого из «выходных» каналов (рис. 1А) 48-луночного 24-микроканального планшета.

Рисунок 1. Схема анализа микрофлюидики. (A) Пара каналов, показывающих обратный поток жидкости от «выхода» к «входу». Последовательные мозаичные поля, захваченные микроскопом, показаны пунктирными линиями (1-10 для верхнего канала и 11-20 для нижнего). (B) Настройка программного обеспечения контроллера микрофлюидики для обратного потока во время нанесения покрытия BSA (шаг 2.10). Скриншоты воспроизведены здесь с разрешения производителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

7. Поместите интерфейс на верхнюю часть пластины микроканала, совместив четыре болта интерфейса с соответствующими гнездами на пластине.
8. Затяните болты пальцами в перчатках. Имейте в виду, что сопротивление ручной затяжке указывает на смещение. В этом случае слегка приподнимите интерфейс и установите его на место, а затем продолжите крепление болтов.
9. Когда болты затянуты пальцами, используйте динамометрический ключ для дальнейшей затяжки интерфейса.
10. Используя программный интерфейс микрогидротехники (рис. 1B), установите для параметра Режим значение Вручную. Используйте параметр Fluid (Water@19degC) по умолчанию для обоих наборов колонн и установите сдвиг на 1 дин/см^2.
    1. Активируйте "выходные" колонки (#2,4,6,8) для перекачки жидкости к "входам". Запустить при комнатной температуре 30 минут.
11. Визуально осмотрите каждую «входную лунку», заглянув в нижнюю часть микроканальной пластины, чтобы убедиться, что капля раствора BSA скопилась в каждом «входе». Это подтверждает, что все 24 канала были успешно смачаны и заполнены.
12. Отстегните интерфейс и долейте каждую лунку («входы» и «выходы») 250 мкл HBSS+ без BSA для предотвращения пересыхания каналов и поместите планшет в инкубатор для тканевых культур.
    Примечание: Минимум 48 часов требуется для равномерной адсорбции белков на поверхностях каналов микроканальной пластины. После белкового покрытия планшеты могут храниться до двух недель во влажной среде (например, в инкубаторе для тканевых культур со 100% насыщающей влажностью) перед использованием в анализах адгезии. При более длительном периоде оберните пластины полиэтиленовой пленкой, чтобы предотвратить испарение.

3. Анализ адгезии

1. Во время инкубации дрожжей в YPD и M199 (шаг 1.5) аспирируйте входные и выходные лунки микроканальной пластины с покрытием BSA, не нарушая канал, который проходит от центрального углубления каждой лунки (рис. 1A). Вместо этого отсасывайте от края колодца. Добавьте 1 мл HBSS+ в «выходные» лунки.
2. Подключите интерфейс микрофлюидики, как указано выше (шаг 2.5). Используйте стандартную настройку жидкости Жидкость при (Water@19degC) и Сдвиг при 2 дин/см^2 при комнатной температуре, чтобы промыть канал и удалить все несвязанные BSA. Стирайте в течение 2-3 часов при такой скорости потока.
3. Снимите интерфейс с микроканальной пластины. Включите блок нагревателя пластин устройства микрофлюидики и убедитесь, что он установлен на 37 °C.
4. Отсасывайте среду из всех лунок на тарелке и добавляйте по 0,5 мл индуцированных дрожжей с шага 1,5 в каждую пару «выходов». Полностью суспендируйте дрожжи, перевернув пробирки объемом 2 мл 3-6 раз, и аккуратно пипетируйте вверх и вниз непосредственно перед добавлением в лунки. Оставьте «входные» лунки пустыми.
5. Закрепите интерфейс fluidics на микроканальной пластине, как описано в шаге 2.5 выше. Используйте программное обеспечение устройства, чтобы установить Fluid на HBSS@37degC, а Shear на 5 dyn/cm^2.
   1. Активируйте "выходные" колонки (#2,4,6,8) для перекачки жидкости к "входам". Запустите нагреватель пластин при температуре 37 °C в течение 30 минут, чтобы дрожжи прилипли к каналу, покрытому BSA.
6. За это время подготовьте буфер для промывки. К 30 мл фосфатно-солевого буферного раствора Дульбекко, содержащего кальций и магний (DPBS+) добавьте 5 мкМ калькофтора, который входит в состав для придания дрожжам флуоресценции для их обнаружения. Согрейте в ванне при температуре 37 °C.
7. По истечении 30-минутной адгезии приостановите поток с помощью программного интерфейса, не изменяя другие условия потока. Отстегиваем интерфейс и аспирируем все лунки («входы» и «выходы»).
8. Добавьте 1 мл буфера для промывки калькофтора в «выходы». Снова подключите интерфейс fluidics и возобновите поток с помощью программного обеспечения еще на 10 минут. Этот этап предназначен для смывания неприлипших и слабо связанных дрожжей, и одновременного флуоресцентного окрашивания дрожжей в канале.
9. Через 10 минут снимите интерфейс жидкости и установите на место крышку. Аккуратно очистите нижнюю часть микроканальной пластины безворсовой салфеткой и приступайте к визуализации.

4. Визуализация и количественная оценка

1. Поместите микроканальную пластину в подходящий держатель предметного столика для микроскопа. Используйте объектив с 20-кратным увеличением, который обеспечит такое поле зрения, что канал будет заполнять примерно половину высоты изображения. Найдите левый конец канала 1 (на входе 1). Отрегулируйте столик так, чтобы канал располагался так, как показано на рисунке 1A, позиция 1.
2. Получение одного светлопольного изображения канала. Измерьте площадь канала в^мкм2 с помощью инструмента для измерения прямоугольника, чтобы нормализовать измерения площади при анализе данных (см. Обсуждение).
3. Переключившись на флуоресцентный канал DAPI (возбуждение 395 нм, излучение 440/40 нм) настройте фокус на адгезивные дрожжи на нижней поверхности канала. Заблокируйте автофокус в этой плоскости. Установите интенсивность возбуждения флуоресценции на 1,5% и условия экспозиции камеры (объединение 2x2, экспозиция 15 мс, 12 бит, усиление 4), чтобы избежать насыщения матрицы.
4. Использование моторизованного столика и захват ND | XY Imaging в программном обеспечении контроллера микроскопа автоматически захватывает последовательную серию неперекрывающихся изображений, удаленных друг от друга на одно поле зрения (666 мкм) от пары первых каналов (1/2).
   1. Соберите 10 изображений слева направо для верхнего канала, сместите вниз на 666 мкм и соберите еще 10 изображений справа налево для нижнего канала (как схематически показано на рисунке 1А).
   2. Используйте опцию Относительная XY, чтобы после определения положения изображения можно было запустить аналогичную серию для каждой пары каналов после того, как начало канала будет определено вручную.
   3. Сбор изображений в канале DAPI (ND Acquisition | λ | DAPI).
5. Отслеживайте изображения, чтобы убедиться, что канал остается в поле зрения, когда моторизованный столик перемещает пластину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый набор из 20 изображений из пары каналов будет автоматически сохранен с последовательным именем файла при захвате ND.
6. Используйте функцию автошага (XYZ Navigation | XY шаг) для перемещения на 25750 мкм вниз до "входа" 3. Выполните тонкую настройку положения канала вручную, как в шаге 4.1. Захват следующего набора изображений (ND Acquisition) пары каналов 3/4.
7. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будут созданы изображения всех 12 пар каналов, а результаты будут сохранены в 12 файлах. Следуйте заказу каналов производителя с 1 до 24.
8. Объедините все 12 наборов флуоресцентных изображений в один файл (Файл | Объединить документы ND). Убедитесь, что порядок файлов совпадает с порядком, в котором были записаны 12 наборов изображений.
9. Используйте двоичный файл | Порог для отделения дрожжей от фона основан на уровне их флуоресценции. Примените один и тот же порог ко всей стопке изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Типичным является 12-битный нижний порог интенсивности оттенков серого, равный 500, и высокий порог, установленный на максимум 4095.
10. Измерьте пороговую площадь (Measure | Выполнение измерений | Все кадры). Откройте отчет (Элементы управления анализом | Автоматизированные результаты измерений) и данные проверки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При этом будет создана таблица измерений для 240 изображений (по 20 изображений от каждой из 12 пар каналов), а пороговая область для каждого изображения указана в столбце с меткой BinaryArea [μm²].
11. Экспорт данных в текстовый файл, разделенный табуляцией (Экспорт).

С помощью методов, описанных в разделе «Протокол», сравнивали адгезию 6 штаммов Cp (табл. 1)

Данные, полученные в результате использования вышеуказанного протокола, могут быть проанализированы с помощью стандартного программного обеспечения для работы с электронными таблицами. Данные выражаются в виде «индекса адгезии», который рассчитывается следующим ?...

Никаких разглашений.

Эта работа была поддержана грантом от профессора педиатрии Уильяма и Мэри О-Уильям и Эльзы Зопфи для перинатальных исследований, исследовательского ядра Килгусса и премией за институциональное развитие (IDeA) от Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером P30GM114750.