Adesione della parapsilosi da Candida all'albumina sierica bovina sotto taglio fluido

L'adesione è un primo passo importante nella colonizzazione e nella patogenesi della Candida. Qui, viene descritto un test in vitro per misurare l'adesione degli isolati di C. parapsilosis alle proteine immobilizzate sotto taglio fluido. Un dispositivo microfluidico multicanale viene utilizzato per confrontare più campioni in parallelo, seguito dalla quantificazione utilizzando l'imaging a fluorescenza.

C. parapsilosis (Cp) è una causa emergente di infezioni del flusso sanguigno in alcune popolazioni. Il clade della Candida , incluso il Cp, sta sviluppando sempre più resistenza alla prima e alla seconda linea di antimicotici. La CP è spesso isolata dalle mani e dalle superfici cutanee, nonché dal tratto gastrointestinale. La colonizzazione da Candida predispone gli individui a infezioni invasive del flusso sanguigno. Per colonizzare o invadere con successo l'ospite, il lievito deve essere in grado di aderire rapidamente alle superfici corporee per prevenire l'eliminazione da parte dei meccanismi di difesa dell'ospite. Qui descriviamo un metodo per misurare l'adesione di Cp alle proteine immobilizzate sotto taglio fisiologico del fluido, utilizzando un saggio di adesione end-point in un dispositivo microfluidico multicanale disponibile in commercio. Questo metodo è ottimizzato per migliorare la riproducibilità, ridurre al minimo la soggettività e consentire la quantificazione fluorescente dei singoli isolati. Dimostriamo anche che alcuni isolati clinici di Cp mostrano una maggiore adesione quando vengono coltivati in condizioni che imitano un ospite mammifero, mentre un ceppo di laboratorio usato frequentemente, CDC317, non è adesivo sotto taglio fluido.

Sono organismi commensali comuni sulla pelle e sulle mucose umane che possono portare a malattie invasive tra gli immunocompromessi con sostanziale morbilità, mortalità e costo associati ^1,2,3. Sebbene C. albicans rimanga una causa importante di queste infezioni, le specie non albicans come C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis e C. auris sono sempre più riconosciute, soprattutto nelle popolazioni vulnerabili e con frequente resistenza ai farmaci antifungini disponibili⁴. Le specie non albicans presentano elementi distinti di biologia e patogenesi che sono oggetto di indagine attiva.

L'adesione è un primo passo importante nella colonizzazione e nella patogenesi. L'interferenza con questa fase può quindi offrire l'opportunità di arrestare la progressione della malattia in una fase precoce. Gli studi sull'adesione e l'invasione della Candida si sono concentrati prevalentemente sulle condizioni statiche ^5,6. Questi studi hanno contribuito a definire la struttura e le funzioni delle adesine fungine nella malattia ^7,8,9. Tuttavia, l'adesione nel flusso sanguigno, nei tratti gastrointestinali (GI) e nelle vie urinarie e nei cateteri deve avvenire in condizioni di flusso di taglio del fluido che pone vincoli unici all'adesione. L'adesione sotto taglio richiede una rapida formazione di legami di cattura e la capacità di resistere a forti forze di trazione prodotte a causa del movimento dei liquidi^10,11. L'adesina di C. albicans, Als5, ha dimostrato di facilitare l'adesione dipendente dal taglio^12,13. CpAls7 (CpALS4800) ha precedentemente dimostrato di mediare l'adesione di Cp alle cellule epiteliali e un knockout ha mostrato una diminuzione della virulenza in un modello di infezione del tratto urinario¹⁴. Abbiamo dimostrato che CpALS4800 promuove l'adesione in condizioni di taglio del fluido fisiologicamente rilevanti¹⁵.

La colonizzazione e la patogenesi della candida sono state ampiamente studiate nei modelli animali 16,17,18. I modelli più frequentemente utilizzati sono le infezioni della mucosa murina e del flusso sanguigno, ma i modelli di invertebrati, come le larve di Galleria, sono sempre più utilizzati a causa del basso costo, della rapidità di produzione e della semplicità. I modelli animali ricapitolano molte fasi del processo patologico umano sia nel patogeno che nell'ospite, comprese le risposte immunitarie adattative e innate dell'ospite, le interazioni del lievito con i tessuti e il microbiota e le risposte del lievito all'ambiente ospite. Al contrario, i saggi di adesione in vitro consentono di concentrarsi specificamente sulla fase di adesione e sulla manipolazione sperimentale di variabili come la forza di taglio, le condizioni di crescita del lievito e l'adesione a substrati specifici.

Poiché il Cp è in grado di crescere sia negli esseri umani che nelle fonti ambientali, è probabile che sia in grado di percepire e rispondere a diversi ambienti. A sostegno di questa nozione, diversi isolati clinici di Cp mostrano una bassa adesione al taglio fluido quando vengono coltivati nel terreno di crescita standard del lievito, lievito-peptone-destrosio (YPD), ma passano a una forte adesione quando vengono coltivati per alcune ore a 37 °C nel terreno di coltura tissutale 199 (M199)^15,19. Qui viene fornito un protocollo dettagliato per un saggio a media produttività che consente la misurazione dell'adesione di più campioni di lievito eseguiti in parallelo, in condizioni definite di crescita, taglio del fluido, temperatura e substrato. Il test è stato progettato per massimizzare la riproducibilità e per consentire l'uso di isolati clinici di Cp, nonché di ceppi che sono stati manipolati sperimentalmente in laboratorio. Il test qui descritto, per l'adesione di Cp a un substrato di albumina sierica bovina (BSA), dimostra che gli isolati clinici mostrano un intervallo di adesione, mentre due ceppi di laboratorio comunemente usati, CDC317 e CLIB214 mostrano una scarsa adesione.

La Candida spp. è classificata come organismo di livello di biosicurezza 2 e deve essere maneggiata utilizzando le opportune precauzioni.

1. Crescita e induzione di ceppi clinici

1. Streak Cp ceppa su piastre di agar all'1% (m/v) di estratto di lievito, al 2% (m/v) di peptone, al 2% (m/v) di destrosio (YPD) e al 2% (m/v) e cresce a 22 °C.
   NOTA: Le piastre possono essere conservate sul banco del laboratorio e riutilizzate nel corso della settimana successiva.
2. Il giorno prima del test di adesione, trasferire circa 6 colonie di ciascun ceppo in un pallone di Erlenmeyer (conico) da 250 mL contenente 10 mL di terreno YPD. Coltivare per una notte in un agitatore microbiologico impostato a 250 giri/min a 37 °C.
   NOTA: Il Cp deve crescere per 20-24 ore per raggiungere la fase stazionaria in coltura liquida a 37 °C.
3. Eseguire i seguenti passaggi il giorno del test di adesione.
   1. Trasferire 1 mL di coltura liquida dal pallone di Erlenmeyer a una provetta per microfuge.
   2. Centrifugare la coltura alla massima velocità in microfuga (16.000 x g) per 3 minuti. Risospendere il pellet in 1 mL di acqua sterile e ripetere questo passaggio per un totale di tre lavaggi.
   3. Al termine dell'ultimo lavaggio, risospendere il pellet in 1 mL di acqua sterile. Utilizzare puntali per pipette a orifizio largo da 1 mL e 200 μL per la manipolazione delle sospensioni di lievito durante questa fase e quelle successive.
      NOTA: Molti ceppi adesivi di Cp si attaccano ai lati del pallone di Erlenmeyer e richiedono una raschiatura meccanica per essere rimossi.
4. Contare le cellule di lievito utilizzando un emocitometro o un dispositivo equivalente. Diluire la coltura di lievito per ottenere una concentrazione ragionevolmente numerabile di 50-200 cellule di lievito. Utilizzare una diluizione di 500 volte, mettendo 20 μL in 10 mL di acqua.
   NOTA: La maggior parte dei ceppi di Cp cresce fino a 10^{8-10 9} cellule/mL in una coltura di agitazione notturna a 37 °C.
5. Diluire la coltura di lievito con 2 mL di YPD o Medium 199 (M199), a una concentrazione finale di 3 x 10⁶ cellule/mL in una provetta microfusa da 2 mL. Incubare a bagnomaria a 37 °C per 3 ore.

2. Rivestimento di canali microfluidici

1. Preparare in anticipo una soluzione al 2% (m/v) di BSA nella soluzione salina bilanciata di Hank contenente calcio e magnesio (HBSS+). Per fare ciò, cospargere delicatamente 4 g di polvere di BSA sulla superficie di 200 ml di HBSS+ e incubare a 37 °C per 30-60 minuti indisturbati per consentire alla proteina di bagnarsi e poi sciogliersi. Sterilizzare la soluzione con filtro e conservare a 4 °C.
2. Scaldare 2,5 mL di questa soluzione a 37 °C per almeno 1 ora, mantenendola sterile.
   NOTA: Il riscaldamento è necessario per ridurre la formazione di bolle nella piastra a microcanali.
3. Mentre il BSA si sta riscaldando, spostare il controller microfluidico sulla cappa di coltura tissutale, accendere il dispositivo e avviare il software.
4. Posizionare l'interfaccia fluidica all'interno del campo sterile e pulire delicatamente la guarnizione in silicone con una carta velina priva di lanugine bagnata con alcol al 70% (v/v). Evitare il contatto prolungato o ripetuto dell'alcol con la lastra acrilica per evitare screpolature o screpolature della plastica.
5. Asciugare all'aria l'interfaccia (rivolta verso l'alto) nella cappa con un sistema di flusso d'aria per rimuovere ogni traccia di alcol.
6. Aggiungere 100 μl della soluzione BSA preriscaldata sotto forma di gocciolina nella rientranza centrale di ciascuno dei canali di "uscita" (Figura 1A) di una piastra a 48 pozzetti e 24 microcanali.

Figura 1. Layout del saggio di microfluidica. (A) Una coppia di canali, che mostrano il flusso inverso del fluido dall'"uscita" all'"ingresso". I campi tassellati consecutivi catturati dal microscopio sono mostrati da linee tratteggiate (1-10 per il canale superiore e 11-20 per quello inferiore). (B) Configurazione del software di controllo della microfluidica per il flusso inverso durante il rivestimento BSA (Passaggio 2.10). Screenshot riprodotti qui con il permesso del produttore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Posizionare l'interfaccia sulla parte superiore della piastra a microcanali, allineando i quattro bulloni dell'interfaccia con le prese corrispondenti nella piastra.
8. Serrare i bulloni con le dita guantate. Tenere presente che la resistenza al serraggio manuale indica un disallineamento. In tal caso, sollevare leggermente l'interfaccia e riposizionarla, quindi riprendere a fissare i bulloni.
9. Quando i bulloni sono serrati a mano, utilizzare la chiave dinamometrica per serrare ulteriormente l'interfaccia.
10. Utilizzando l'interfaccia del software microfluidics (Figura 1B), impostare la modalità su Manuale. Utilizzare l'opzione predefinita Fluido (Water@19degC) per entrambi i set di colonne e impostare il taglio su 1 dyn/cm^2.
    1. Attivare le colonne di "uscita" (#2,4,6,8) per pompare il liquido verso gli "ingressi". Far funzionare a temperatura ambiente per 30 min.
11. Ispezionare visivamente ogni pozzetto di "ingresso" sbirciando attraverso il fondo della piastra del microcanale per assicurarsi che una goccia della soluzione BSA si sia accumulata in ogni "ingresso". Ciò conferma che tutti i 24 canali sono stati bagnati e riempiti con successo.
12. Sganciare l'interfaccia e rabboccare ogni pozzetto ("ingressi" e "uscite") con 250 μl di HBSS+ senza BSA per evitare che i canali si secchino e mettere la piastra in un incubatore per colture tissutali.
    NOTA: Sono necessarie almeno 48 ore affinché le proteine vengano adsorbite uniformemente sulle superfici dei canali della piastra dei microcanali. Dopo il rivestimento delle proteine, le piastre possono essere conservate per un massimo di due settimane in un ambiente umido (come un incubatore per colture tissutali con il 100% di umidità di saturazione) prima di essere utilizzate nei saggi di adesione. Per periodi più lunghi, avvolgere le piastre in una pellicola di plastica per evitare l'evaporazione.

3. Saggio di adesione

1. Durante l'incubazione del lievito in YPD e M199 (fase 1.5), aspirare i pozzetti di ingresso e di uscita della piastra a microcanali rivestita BSA, senza disturbare il canale che parte dalla rientranza centrale di ciascun pozzetto (Figura 1A). Invece, aspirare dal bordo del pozzo. Aggiungere 1 mL di HBSS+ ai pozzetti di "uscita".
2. Collegare l'interfaccia microfluidica come sopra (passaggio 2.5). Utilizzare l'impostazione predefinita del fluido Fluido a (Water@19degC) e Taglio a 2 dyn/cm^2 a temperatura ambiente per lavare il canale e rimuovere eventuali BSA non legati. Lavare per 2-3 ore a questa portata.
3. Rimuovere l'interfaccia dalla piastra a microcanali. Accendere l'unità di riscaldamento della piastra del dispositivo microfluidico e verificare che sia impostata su 37 °C.
4. Aspirare il terreno da tutti i pozzetti sulla piastra e aggiungere 0,5 mL di lievito indotto dal passaggio 1.5 a ciascuna coppia di "uscite". Risospendere completamente il lievito capovolgendo le provette da 2 ml 3-6 volte e pipettare delicatamente su e giù immediatamente prima dell'aggiunta ai pozzetti. Lasciare vuoti i pozzetti "di ingresso".
5. Fissare l'interfaccia fluidica alla piastra del microcanale come al punto 2.5 sopra. Utilizzare il software del dispositivo per impostare Fluido su HBSS@37degC e Taglio su 5 dyn/cm^2.
   1. Attivare le colonne di "uscita" (#2,4,6,8) per pompare il liquido verso gli "ingressi". Far funzionare il riscaldatore della piastra a 37 °C per 30 minuti, in modo che il lievito aderisca al canale rivestito di BSA.
6. Durante questo periodo, preparare il tampone di lavaggio. A 30 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco contenente calcio e magnesio (DPBS+) aggiungere 5 μM di calcofluor, che è incluso per rendere il lievito fluorescente per la loro rilevazione. Scaldare in un bagno a 37 °C.
7. Al termine dei 30 minuti di adesione, mettere in pausa il flusso utilizzando l'interfaccia software senza alterare altre condizioni di flusso. Sganciare l'interfaccia e aspirare tutti i pozzetti ("ingressi" e "uscite").
8. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio calcofluor alle "uscite". Ricollegare l'interfaccia fluidica e riprendere il flusso utilizzando il software per altri 10 minuti. Questo passaggio è progettato per lavare via il lievito non aderente e debolmente legato e contemporaneamente colorare in modo fluorescente il lievito nel canale.
9. Dopo 10 minuti, rimuovere l'interfaccia fluidica e sostituirla con un coperchio. Pulire delicatamente la parte inferiore della piastra a microcanali con un panno privo di lanugine e procedere all'imaging.

4. Imaging e quantificazione

1. Posizionare la piastra a microcanali in un supporto per tavolino per microscopio appropriato. Utilizzare un obiettivo 20x, che consentirà un campo visivo tale che il canale riempia circa la metà dell'altezza dell'immagine. Individuare l'estremità sinistra del canale 1 (in "ingresso" 1). Regolare il tavolino in modo che il canale sia posizionato come nella Figura 1A, posizione 1.
2. Acquisisci una singola immagine in campo chiaro del canale. Misurare l'area dell'area del canale in μm², utilizzando lo strumento di misurazione rettangolare per normalizzare le misurazioni dell'area durante l'analisi dei dati (vedere la discussione).
3. Passando al canale fluorescente DAPI (eccitazione 395 nm, emissione 440/40 nm) regolare la messa a fuoco sul lievito aderente sulla superficie inferiore del canale. Bloccare l'autofocus su questo piano. Impostare l'intensità di eccitazione della fluorescenza su 1,5% e le condizioni di esposizione della fotocamera (binning 2x2, esposizione 15 ms, 12 bit, guadagno 4) per evitare la saturazione del sensore di immagine.
4. Utilizzo dello stadio motorizzato e dell'acquisizione ND | XY Imaging nel software di controllo del microscopio, acquisisce automaticamente una serie consecutiva di immagini non sovrapposte distanziate di un campo visivo (666 μm) dalla prima coppia di canali (1/2).
   1. Raccogli 10 immagini da sinistra a destra per il canale superiore, spostale verso il basso di 666 μm e raccogline altre 10 da destra a sinistra per il canale inferiore (come mostrato schematicamente nella Figura 1A).
   2. Utilizzare l'opzione XY relativo , in modo che, una volta definite le posizioni dell'immagine, sia possibile attivare una serie simile per ogni coppia di canali, dopo che l'inizio del canale è stato definito manualmente.
   3. Raccogli immagini nel canale DAPI (Acquisizione ND | λ | DAPI).
5. Monitora le immagini per confermare che il canale rimanga all'interno del campo visivo mentre il tavolino motorizzato sposta la lastra.
   NOTA: Ogni set di 20 immagini da una coppia di canali verrà salvato automaticamente con un nome di file consecutivo tramite l'acquisizione ND.
6. Utilizzare la funzione autostep (Navigazione XYZ | passo XY) per spostare 25750 μm verso il basso fino a "ingresso" 3. Regolare manualmente la posizione del canale come al punto 4.1. Acquisire la serie successiva di immagini (acquisizione ND) della coppia di canali 3/4.
7. Ripetere questo processo, fino a quando tutte le 12 coppie di canali sono state riprese, con i risultati salvati in 12 file. Seguire l'ordine dei canali da 1 a 24 stabilito dal produttore.
8. Unisci tutti i 12 set di immagini fluorescenti in un unico file (File | Unisci documenti ND). Verificare che l'ordine dei file corrisponda all'ordine in cui sono stati acquisiti i 12 set di immagini.
9. Uso del sistema binario | Soglia per separare il lievito dal fondo in base al loro livello di fluorescenza. Applica la stessa soglia all'intera pila di immagini.
   NOTA: una soglia bassa di intensità della scala di grigi a 12 bit di 500 e una soglia alta impostata al massimo di 4095 è tipica.
10. Misurare l'area di soglia (Misura | Esecuzione della misurazione | Tutti i fotogrammi). Aprire il report (Controlli analisi | Risultati di misurazione automatizzati) e controllare i dati.
    NOTA: Questo genererà una tabella di misurazioni per 240 immagini (20 immagini da ciascuna delle 12 coppie di canali) e l'area di soglia per ciascuna immagine è elencata nella colonna etichettata BinaryArea [μm²].
11. Esportare i dati in un file di testo delimitato da tabulazioni (Esporta).

Utilizzando i metodi descritti nella sezione Protocollo, è stata confrontata l'adesione di 6 ceppi di Cp (Tabella 1)

I dati risultanti dal protocollo di cui sopra possono essere analizzati utilizzando un software per fogli di calcolo standard. I dati sono espressi come "indice di adesione", che viene calcolato come segue: il valore BinaryArea per ogni set di 10 immagini (che rappresenta la copertura del lievito per un singolo canale) viene sommato tra le immagini e la media e la deviazione standard vengono calcolate per l'area sommata di ciascuna coppia di canali. L'area del canale misurata nel passagg...

Nessuna divulgazione.

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della cattedra William e Mary Oh-William e Elsa Zopfi in Pediatria per la ricerca perinatale, dal Kilguss Research Core e da un Institutional Development Award (IDeA) dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di sovvenzione P30GM114750.