הידבקות של קנדידה פרפסילוזיס לאלבומין סרום בקר תחת גזירה נוזלית

הידבקות היא צעד ראשון חשוב בקולוניזציה ופתוגנזה עבור קנדידה. כאן, מתוארת בדיקת מבחנה למדידת הידבקות של מבודדי C. parapsilosis לחלבונים משותקים תחת גזירה נוזלית. מכשיר מיקרופלואידיקה רב-ערוצי משמש להשוואת דגימות מרובות במקביל, ואחריו כימות באמצעות הדמיה פלואורסצנטית.

C. parapsilosis (Cp) הוא גורם מתפתח לזיהומים בזרם הדם באוכלוסיות מסוימות. קבוצת הקנדידה , כולל Cp, מפתחת יותר ויותר עמידות לקו הראשון והשני של תרופות אנטי-פטרייתיות. Cp מבודד לעתים קרובות מהידיים ומשטחי העור, כמו גם ממערכת העיכול. קולוניזציה על ידי קנדידה נוטה לזיהומים פולשניים בזרם הדם. כדי ליישב או לפלוש בהצלחה למארח, שמרים חייבים להיות מסוגלים להיצמד במהירות למשטחי הגוף כדי למנוע חיסול על ידי מנגנוני הגנה של המארח. כאן אנו מתארים שיטה למדידת הידבקות של Cp לחלבונים משותקים תחת גזירה פיזיולוגית של נוזלים, באמצעות בדיקת הידבקות נקודת קצה במכשיר מיקרופלואידיקה רב-ערוצי זמין מסחרית. שיטה זו מותאמת לשיפור יכולת השחזור, למזער סובייקטיביות ולאפשר כימות פלואורסצנטי של מבודדים בודדים. אנו גם מדגימים כי חלק מהמבודדים הקליניים של Cp מראים הידבקות מוגברת כאשר הם גדלים בתנאים המדמים פונדקאי של יונקים, בעוד שזן מעבדה בשימוש תכוף, CDC317, אינו דביק תחת גזירה נוזלית.

קנדידה הם אורגניזמים קומנסליים נפוצים על עור האדם והרירית שיכולים להוביל למחלות פולשניות בקרב מדוכאי חיסון עם תחלואה משמעותית, תמותה ועלות ^1,2,3. למרות ש-C. albicans נותר גורם חשוב לזיהומים אלה, מינים שאינם אלביקנים כגון C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis ו-C. auris זוכים להכרה הולכת וגוברת, במיוחד באוכלוסיות פגיעות ועם עמידות תכופה לתרופות אנטי-פטרייתיות זמינות⁴. מינים שאינם אלביקנים מציגים אלמנטים מובהקים של ביולוגיה ופתוגנזה שנמצאים במחקר פעיל.

הידבקות היא צעד ראשון חשוב בקולוניזציה ופתוגנזה. לכן התערבות בשלב זה עשויה להציע הזדמנות לעצור את התקדמות המחלה בשלב מוקדם. מחקרים על הידבקות ופלישה של קנדידה התמקדו בעיקר בתנאים סטטיים ^5,6. מחקרים אלה עזרו להגדיר את המבנה והתפקודים של הידבקויות פטרייתיות במחלה ^7,8,9. עם זאת, הידבקות בזרם הדם, בדרכי העיכול (GI) ובדרכי השתן, ובצנתרים חייבת להתרחש בתנאים של זרימת גזירה נוזלית המציבה מגבלות ייחודיות על ההדבקה. הידבקות תחת גזירה דורשת היווצרות קשרי תפיסה מהירה ויכולת לעמוד בכוחות משיכה חזקים הנוצרים עקב תנועת נוזלים^10,11. הוכח כי הדבקה של C. albicans, Als5 מקלה על הידבקות תלוית גזירה^12,13. CpAls7 (CpALS4800) הוכח בעבר כמתווך הידבקות של Cp לתאי אפיתל, ונוקאאוט הראה ירידה באלימות במודל זיהום בדרכי השתן¹⁴. הראינו כי CpALS4800 מקדם הידבקות בתנאי גזירה של נוזלים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית¹⁵.

קולוניזציה ופתוגנזה של קנדידה נחקרו בהרחבה במודלים של בעלי חיים 16,17,18. המודלים הנפוצים ביותר הם זיהומים ברירית העכברים ובזרם הדם, אך מודלים של חסרי חוליות, כגון זחלי גלריה, נמצאים בשימוש הולך וגובר בגלל העלות הנמוכה, התפוקה המהירה והפשטות. מודלים של בעלי חיים מסכמים שלבים רבים בתהליך המחלה האנושית הן בפתוגן והן במארח, כולל תגובות חיסוניות מסתגלות ומולדות של המארח, אינטראקציות של שמרים עם רקמות ומיקרוביוטה, ותגובות שמרים לסביבת המארח. לעומת זאת, מבחני הידבקות במבחנה מאפשרים להתמקד באופן ספציפי בשלב ההדבקה, ובמניפולציה ניסיונית של משתנים כגון כוח גזירה, תנאי גידול של שמרים והיצמדות למצעים ספציפיים.

מכיוון ש-Cp מסוגל לצמוח הן בבני אדם והן במקורות סביבתיים, סביר להניח שהוא מסוגל לחוש ולהגיב לסביבות שונות. כדי לתמוך ברעיון זה, מבודדים קליניים מרובים של Cp מראים הידבקות נמוכה תחת גזירה נוזלית כאשר הם גדלים במדיום גידול השמרים הסטנדרטי, שמרים-פפטון-דקסטרוז (YPD), אך עוברים להדבקה חזקה כאשר גדלים במשך מספר שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במדיום תרבית הרקמה 199 (M199)^15,19. פרוטוקול מפורט מסופק כאן לבדיקת תפוקה בינונית המאפשרת מדידת הידבקות של דגימות שמרים מרובות הפועלות במקביל, בתנאים מוגדרים של גידול, גזירה נוזלית, טמפרטורה ומצע. הבדיקה תוכננה למקסם את יכולת השחזור, ולאפשר שימוש בבידוד קליני של Cp, כמו גם בזנים שעברו מניפולציה ניסויית במעבדה. הבדיקה כפי שתוארה כאן, עבור הידבקות Cp למצע אלבומין בסרום בקר (BSA), מדגימה כי מבודדים קליניים מציגים טווח של הידבקות, בעוד ששני זני מעבדה נפוצים, CDC317 ו-CLIB214 מראים הידבקות גרועה.

קנדידה מסווגת כאורגניזמים ברמת בטיחות ביולוגית 2 ויש לטפל בהם תוך שימוש באמצעי זהירות מתאימים.

1. גידול ואינדוקציה של זנים קליניים

1. זני Cp מפספס על תמצית שמרים 1% (m/v), 2% (m/v) פפטון, 2% (m/v) דקסטרוז (YPD) 2% (m/v) לוחות אגר, וגדלים ב-22 מעלות צלזיוס.
   הערה: ניתן לאחסן צלחות על ספסל המעבדה ולעשות בהן שימוש חוזר במהלך השבוע שלאחר מכן.
2. יום לפני בדיקת ההדבקה, העבירו כ-6 מושבות מכל זן לבקבוק ארלנמאייר (חרוטי) בנפח 250 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיום YPD. גדל בן לילה בשייקר מיקרוביולוגי המוגדר ל-250 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס.
   הערה: Cp צריך לגדול במשך 20-24 שעות כדי להגיע לשלב הנייח בתרבית נוזלית ב-37 מעלות צלזיוס.
3. בצע את השלבים הבאים ביום בדיקת ההדבקה.
   1. העבירו 1 מ"ל מהתרבות הנוזלית מבקבוק ארלנמאייר לצינור מיקרופוגה.
   2. צנטריפוגה את התרבית במהירות מרבית במיקרופוגה (16,000 x גרם) למשך 3 דקות. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל מים סטריליים וחזרו על שלב זה בסך הכל שלוש כביסות.
   3. בתום הכביסה האחרונה, השעו מחדש את הגלולה ב -1 מ"ל מים סטריליים. השתמש בקצות פיפטה רחבות בגדלים של 1 מ"ל ו-200 מיקרוליטר לטיפול במתלי שמרים במהלך שלב זה ובהמשך.
      הערה: זני דבק רבים של Cp נדבקים לדפנות בקבוק ארלנמאייר, ודורשים גירוד מכני כדי להסירם.
4. ספרו תאי שמרים באמצעות המוציטומטר או מכשיר שווה ערך. יש לדלל את תרבית השמרים כדי להגיע לריכוז סביר של 50-200 תאי שמרים. השתמש בדילול פי 500, הכניס 20 מיקרוליטר ל-10 מ"ל מים.
   הערה: רוב זני ה-Cp גדלים ל-10^{8-10 9} תאים/מ"ל בתרבית טלטול לילה ב-37 מעלות צלזיוס.
5. מדללים את תרבית השמרים עם 2 מ"ל YPD או Medium 199 (M199), בריכוז סופי של 3 x 10⁶ תאים/מ"ל בצינור מיקרופוגה של 2 מ"ל. דגירה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.

2. ציפוי תעלות מיקרופלואידיות

1. הכינו מראש תמיסה של 2% (m/v) של BSA בתמיסת המלח המאוזנת של האנק המכילה סידן ומגנזיום (HBSS+). לשם כך, מפזרים בעדינות 4 גרם אבקת BSA על פני 200 מ"ל HBSS+ ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות ללא הפרעה כדי לאפשר לחלבון להירטב ואז להתמוסס. יש לעקר את התמיסה ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. יש לחמם 2.5 מ"ל של תמיסה זו ל-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות, תוך שמירה על סטריליות.
   הערה: התחממות נחוצה כדי להפחית את היווצרות הבועות בצלחת המיקרו-ערוץ.
3. בזמן שה-BSA מתחמם, העבר את בקר המיקרופלואידיקה למכסה המנוע של תרבית הרקמות, הפעל את המכשיר והפעל את התוכנה.
4. הנח את ממשק הנוזל בתוך השדה הסטרילי, ונקה בעדינות את אטם הסיליקון עם נייר טישו נטול מוך שהורטב ב-70% אלכוהול (v/v). הימנע ממגע ממושך או חוזר של אלכוהול עם הצלחת האקרילית כדי למנוע שיגעון או סדקים של הפלסטיק.
5. יבש את הממשק (פונה כלפי מעלה) במכסה המנוע עם מערכת זרימת אוויר כדי להסיר את כל עקבות האלכוהול.
6. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת ה-BSA המחוממת מראש כטיפה בשקע המרכזי של כל אחת מתעלות ה"יציאה" (איור 1A) של צלחת 48 בארות ו-24 מיקרו-ערוצים.

איור 1. פריסת בדיקת מיקרופלואידיקה. (א) זוג תעלות, המציגות זרימת נוזל הפוכה מה"יציאה" ל"כניסה". שדות האריחים הרצופים שנלכדו על ידי המיקרוסקופ מוצגים על ידי קווים מקווקוים (1-10 עבור הערוץ העליון, ו-11-20 עבור התחתון). (ב) הגדרת תוכנת בקר מיקרופלואידיקה לזרימה הפוכה במהלך ציפוי BSA (שלב 2.10). צילומי מסך משוכפלים כאן באישור היצרן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

7. הנח את הממשק בחלק העליון של לוחית המיקרו-ערוץ, יישר את ארבעת הברגים של הממשק עם השקעים המתאימים להם בצלחת.
8. הדק את הברגים בעזרת אצבעות כפפות. שים לב שההתנגדות להידוק היד מעידה על חוסר יישור. אם זה קורה, הרם מעט את הממשק והושב אותו מחדש, והמשך להדק את הברגים.
9. כאשר הברגים מהודקים באצבעות, השתמש במפתח המומנט כדי להדק עוד יותר את הממשק.
10. באמצעות ממשק תוכנת המיקרופלואידיקה (איור 1B), הגדר את המצב לידני. השתמש באפשרות ברירת המחדל Fluid (Water@19degC) לשתי קבוצות העמודות והגדר את ההטיה ל- 1 dyn/cm^2.
    1. הפעל עמודות "יציאה" (#2,4,6,8) כדי לשאוב נוזלים לכיוון "כניסות". הפעל בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
11. בדוק ויזואלית היטב כל "כניסה" על ידי הצצה דרך החלק התחתון של לוחית המיקרו-ערוץ כדי לוודא שטיפה של תמיסת ה-BSA הצטברה בכל "כניסה". זה מאשר שכל 24 התעלות נרטבו ומולאו בהצלחה.
12. שחרר את הממשק ומלא כל באר ("כניסות" ו"שקעים") ב-250 מיקרוליטר של HBSS+ ללא BSA כדי למנוע התייבשות של תעלות והכנס את הצלחת לחממת תרביות רקמות.
    הערה: נדרשים מינימום של 48 שעות כדי שחלבונים ייספגו באופן אחיד למשטחי התעלה של לוחית המיקרו-ערוץ. לאחר ציפוי חלבון, ניתן לאחסן צלחות עד שבועיים בסביבה לחה (כגון אינקובטור תרבית רקמות עם 100% לחות רוויה) לפני השימוש במבחני הידבקות. לתקופות ארוכות יותר, עטפו צלחות בניילון פלסטיק כדי למנוע אידוי.

3. בדיקת הידבקות

1. במהלך דגירה של שמרים ב-YPD ו-M199 (שלב 1.5), שאפו בארות כניסה ויציאה של לוחית המיקרו-תעלה המצופה BSA, מבלי להפריע לתעלה העוברת מהכניסה המרכזית של כל באר (איור 1A). במקום זאת, שאפו מקצה הבאר. הוסף 1 מ"ל של HBSS+ לבארות "השקע".
2. חבר את ממשק המיקרופלואידיקה כאמור לעיל (שלב 2.5). השתמש בהגדרת ברירת המחדל של הנוזל נוזל ב-(Water@19degC) וגזירה ב-2 דין/ס"מ^2 בטמפרטורת החדר כדי לשטוף את התעלה ולהסיר כל BSA לא קשור. יש לשטוף במשך 2-3 שעות בקצב זרימה זה.
3. הסר את הממשק מלוח המיקרו-ערוץ. הפעל את יחידת מחמם הצלחת של מכשיר המיקרופלואידיקה ואשר שהיא מוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס.
4. שאפו את המדיום מכל הבארות בצלחת והוסיפו 0.5 מ"ל שמרים מושרים משלב 1.5 לכל זוג "שקעים". השעו את השמרים לחלוטין על ידי היפוך 2 צינורות 2 מ"ל 3-6 פעמים, ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה מיד לפני ההוספה לבארות. השאירו את בארות "הכניסה" ריקות.
5. הדק את ממשק הנוזלים לצלחת המיקרו-ערוצים כמו בשלב 2.5 לעיל. השתמש בתוכנת המכשיר כדי להגדיר את Fluid ל-HBSS@37degC, ואת Shear ל-5 dyn/cm^2.
   1. הפעל עמודות "יציאה" (#2,4,6,8) כדי לשאוב נוזלים לכיוון "כניסות". הפעל על מחמם הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, כדי לאפשר לשמרים להיצמד לתעלה המצופה BSA.
6. במהלך תקופה זו, הכינו את מאגר הכביסה. ל-30 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco המכילה סידן ומגנזיום (DPBS+) מוסיפים 5 מיקרומטר של calcofluor, הכלול כדי להפוך את השמרים לפלואורסצנטיים לזיהויים. יש לחמם באמבטיה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
7. בתום ההדבקה של 30 דקות, השהה את הזרימה באמצעות ממשק התוכנה מבלי לשנות תנאי זרימה אחרים. שחרר את הממשק ושאף את כל הבארות ("כניסות" ו"שקעים ").
8. הוסף 1 מ"ל של מאגר כביסה קלקופלואור ל"שקעים". חבר מחדש את ממשק הנוזלים, והמשך את הזרימה באמצעות התוכנה למשך 10 דקות נוספות. שלב זה נועד לשטוף שמרים שאינם דבקים וקשורים באופן רופף, ובמקביל להכתים שמרים פלואורסצנטיים בתעלה.
9. לאחר 10 דקות, הסר את ממשק הנוזלים והחלף במכסה. נקו בעדינות את החלק התחתון של לוחית המיקרו-ערוץ בעזרת מגבון נטול מוך והמשיכו להדמיה.

4. הדמיה וכימות

1. הנח את לוחית המיקרו-ערוצים במיקרוסקופ מתאיםtagמחזיק מחזיק. השתמש בעדשה אובייקטיבית פי 20, שתאפשר שדה ראייה כך שהערוץ ימלא כמחצית מגובה התמונה. אתר את הקצה השמאלי של ערוץ 1 (ב"כניסה" 1). כוונן את ה-stagה כך שהערוץ ימוקם כמו באיור 1A, מיקום 1.
2. רכוש תמונת שדה בהיר אחת של הערוץ. מדוד את שטח שטח התעלה במיקרומטר², באמצעות כלי מדידת המלבן על מנת לנרמל את מדידות השטח במהלך ניתוח הנתונים (ראה דיון).
3. מעבר לערוץ הפלואורסצנטי DAPI (עירור 395 ננומטר, פליטה 440/40 ננומטר) התאם את המיקוד לשמרים דבקים על המשטח התחתון של התעלה. נעל את המיקוד האוטומטי במישור זה. הגדר את עוצמת עירור הקרינה ל-1.5% ואת תנאי החשיפה למצלמה (binning 2x2, חשיפה של 15 אלפיות השנייה, 12 סיביות, רווח 4) כדי למנוע רוויה של חיישן התמונה.
4. שימוש בשלב הממונע ורכישת ND | הדמיית XY בתוכנת בקר המיקרוסקופ, לוכדת אוטומטית סדרה עוקבת של תמונות לא חופפות במרווח שדה ראייה אחד זה מזה (666 מיקרומטר) של זוג הערוצים הראשון (1/2).
   1. אספו 10 תמונות משמאל לימין עבור הערוץ העליון, הזיזו מטה 666 מיקרומטר ואספו עוד 10 מימין לשמאל עבור הערוץ התחתון (כפי שמוצג באופן סכמטי באיור 1A).
   2. השתמשו באפשרות 'XY יחסי ', כך שלאחר הגדרת מיקומי התמונה, ניתן יהיה להפעיל סדרה דומה לכל זוג ערוצים, לאחר שהתחלת הערוץ מוגדרת ידנית.
   3. איסוף תמונות בערוץ DAPI (רכישת ND | λ | DAPI).
5. עקוב אחר תמונות כדי לאשר שהערוץ נשאר בשדה הראייה כאשר השלב הממונע מזיז את הצלחת.
   הערה: כל קבוצה של 20 תמונות מצמד ערוצים תישמר אוטומטית עם קובץ עוקב file שם על ידי רכישת ND.
6. השתמש בפונקציית autostep (ניווט XYZ | שלב XY) כדי להזיז 25750 מיקרומטר למטה ל"כניסה" 3. כוונן את מיקום הערוץ באופן ידני כמו בשלב 4.1. צלם את ערכת התמונות הבאה (רכישת ND) של צמד הערוצים 3/4.
7. חזרו על תהליך זה עד שכל 12 זוגות הערוצים יצולמו והתוצאות נשמרות ב- 12 קבצים. עקוב אחר הזמנת הערוצים של היצרן בין 1-24.
8. מיזוג כל 12 הקבוצות של תמונות פלואורסצנטיות לקובץ יחיד (קובץ | מיזוג מסמכי ND). ודא שסדר הקבצים תואם לסדר שבו נלכדו 12 ערכות התמונות.
9. השתמש בבינארי | סף להפרדת שמרים מהרקע על סמך רמת הקרינה שלהם. החילו סף זהה על כל ערימת התמונות.
   הערה: סף נמוך של עוצמת גווני אפור של 12 סיביות של 500 וסף גבוה המוגדר למקסימום של 4095 הוא אופייני.
10. מדידת אזור הסף (מדידה | בצע מדידה | כל המסגרות). פתיחת הדוח (פקדי ניתוח | תוצאות מדידה אוטומטיות) ולבדוק נתונים.
    הערה: פעולה זו תיצור טבלת מדידות עבור 240 תמונות (20 תמונות מכל אחד מ-12 זוגות ערוצים), ואזור הסף עבור כל תמונה מופיע בעמודה שכותרתה BinaryArea [μm²].
11. ייצוא נתונים לקובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים (ייצוא).

באמצעות השיטות המתוארות בסעיף הפרוטוקול, הושוותה הידבקות של 6 זנים של Cp (טבלה 1)

ניתן לנתח את הנתונים הנובעים מהפרוטוקול לעיל באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני סטנדרטית. הנתונים מבוטאים כ"אינדקס הדבקה", המחושב באופן הבא: ערך השטח הבינארי עבור כל קבוצה של 10 תמונות (המייצג את כיסוי השמרים עבור ערוץ יחיד) מסוכם על פני התמונות, והממוצע וסטיית התקן מחושבים עב?...

ללא גילויים.

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מפרופסור וויליאם ומרי או-וויליאם ואלזה זופי ברפואת ילדים למחקר סביב הלידה, ליבת המחקר של קילגוס ופרס פיתוח מוסדי (IDeA) מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מענק מספר P30GM114750.