التصاق المبيضات بزلالوم مصل الأبقار تحت القص السائل

الالتصاق هو خطوة أولى مهمة في الاستعمار والتسبب في المبيضات. هنا ، يتم وصف الفحص في المختبر لقياس التصاق C. parapsilosis عزلات للبروتينات المجمدة تحت قص السوائل. يتم استخدام جهاز الموائع الدقيقة متعدد القنوات لمقارنة عينات متعددة بالتوازي ، متبوعا بالقياس الكمي باستخدام التصوير الفلوري.

المطثية البالوبسيلوسيس (Cp) هو سبب ناشئ لالتهابات مجرى الدم لدى بعض السكان. تعمل كليد المبيضات ، بما في ذلك CP ، على تطوير مقاومة متزايدة للسطرين الأول والثاني من مضادات الفطريات. غالبا ما يتم عزل Cp عن اليدين وأسطح الجلد ، وكذلك الجهاز الهضمي. الاستعمار بواسطة المبيضات يهيئ الأفراد للإصابة بالتهابات مجرى الدم الغازية. لاستعمار المضيف أو غزوه بنجاح ، يجب أن تكون الخميرة قادرة على الالتصاق بسرعة بأسطح الجسم لمنع القضاء عليها بواسطة آليات دفاع المضيف. نصف هنا طريقة لقياس التصاق Cp بالبروتينات المجمدة تحت قص السوائل الفسيولوجية ، باستخدام مقايسة التصاق نقطة النهاية في جهاز موائع دقيقة متعدد القنوات متاح تجاريا. تم تحسين هذه الطريقة لتحسين قابلية التكاثر ، وتقليل الذاتية ، والسماح بالقياس الكمي الفلوري للعزلات الفردية. نوضح أيضا أن بعض العزلات السريرية ل Cp تظهر زيادة الالتصاق عند نموها في ظروف تحاكي مضيف الثدييات ، في حين أن سلالة المختبر المستخدمة بشكل متكرر ، CDC317 ، غير لاصقة تحت قص السوائل.

المبيضات هي كائنات متعايشة شائعة على جلد الإنسان والغشاء المخاطي يمكن أن تؤدي إلى أمراض غازية بين الأشخاص الذين يعانون من نقص المناعة مع مراضة ووفيات كبيرة مرتبطة بها وتكلفتها^1،2،3. على الرغم من أن المطثية البيضاء لا تزال سببا مهما لهذه العدوى ، إلا أن الأنواع غير البيضاء مثل C. parapsilosis و C. glabrata و C. krusei و C. tropicalis و C. auris يتم التعرف عليها بشكل متزايد ، خاصة في الفئات السكانية الضعيفة وذات المقاومة المتكررة للأدوية المضادة للفطريات^{المتاحة 4}. تقدم الأنواع غير البيضاء عناصر مميزة من علم الأحياء والتسبب في المرض قيد التحقيق النشط.

الالتصاق هو خطوة أولى مهمة في الاستعمار والتسبب في المرض. لذلك قد يوفر التدخل في هذه الخطوة فرصة لوقف تطور المرض في مرحلة مبكرة. ركزت دراسات التصاق المبيضات وغزوها في الغالب على الظروف الثابتة^5،6. ساعدت هذه الدراسات في تحديد بنية ووظائف الالتصاقات الفطرية في المرض^7،8،9. ومع ذلك ، يجب أن يحدث الالتصاق في مجرى الدم ، والجهاز الهضمي (GI) ، والمسالك البولية ، وفي القسطرة في ظل ظروف تدفق قص السوائل التي تضع قيودا فريدة على الالتصاق. يتطلب الالتصاق تحت القص تشكيلا سريعا لرابطة الصيد والقدرة على تحمل قوى السحب القوية الناتجة عن حركة السوائل^10،11. ال C. albicans اللاصق ، Als5 وقد ثبت أنه يسهل الالتصاق المعتمد على القص^12،13. لقد ثبت سابقا أن CpAls7 (CpALS4800) يتوسط في التصاق Cp بالخلايا الظهارية ، وأظهرت الضربة القاضية انخفاضا في الفوعة في نموذج عدوى المسالك^{البولية 14}. لقد أظهرنا أن CpALS4800 يعزز الالتصاق في ظل ظروف قص السوائل ذات الصلة من الناحية^{الفسيولوجية 15}.

تمت دراسة استعمار المبيضات والتسبب في المرض على نطاق واسع في النماذج الحيوانية^16،17،18. النماذج الأكثر استخداما هي التهابات الغشاء المخاطي ومجرى الدم في الفئران ، لكن نماذج اللافقاريات ، مثل يرقات الغاليريا ، يتم استخدامها بشكل متزايد بسبب التكلفة المنخفضة والإنتاجية السريعة والبساطة. تلخص النماذج الحيوانية العديد من خطوات عملية المرض البشري في كل من العامل الممرض والمضيف ، بما في ذلك الاستجابات المناعية التكيفية والفطرية للمضيف ، وتفاعلات الخميرة مع الأنسجة والميكروبات ، واستجابات الخميرة للبيئة المضيفة. في المقابل ، تسمح فحوصات الالتصاق المختبري بالتركيز بشكل خاص على خطوة الالتصاق ، وعلى التلاعب التجريبي بالمتغيرات مثل قوة القص ، وظروف نمو الخميرة ، والالتصاق بركائز معينة.

نظرا لأن Cp قادر على النمو في كل من البشر والمصادر البيئية ، فمن المحتمل أن يكون قادرا على استشعار البيئات المختلفة والاستجابة لها. دعما لهذه الفكرة ، تظهر العزلات السريرية المتعددة ل Cp التصاق منخفض تحت قص السوائل عند زراعتها في وسط نمو الخميرة القياسي ، الخميرة - البيبتون - سكر العنب (YPD) ، ولكنها تتحول إلى التصاق قوي عند نموها لبضع ساعات عند 37 درجة مئوية في وسط زراعة الأنسجة 199 (M199) ^15،19. يتم توفير بروتوكول مفصل هنا لمقايسة الإنتاجية المتوسطة التي تسمح بقياس التصاق عينات الخميرة المتعددة التي تعمل بالتوازي ، في ظل ظروف محددة من النمو وقص السوائل ودرجة الحرارة والركيزة. تم تصميم الاختبار لزيادة قابلية التكاثر إلى أقصى حد ، وللسماح باستخدام العزلات السريرية ل Cp ، بالإضافة إلى السلالات التي تم التلاعب بها تجريبيا في المختبر. يوضح الاختبار كما هو موضح هنا ، للتصاق Cp بركيزة ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، أن العزلات السريرية تظهر مجموعة من الالتصاق ، في حين أن سلالتين معمليتين شائعة الاستخدام ، CDC317 و CLIB214 تظهر ضعف التصاق.

المبيضات spp. تصنف على أنها كائنات من المستوى 2 من السلامة البيولوجية ويجب التعامل معها باستخدام الاحتياطات المناسبة.

1. نمو وتحريض السلالات السريرية

1. سلالات Streak Cp على مستخلص الخميرة 1٪ (م / حجم) ، 2٪ (م / حجم) بيبتون ، 2٪ (م / حجم) سكر العنب (YPD) 2٪ (م / حجم) ألواح أجار ، وتنمو عند 22 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق على مقعد المختبر وإعادة استخدامها خلال الأسبوع التالي.
2. في اليوم السابق لمقايسة الالتصاق ، انقل ما يقرب من 6 مستعمرات من كل سلالة إلى قارورة Erlenmeyer (مخروطية) سعة 250 مل تحتوي على 10 مل من وسط YPD. تنمو بين عشية وضحاها في شاكر ميكروبيولوجي مضبوطة على 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: يجب أن ينمو Cp لمدة 20-24 ساعة للوصول إلى المرحلة الثابتة في الثقافة السائلة عند 37 درجة مئوية.
3. قم بتنفيذ الخطوات التالية في يوم فحص الالتصاق.
   1. انقل 1 مل من المزرعة السائلة من قارورة Erlenmeyer إلى أنبوب ميكرو فوج.
   2. جهاز الطرد المركزي للثقافة بأقصى سرعة في ميكرو فوج (16,000 × جم) لمدة 3 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الماء المعقم وكرر هذه الخطوة لما مجموعه ثلاث غسلات.
   3. في نهاية الغسيل الأخير ، قم بتعليق الحبيبات في 1 مل من الماء المعقم. استخدم أطراف ماصة ذات فتحة عريضة بأحجام 1 مل و 200 ميكرولتر للتعامل مع تعليق الخميرة أثناء هذه الخطوات والخطوات اللاحقة.
      ملاحظة: تلتصق العديد من السلالات اللاصقة من Cp بجوانب قارورة Erlenmeyer ، وتتطلب كشطا ميكانيكيا لإزالتها.
4. عد خلايا الخميرة باستخدام مقياس كثافة الدم أو جهاز مكافئ. خفف ثقافة الخميرة لتحقيق تركيز قابل للعد بشكل معقول من 50-200 خلية خميرة. استخدم مخففا بمقدار 500 ضعفا ، ضع 20 ميكرولتر في 10 مل من الماء.
   ملاحظة: تنمو معظم سلالات Cp إلى 10^{8-10 9} خلايا / مل في ثقافة اهتزاز بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
5. قم بتخفيف مزرعة الخميرة ب 2 مل من YPD أو Medium 199 (M199) ، بتركيز نهائي 3 × 10⁶ خلايا / مل في أنبوب ميكرو فوج سعة 2 مل. احتضن في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.

2. طلاء القنوات الموائع الدقيقة

1. قم بإعداد محلول 2٪ (م / حجم) مسبقا من BSA في محلول الملح المتوازن من Hank الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم (HBSS +). للقيام بذلك ، قم برش 4 جم من مسحوق BSA برفق على سطح 200 مل من HBSS + واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة دون إزعاج للسماح للبروتين بالتبلل ثم الذوبان. قم بتعقيم المحلول بتصفية وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
2. قم بتسخين 2.5 مل من هذا المحلول إلى 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل ، مع إبقائه معقما.
   ملاحظة: الاحترار ضروري لتقليل تكوين الفقاعة في لوحة القناة الدقيقة.
3. أثناء ارتفاع درجة حرارة BSA ، انقل وحدة التحكم في الموائع الدقيقة إلى غطاء مزرعة الأنسجة ، وقم بتشغيل الجهاز وابدأ تشغيل البرنامج.
4. ضع واجهة السوائل داخل الحقل المعقم ، وقم بتنظيف حشية السيليكون برفق باستخدام مناديل ورقية خالية من النسالة مبللة بالكحول بنسبة 70٪ (حجم / حجم). تجنب ملامسة الكحول لفترات طويلة أو متكررة مع لوحة الأكريليك لمنع جنون البلاستيك أو تكسيره.
5. جفف الواجهة بالهواء (متجهة لأعلى) في غطاء المحرك باستخدام نظام تدفق الهواء لإزالة جميع آثار الكحول.
6. أضف 100 ميكرولتر من محلول BSA الدافئ مسبقا كقطرة في المسافة البادئة المركزية لكل قناة من قنوات "المخرج" (الشكل 1 أ) للوحة 48 بئر ، 24 قناة دقيقة.

الشكل 1. تخطيط فحص الموائع الدقيقة. (أ) زوج من القنوات، يبين تدفق السوائل العكسي من "المخرج" إلى "المدخل". يتم عرض الحقول المتتالية المتتالية التي تم التقاطها بواسطة المجهر بخطوط منقطة (1-10 للقناة العلوية ، و 11-20 للقناة السفلية). (ب) إعداد برنامج التحكم في الموائع الدقيقة للتدفق العكسي أثناء طلاء BSA (الخطوة 2.10). لقطات الشاشة المستنسخة هنا بإذن من الشركة المصنعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

7. ضع الواجهة في الجزء العلوي من لوحة القناة الدقيقة ، وقم بمحاذاة البراغي الأربعة للواجهة مع المقابس المقابلة لها في اللوحة.
8. شد البراغي باستخدام أصابع القفازات. اعلم أن مقاومة شد اليد تشير إلى اختلال المحاذاة. إذا حدث هذا ، ارفع الواجهة قليلا وأعد تثبيتها ، واستأنف تثبيت البراغي.
9. عندما تكون البراغي محكمة الإصبع ، استخدم مفتاح عزم الدوران لإحكام الواجهة بشكل أكبر.
10. باستخدام واجهة برنامج الموائع الدقيقة (الشكل 1 ب) ، اضبط الوضع على يدوي. استخدم خيار Fluid الافتراضي (Water@19degC) لكلتا مجموعتي الأعمدة واضبط القص على 1 dyn/cm^2.
    1. قم بتنشيط أعمدة "المخرج" (# 2،4،6،8) لضخ السائل نحو "المداخل". تشغيل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
11. افحص بصريا كل "مدخل" جيدا من خلال النظر من خلال الجزء السفلي من لوحة القناة الدقيقة للتأكد من أن قطرة من محلول BSA قد تم تجميعها في كل "مدخل". هذا يؤكد أن جميع القنوات ال 24 قد تم ترطيبها وملؤها بنجاح.
12. قم بفك الواجهة وقم بتعبئة كل بئر ("مداخل" و "منافذ") ب 250 ميكرولتر من HBSS + بدون BSA لمنع جفاف القنوات ووضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة.
    ملاحظة: مطلوب ما لا يقل عن 48 ساعة لامتصاص البروتينات بشكل موحد على أسطح القناة للوحة القناة الدقيقة. بعد طلاء البروتين ، يمكن تخزين الألواح لمدة تصل إلى أسبوعين في بيئة رطبة (مثل حاضنة زراعة الأنسجة ذات الرطوبة المشبعة بنسبة 100٪) قبل استخدامها في فحوصات الالتصاق. لفترات أطول ، لف الألواح بغشاء بلاستيكي لمنع التبخر.

3. فحص الالتصاق

1. أثناء حضانة الخميرة في YPD و M199 (الخطوة 1.5) ، قم بشفط آبار مدخل ومخرج لوحة القنوات الدقيقة المطلية ب BSA ، دون إزعاج القناة التي تمتد من المسافة البادئة المركزية لكل بئر (الشكل 1 أ). بدلا من ذلك ، استنشق من حافة البئر. أضف 1 مل من HBSS + إلى آبار "المخرج".
2. قم بتوصيل واجهة الموائع الدقيقة على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 2.5). استخدم إعداد السائل الافتراضي السائل عند (Water@19degC) والقص عند 2 دين/سم^2 في درجة حرارة الغرفة لغسل القناة وإزالة أي BSA غير مرتبط. يغسل لمدة 2-3 ساعات بمعدل التدفق هذا.
3. قم بإزالة الواجهة من لوحة القناة الدقيقة. قم بتشغيل وحدة تسخين اللوحة الخاصة بجهاز الموائع الدقيقة وتأكد من ضبطها على 37 درجة مئوية.
4. قم بشفط الوسط من جميع الآبار الموجودة على اللوحة وأضف 0.5 مل من الخميرة المستحثة من الخطوة 1.5 إلى كل زوج من "المنافذ". أعد تعليق الخميرة تماما عن طريق قلب الأنابيب سعة 2 مل 3-6 مرات ، وقم بعمل الماصة برفق لأعلى ولأسفل مباشرة قبل إضافة الآبار. اترك آبار "المدخل" فارغة.
5. اربط واجهة السوائل بلوحة القناة الدقيقة كما في الخطوة 2.5 أعلاه. استخدم برنامج الجهاز لضبط Fluid على HBSS@37degC ، و Shear إلى 5 dyn/cm ^ 2.
   1. قم بتنشيط أعمدة "المخرج" (# 2،4،6،8) لضخ السائل نحو "المداخل". قم بتشغيله على سخان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، للسماح للخميرة بالالتصاق بالقناة المطلية ب BSA.
6. خلال هذا الوقت ، قم بإعداد مخزن الغسيل. إلى 30 مل من محلول ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS +) أضف 5 ميكرومتر من الكالكوفلور ، والذي يتم تضمينه لجعل الخميرة فلورية لاكتشافها. تدفئ في الحمام عند 37 درجة مئوية.
7. في نهاية الالتصاق لمدة 30 دقيقة، أوقف التدفق مؤقتا باستخدام واجهة البرنامج دون تغيير ظروف التدفق الأخرى. قم بفك الواجهة واستنشاق جميع الآبار ("المداخل" و "المنافذ").
8. أضف 1 مل من محلول غسيل الكالكوفلور إلى "المنافذ". أعد توصيل واجهة الموائع ، واستأنف التدفق باستخدام البرنامج لمدة 10 دقائق أخرى. تم تصميم هذه الخطوة لغسل الخميرة غير الملتصقة والملتصقة بشكل فضفاض ، وفي نفس الوقت تلطيخ الخميرة الفلورية في القناة.
9. بعد 10 دقائق ، قم بإزالة واجهة السوائل واستبدلها بغطاء. نظف الجزء السفلي من لوحة القناة الدقيقة برفق بمنديل خال من النسالة وانتقل إلى التصوير.

4. التصوير والقياس الكمي

1. ضع لوحة القناة الدقيقة في حامل مرحلة مجهر مناسب. استخدم عدسة موضوعية 20x ، والتي ستسمح بمجال رؤية بحيث تملأ القناة ما يقرب من نصف ارتفاع الصورة. حدد موقع الطرف الأيسر من القناة 1 (في "المدخل" 1). اضبط المرحلة بحيث يتم وضع القناة كما في الشكل 1 أ ، الموضع 1.
2. احصل على صورة واحدة للحقل الساطع للقناة. قم بقياس مساحة مساحة القناة بالميكرومتر² ، باستخدام أداة قياس المستطيل لتطبيع قياسات المنطقة أثناء تحليل البيانات (انظر المناقشة).
3. يؤدي التبديل إلى قناة الفلورسنت DAPI (الإثارة 395 نانومتر ، الإرسال 440/40 نانومتر) إلى ضبط التركيز البؤري على الخميرة الملتصقة على السطح السفلي للقناة. قفل التركيز البؤري التلقائي في هذه المستوى. اضبط شدة الإثارة الفلورية على 1.5٪ وظروف التعرض للكاميرا (تجميع 2x2 ، تعريض ضوئي 15 مللي ثانية ، 12 بت ، كسب 4) لتجنب تشبع مستشعر الصورة.
4. استخدام المرحلة الآلية واكتساب ND | يلتقط XY Imaging في برنامج التحكم في المجهر تلقائيا سلسلة متتالية من الصور غير المتداخلة متباعدة مجال رؤية واحد (666 ميكرومتر) من زوج القناة الأولى (1/2).
   1. اجمع 10 صور من اليسار إلى اليمين للقناة العلوية ، وقم بتحريك 666 ميكرومتر لأسفل واجمع 10 صور أخرى من اليمين إلى اليسار للقناة السفلية (كما هو موضح بشكل تخطيطي في الشكل 1 أ).
   2. استخدم الخيار Relative XY ، بحيث بمجرد تحديد مواضع الصورة ، يمكن تشغيل سلسلة مماثلة لكل زوج من القنوات ، بعد تحديد بداية القناة يدويا.
   3. جمع الصور في قناة DAPI (اكتساب ND | λ | DAPI).
5. راقب الصور للتأكد من بقاء القناة داخل مجال الرؤية حيث تحرك المرحلة الآلية اللوحة.
   ملاحظة: سيتم حفظ كل مجموعة من 20 صورة من زوج قنوات تلقائيا باسم ملف متتالي عن طريق الحصول على ND.
6. استخدم وظيفة autostep (XYZ Navigation | الخطوة XY) لتحريك 25750 ميكرومتر لأسفل إلى "المدخل" 3. ضبط موضع القناة يدويا كما في الخطوة 4.1. التقط المجموعة التالية من الصور (اكتساب ND) لزوج القنوات 3/4.
7. كرر هذه العملية ، حتى يتم تصوير جميع أزواج القنوات ال 12 ، مع حفظ النتائج في 12 ملفا. اتبع طلب الشركة المصنعة للقنوات من 1 إلى 24.
8. دمج جميع مجموعات الصور الفلورية البالغ عددها 12 في ملف واحد (ملف | دمج مستندات ND). تأكد من أن ترتيب الملفات يطابق الترتيب الذي تم التقاط مجموعات الصور ال 12 به.
9. استخدام ثنائي | عتبة لفصل الخميرة عن الخلفية بناء على مستوى تألقها. قم بتطبيق نفس الحد على مجموعة الصور بأكملها.
   ملاحظة: عادة ما يكون الحد الأدنى لشدة التدرج الرمادي 12 بت البالغ 500، والحد العالي الذي تم ضبطه على الحد الأقصى 4095 أمرا نموذجيا.
10. قياس منطقة العتبة (القياس | إجراء القياس | جميع الإطارات). فتح التقرير (عناصر تحكم التحليل | نتائج القياس الآلي) والتحقق من البيانات.
    ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى إنشاء جدول قياسات ل 240 صورة (20 صورة من كل زوج من 12 زوجا من القنوات)، ويتم سرد منطقة العتبة لكل صورة في العمود المسمى BinaryArea [μm²].
11. تصدير البيانات إلى ملف نصي محدد بعلامات جدولة (تصدير).

باستخدام الطرق الموضحة في قسم البروتوكول ، تمت مقارنة التصاق 6 سلالات من Cp (الجدول 1)

يمكن تحليل البيانات الناتجة عن البروتوكول أعلاه باستخدام برنامج جداول بيانات قياسي. يتم التعبير عن البيانات ك "مؤشر الالتصاق" ، والذي يتم حسابه على النحو التالي: يتم جمع قيمة BinaryArea لكل مجموعة من 10 صور (تمثل تغطية الخميرة لقناة واحدة) عبر الصور ، ويتم حساب المتوسط والانحرا...

لا إفصاحات.

تم دعم هذا العمل بمنحة من أستاذية ويليام وماري أوه ويليام وإلسا زوفي في طب الأطفال لأبحاث الفترة المحيطة بالولادة ، ومركز أبحاث كيلجوس ، وجائزة التطوير المؤسسي (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب المنحة رقم P30GM114750.