체외(In Vitro ) H5N1 특이적 덕 T 세포 배양 및 세포 내 사이토카인 염색 방법을 사용한 면역 반응 검출

이 프로토콜은 감염된 오리에서 기억 T 세포를 분리하여 시험 관 내에서 조류 T 세포를 배양하는 방법을 설명하며, 이를 통해 고도로 정제된 특정 오리 T 세포를 생성할 수 있습니다. 또한 오리 T 세포에서 IFN-γ 분비를 정확하게 측정하기 위해 세포 내 사이토카인 염색(ICS) 방법이 확립되었습니다.

T 세포의 체외 배양은 면역 반응, 바이러스 감염 및 잠재적 치료 전략을 연구하는 데 중요한 방법입니다. 그러나 조류 T 세포 를 in vitro 에서 배양하기 위해 확립된 프로토콜은 현재까지 보고되지 않았습니다. 본 연구에서는 고병원성 조류인플루엔자(HPAIV) H5N1 바이러스를 모델로 하여 최초로 프로토콜을 제시하였다. 여기에서 4주 된 오리가 바이러스에 감염되었고, 감염 후 28일 후에 기억 T 림프구를 분리하여 H5N1 특이적 오리 T 림프구를 배양하여 H5N1 바이러스에 대한 특이적 면역 반응을 조사할 수 있었습니다. 프로토콜의 주요 단계에는 감염된 오리로부터 기억 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하고, 6시간 동안 최적의 감염 다중성(MOI = 5)으로 항원 제시 세포(APC)를 활성화하고, 재조합 IL-2 및 기타 특정 첨가제로 보충된 T 세포 배양 배지를 준비하는 것이 포함됩니다. T 세포 증식, 사이토카인 분비 및 세포 독성 활성은 프로세스 전반에 걸쳐 면밀히 모니터링되었습니다. 또한, 오리 T 세포에서 IFN-γ 분비를 정량화하기 위해 세포 내 사이토카인 염색 프로토콜을 수립했습니다. 여기에는 duck IFN-γ에 특이적인 IgG3κ 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주를 생성한 후 성공적인 항체 정제가 포함되었습니다. 정제된 항체를 1:10으로 희석하고 유세포 분석에 적용하여 IFN-γ 분비를 정밀하게 측정했습니다. 이 방법은 오리 T 세포 반응을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 도구를 제공하며 조류 바이러스 면역학에 대한 향후 연구를 위한 토대를 마련합니다.

T 세포의 활성화, 증식, 분화 및 기억 T 세포로의 전환 과정은 항원 특이적 면역 반응의 핵심입니다¹. 초기에 T 세포는 T 세포 수용체 (TCR)가 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에 의해 항원 제시 세포 (APC) 표면에 제시된 항원 펩타이드를 인식 할 때 활성화됩니다^{2 , 3}. 이 활성화 과정은 TCR이 MHC 분자에 결합하는 것뿐만 아니라 T 세포 기능을 완전히 활성화하는 데 중요한 공동 자극 신호의 조정을 필요로 합니다⁴. 일단 활성화되면, T 세포는 빠르게 증식 단계로 들어가 원래 T 세포와 동일한 항원 특이성을 공유하는 수많은 클론을 생성합니다. 이 증식 단계에서 T 세포는 기능에 따라 주로 CD8⁺ T 세포와 CD4⁺ T 세포로 분화합니다⁵. 이렇게 분화된 세포는 각각 세포독성 사멸을 매개하고 면역 반응을 지원합니다. 초기 감염 후, 활성화된 T 세포의 일부는 수명이 긴 기억 T 세포로 변형된다⁶. 이러한 기억 T 세포는 면역 체계에 장기간 남아 있을 수 있으며, 재노출 시 동일한 병원체에 빠르게 반응할 수 있습니다. 그 결과, 이들은 더 강력하고 효율적인 면역 반응을 일으켜 숙주에 장기적인 면역 보호를 제공한다⁷. 이 전체 과정은 백신의 효능과 내구성을 개선하는 데 도움이 되기 때문에 T세포 백신 설계에 매우 중요합니다⁸.

이러한 맥락에서 항원 특이적 T 세포를 in vitro에서 배양하는 것이 필수적입니다. 이 프로토콜은 조류 면역 체계에 필요한 적응과 함께 인간 T 세포의 체외 배양을 위해 확립된 방법을 기반으로 개발되었습니다⁹. 연구자들은 이러한 세포를 체외로 성장시킴으로써 활성화, 증식, 분화, 기억 형성 등 다양한 면역 상태에서 T세포 반응을 연구할 수 있다¹⁰. 이 체외 접근법은 면역 반응에서 T 세포가 수행하는 역할을 이해하는 데 매우 중요합니다. 또한, 체외 배양 조건 하에서 T 세포에 의한 사이토카인(예: IFN-γ)의 분비를 모니터링할 수 있습니다^11,12. 이 모니터링은 면역 반응의 품질, 강도 및 지속성을 평가하고 T 세포와 다른 면역 세포 간의 상호 작용을 연구하는 데 중요합니다. 또한, 항원 특이적 T 세포의 체외 증식은 대규모 농축을 가능하게 하고, 검출 민감도를 증가시키며, T 세포 반응 수준의 평가를 향상시킵니다¹³. 따라서 항원 특이적 T 세포의 체외 배양은 면역 반응에서 가금류 T 세포의 역할을 더 잘 이해할 수 있는 강력한 도구 역할을 하며, 이는 검출 민감도를 높이고 T 세포 반응 수준의 평가를 향상시킵니다. 유사한 체외 방법이 포유류 시스템에서 잘 확립되어 있지만 조류 종에 이러한 기술을 적용하는 것은 여전히 제한적입니다. 이는 T 세포 반응을 분석하기 위한 도구가 개발되지 않은 가금류 면역학과 특히 관련이 있습니다. 특히 오리는 여러 조류 인플루엔자 바이러스의 자연 저장소로 작용하지만, 항원 특이적 T 세포 면역에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 따라서 조류 시스템에 맞춘 표준화된 체외 T 세포 배양 프로토콜을 개발하는 것은 가금류의 기초 연구와 응용 면역학을 모두 발전시키는 데 필수적입니다.

이러한 과정에 관여하는 핵심 사이토카인은 주로 CD8⁺ T 세포, 1형 CD4⁺ T 세포 및^{NK 세포 14}에서 생성되는 II형 인터페론인 IFN-γ입니다. IFN-γ는 바이러스 복제를 억제하고 면역 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 한다¹⁵. IFN-γ의 발현 수준은 면역 상태를 반영하고 T 세포 활성화에 대한 마커 역할을 하여 연구자가 발현을 통해 T 세포 반응 수준을 평가할 수 있도록 합니다^16,17. 면역 세포에서 사이토카인 발현을 감지하는 일반적인 방법 중 하나는 세포 내 사이토카인 염색(ICS)^18,19입니다. 그러나 실험 재료와 기술의 한계로 인해 오리에 대한 연구는 포유류에 비해 뒤쳐져 있다⁵. 현재 많은 연구자들이 IFN-γ 발현 수준을 측정하기 위해 qPCR에 의존하고 있지만, 이 방법에는 몇 가지 한계가 있습니다¹¹. 우리 연구실에서는 유세포 분석과 호환되는 duck IFN-γ에 대한 항체를 성공적으로 개발했습니다. 이러한 성공을 바탕으로 이 연구에서는 오리 T 세포에서 IFN-γ 단백질 발현을 검출하는 ICS 방법을 확립하여 오리 T 세포 반응에 대한 추가 연구를 위한 신뢰할 수 있는 도구를 제공했습니다.

사용 가능한 모든 조류 인플루엔자 A(H5N1) 바이러스에 대한 모든 실험은 South China Agricultural University(CNAS BL0011)의 프로토콜에 따라 동물 생물 안전성 3등급 실험실 및 동물 시설에서 수행되었습니다. 모든 동물 연구 프로젝트는 화남농업대학교(South China Agriculture University)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(식별 코드 2021f154, 2021년 7월 29일)의 승인을 받았습니다. 모든 동물 절차는 본 위원회가 제정한 규정 및 지침과 동물 복지에 대한 국제 표준에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 동물은 수컷과 암컷을 모두 포함하여 4주 된 국내 청둥오리(Anas platyrhynchos domestica)였으며 체중은 500g에서 600g 사이였습니다.

1. Duck PBMC 격리 및 단일 세포 현탁액의 준비

1. 각 오리의 경정맥에서 헤파린화된 혈액 2mL를 수집하고 EDTA 함유 튜브로 옮겨 각 오리의 응고를 방지합니다.
2. 제공된 샘플을 사용하여 혈액을 희석합니다.amp림프구 분리 키트 또는 PBS에서 희석제. 파스퇴르 피펫으로 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다. 일반적인 희석 비율은 혈액과 희석제의 1:1입니다.
3. 희석된 혈액과 동일한 부피의 림프구 분리 용액을 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 림프구 분리 용액 위에 혈액 현탁액을 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 혼합물을 400 x g, 25°C에서 15분 동안 원심분리하고 하강 가속도를 1로 설정합니다.
   참고: 림프구 분리 용액의 양은 4mL 이상이어야 합니다. 림프구 분리 솔루션 키트의 구성 요소는 Table of Materials에서 확인할 수 있습니다.
4. 원심분리 후 원심분리기 튜브의 4개의 뚜렷한 층을 위에서 아래로 관찰합니다. 최상층은 샘플 희석제, 환형 유백색 림프구층, 분리 용액, 하단층은 적혈구로 구성됩니다.
5. 피펫을 조심스럽게 사용하여 두 번째 층인 환형 유백색 림프구 층을 수집하고 새 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 세척액 10mL를 넣어 세포와 섞습니다.
6. 실온에서 5분 동안 440 x g 에서 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 폐기한 다음 세포 계수를 위해 10mL의 RPMI 1640 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
7. 선택 사항) 샘플을 추가로 정제하려면 440 x g 에서 5분 동안 원심분리한 후 적혈구 용해 버퍼를 사용하여 남아 있는 혼합 혈액 세포를 제거합니다.

2. 체외 H5N1 AIV 특이적 T 세포 배양

1. 오리 농장에서 2주 된 건강한 청둥오리(Sheldrake)를 구입하여 음압 아이솔레이터에 보관합니다. 실험 전에 HI(hemagglutination inhibition) 분석을 사용하여 오리가 AIV에 대해 음성인지 확인합니다. 4주 된 오리를 H5N1 AIV 1 x 10⁶, 50% 알 감염 선량[EID50]/0.2mL으로 비강 내 감염시킵니다.
2. 1단계에서 설명한 방법에 따라 감염 후 28일이 지나면 H5N1에 감염된 오리로부터 기억 PBMC를 분리합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포 현탁액을 0.08% 트리판 블루로 1:1 비율로 희석하고 광학 현미경에서 생존 가능한(염색되지 않은) 세포를 수동으로 계수합니다.
   참고: 이전에 발표된 연구²⁰에서 뒷받침된 바와 같이, 감염 후 28일에 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMC)는 기억 T 세포가 풍부한 것으로 간주됩니다. 이 단계에서는 효과기 단계가 가라앉고 기억 세포 집단이 우세합니다.
3. 농도를 3 x 10⁶ cells/mL로 설정하고 48웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 배지를 추가합니다.
4. 분리된 PBMC를 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스(AIV)와 동시 감염시켜 APC 역할을 합니다. 바이러스 용량은 MOI = 5입니다. 37°C에서 1시간 동안 PBMC를 바이러스와 함께 배양합니다. 15분마다 손으로 부드럽게 흔듭니다.
5. 감염 1시간 후 PBS로 세포를 2회 세척하여 결합되지 않은 바이러스 입자를 제거합니다. 세척된 PBMC를 1mL의 T 세포 배양 배지에 재현탁시키고 부유 세포를 37°C에서 5시간 동안 추가로 배양합니다.
6. 실온에서 5분 동안 440 x g 에서 셀을 원심분리합니다. 그 후, 배양된 항원제시세포(APC)를 100μL의 T세포 배양배지에 재현탁시키고 이펙터 세포에 첨가합니다. 항원제시세포(antigen-presenting cell)와 효과세포(effector cell)의 비율은 1:5가 되어야 한다.
7. 37°C의 5%_CO2 분위기에서 14일 동안 세포를 배양합니다. 2일마다 세포 배양 상등액의 절반을 조심스럽게 피펫팅하여 새로운 T 세포 배지로 교체하여 균일한 분포를 보장합니다. 세포를 포함하는 배지의 절반을 버리고 동일한 부피의 새 배지를 추가합니다.
8. 7일째에는 광학 현미경으로 세포를 100배 관찰합니다.
9. PBS 처리된 메모리 PBMC를 자극되지 않은 대조군으로 사용합니다.

3. T 세포 증식을 모니터링하기 위한 Carboxy fluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE)

1. 세포 밀도를 0.5-1 x 10⁷ cells/mL로 조정하고 440 x g 에서 5분 동안 원심분리 후 5mL의 PBS로 세포를 재현탁합니다.
2. 10mM 스톡을 5mL의 사전 냉각된 PBS로 1μM CFSE로 희석합니다. 어둠 속에서 작동하십시오.
3. 두 개의 원심분리 튜브를 45°로 기울이고 파스퇴르 피펫으로 세포 현탁액에 CFSE 희석액을 첨가하고 잘 섞은 다음 37°C 수조에 넣어 어둠 속에서 15분 동안 둡니다.
4. 5% FBS를 함유한 예냉각된 PBS 10량에 세포를 희석하여 세포를 세척하고, 440 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 침전한 후 상등액을 폐기합니다. 세척을 2회 반복합니다.
5. 2단계에 따라 체외에서 CFSE로 표지된 세포를 자극합니다. 증식 분석이 완료되면 세포를 수확하고 유세포 분석으로 분석합니다.

4. CD8⁺ T 및 CD4⁺ T 세포의 증식을 위한 유세포 분석

1. 7일간의 배양 후 각 웰에서 모든 세포를 수집하고 분석을 위해 두 개의 유동 튜브로 나눕니다.
2. 세포를 새 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 440 x g 에서 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
3. 100μL의 항체 칵테일(마우스 안티 덕 CD8, 1:50 또는 마우스 안티 덕 CD4, 1:50)을 추가하고 4°C의 어둠 속에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
4. 세포를 새 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 440 x g 에서 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
5. 100μL의 항체 칵테일(FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgG2b, 1:50)을 추가하고 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
6. 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 PBS 1mL로 세포를 한 번 세척합니다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 게이팅 전략은 보충 그림 1에 나와 있습니다.

5. qPCR을 이용한 시그니처 유전자 발현 분석에 의한 T-세포 반응

1. T 세포 배양이 끝나면 세포 수를 세고 1.5mL 원심분리 튜브에 모은 다음 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액은 조심스럽게 버리십시오.
2. RNA 추출
   참고: RNA 오염을 방지하기 위해 흄 후드 또는 매우 깨끗한 벤치에서 추출을 수행할 수 있습니다.
   1. 제조업체의 지침에 따라 키트에 제공된 용해 버퍼를 사용하여 세포를 용해합니다. 용해된 샘플을 gDNA-Filter Column(수집 튜브에 미리 배치됨)으로 옮기고, 30초 동안 13,400 x g 에서 원심분리하고, 컬럼을 버리고, 여과액을 수집합니다. 여과액에 0.5부피의 절대 에탄올을 첨가합니다. 철저히 섞는다.
      알림: 에탄올 첨가 후 용액이 흐리거나 침전되는 것은 정상입니다. 흔들고 다음 단계로 진행합니다.
   2. 혼합물을 RNA 컬럼으로 옮기고 13,400 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다. 여과액을 버리고 700μL의 Buffer RW1을 추가한 후 다시 원심분리합니다.
   3. 여과액을 버리고 700μL의 Buffer RW2(앱솔루트 에탄올 포함)를 첨가한 후 원심분리합니다. 여과액을 버리고 500μL의 Buffer RW2(절대 에탄올 포함)를 첨가한 후 2분 동안 원심분리합니다. 여과액으로 인한 오염을 방지하기 위해 튜브에서 컬럼을 조심스럽게 제거합니다. 다운스트림 반응의 간섭을 방지하기 위해 모든 헹굼 용액이 제거되었는지 확인하십시오.
   4. 컬럼을 새로운 RNase-free 수집 튜브로 옮기고, 50-200 μL의 RNase-free ddH₂O를 추가하고, 실온에서 1분 동안 방치한 다음 13,400 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 RNA를 용리합니다. RNA 순도와 농도를 측정합니다.
      참고: 수율 증가를 위해 RNase-free ddH₂O를 65 °C로 예열하고 필요한 경우 두 번째 용리를 수행합니다.
3. 키트 지침에 따라 cDNA를 합성합니다. 제조업체의 지침에 따라 cDNA 가닥을 합성하여 역전사 효소의 양을 5배 추가합니다. 37°C에서 15분 동안 역 전사한 다음 85°C에서 5초 동안 전사하고 4°C로 냉각합니다.
4. 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 반응을 설정합니다.
   1. qPCR 튜브에 2x PCR 반응 효소 혼합물 10 μL, 프라이머 1 0.4 μL, 프라이머 2 0.4 μL, cDNA 템플릿 1 μL, ddH₂O 8.2 μL를 결합하여 20 μL 혼합물을 만듭니다.
   2. 다음 프로그램을 사용하여 Real-Time Quantitative PCR 기기에서 PCR을 실행합니다.
      Stage 1: 95°C에서 30초, Rep x 1
      2단계: 95°C에서 3초, 60°C에서 30초, Rep x 35
      스테이지 3: 95°C에서 15초, 60°C에서 60초, 95°C에서 15초, 반복 x 1

6. 세포 내 사이토카인 염색(ICS)

참고: 이 프로토콜은 오리에서 세포 내 IFN-γ 분비를 감지하여 H5N1 특이적 CD8⁺ T 세포의 효과기 반응을 평가하기 위해 개발되었습니다.

1. 2단계에서 설명한 절차에 따라 H5N1 특이적 T 세포를 in vitro 에서 배양합니다. 배양 시작 후 7일 후에 모든 세포(각 웰에서)를 수확합니다.
2. 2단계에서 설명한 대로 항원제시세포(APC)를 배양합니다. 배양된 APC와 Brefeldin A(1:1,000)를 effector 세포에 추가하고 39°C incubator에서 6시간 동안 함께 배양합니다.
3. 세포를 새 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 440 x g 에서 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
4. 100 μL의 항체 칵테일(마우스 안티 덕 CD8, 1:50)을 세포에 첨가하고 4 °C의 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다.
5. 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하여 세포를 세척하고 1mL의 PBS에 재현탁합니다. 항체 칵테일(FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgG2b, 1:50)을 넣고 4°C의 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다.
6. 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 다시 세척합니다. 상층액을 버리고 100μL의 고정 완충액에 세포를 재현탁시킨 후 4°C의 어둠 속에서 20-25분 동안 배양합니다.
7. 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 한 번 더 세척합니다. 1 mL의 1x 투과화 완충액을 추가하고 4 °C에서 5분 동안 440 x g 에서 원심분리로 셀을 2x 세척합니다.
8. 상층액을 버리고 100μL의 투과화 완충액에 세포를 재현탁시킨 후 항체(Mouse Anti-Duck IFN-γ, 1:10)를 세포에 추가합니다. 고정 및 멤브레인 투과화 후 세포-항체 혼합물을 어두운 곳에서 30분 동안 배양하고 4°C에서 배양하는 동안 때때로 흔들립니다.
   참고: Permeabilization/Wash 용액은 10x 스톡 용액이며 사용하기 전에 PBS로 희석해야 합니다.
9. 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 PBS 1mL로 세포를 한 번 더 세척합니다. 100μL의 항체 칵테일(PE 결합 Goat Anti-Mouse IgG3, 1:250)을 추가하고 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
10. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 게이팅 전략은 그림 1에 나와 있습니다.

이 프로토콜은 오리²⁰에서 항원 특이적 T 세포 효과기 반응 검출에 대한 이전 연구를 기반으로 개발되었습니다. 실험의 첫 번째 단계는 바이러스 특이적 T 세포의 체외 배양과 관련이 있으며, 이는 후속 효과기 반응 연구의 기초 역할을 합니다. 초기에 APC는 배양되어 effector 세포와 공동 배양되었습니다. 형태학적 관찰에 따르면 증식 후 세포는 클러스터 성장을 보였습니다(그림 2A). CFSE 라벨링은 세포 분열의 여러 피크를 보여줌으로써 성공적인 증식을 더욱 확인했습니다(그림 2B). 마지막으로, 오리 특이적 세포 마커 CD8/CD4를 사용하여 세포²⁰의 비율과 절대 수를 평가하여 항원 특이적 T 세포의 성공적인 체외 배양을 확인했습니다(그림 2C).

배양 7일째에 세포를 수집하고 면역 관련 유전자의 발현을 평가했습니다. 우리는 증식하는 T 세포가 Granzyme A 및 IFN-γ와 같은 세포 독성 관련 유전자를 주로 발현한다는 것을 발견했으며^{, 이는 주로} 세포 독성 반응에 기여한다는 것을 시사합니다 (그림 3). 이 effector 반응을 추가로 조사하기 위해 duck T 세포에 의한 IFN-γ 분비를 정량적으로 검출하기 위해 duck-specific staining protocol을 수립했습니다. 유세포 분석법을 사용하여 증식된 집단의 CD8 T 세포를 항-IFN-γ 항체로 고정, 투과화 및 표지했습니다. 그 결과, 항원 자극 후 CD8^high+T 및 CD8^low+T 집단 모두에서 IFN-γ⁺ 세포의 비율이 유의하게 상향 조절되는 것으로 나타났으며(그림 4), 이는 증식에 의해 생성된 CD8⁺ T 세포에서 강력한 효과기 반응을 나타냅니다.

그림 1: CD4⁺/CD8⁺T 세포의 게이팅 전략. (A) 배양 14일 후 H5N1 자극 세포와 비자극 세포 사이의 CD4⁺ T 세포의 게이팅 및 표현형 분석. (B) 배양 14일 후 H5N1 자극 세포와 자극되지 않은 세포 사이의 CD8⁺ T 세포의 비율 및 표현형의 게이팅 및 분석. 이 수치는²⁰에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: H5N1 AIV 특이적 duck T 세포의 체외 배양. (A) H5N1 AIV에 의한 자극 유무에 관계없이 기억 PBMC의 형태학적 분석. 두 개의 서로 다른 오리 기억 PBMC 공여체를 사용하여 두 가지 독립적인 실험을 수행했습니다. (B) CFSE 표지 기억 PBMC의 증식은 배양 2주 후 H5N1에 감염된 오리의 H5N1 자극 세포에서 CFSE 희석에 의해 평가되었습니다. 빨간색 샘플은 자극이 없는 CFSE 표지 메모리 PBMC를 나타내고, 노란색, 녹색 및 검은색 샘플은 각각 배양 7일, 8일, 14일 후에 H5N1로 자극된 CFSE 표지 메모리 PBMC를 나타냅니다. (C) 배양 14일 후 H5N1 자극 세포와 비자극 세포 사이에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 비율을 분석했습니다. 통계적 유의성은 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 결정되었습니다. (D) 배양 14일 후 H5N1 자극 세포와 비자극 세포 간의 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 수를 비교했습니다. T 세포 백분율 및 수에 대한 데이터는 각각 두 번의 반복실험을 가진 두 개의 독립적인 실험에서 얻었습니다. 통계분석은 비쌍체 t-검정 ns p > 0.05, *p < 0.05, **p < 0.01을 사용하여 수행하였다. 이 수치는²⁰에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: qRT-PCR에 의한 H5N1 AIV 특이적 duck T 세포 반응 검출. 데이터는 H5N1 자극 그룹과 자극되지 않은 그룹의 3가지 반복에서 각각 수집되었습니다. 결과는 SEM± 수단으로 제시되었으며 쌍체 t-검정은 통계적 비교를 위해 사용되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01. 이 수치는²⁰에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 자극된 duck PBMC의 CD8⁺ T 세포에서 IFN-γ 발현의 유세포 분석 분석. (A) 자극군과 대조군에 대한 ICS 게이팅 전략. (B) 자극 후 duck PBMCs에서 CD8^low+ 및 CD8^high+ 세포의 IFN-γ 발현에 대한 통계적 분석. 그룹 간 IFN-γ 발현의 차이는 t-test로 평가했으며, 비교는 p≤ 0.05에서 유의한 것으로 간주되었습니다. 이 수치는²⁰에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에 사용되는 게이팅 전략. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

이 프로토콜은 오리 항원 특이적 T 세포의 체외 배양을 위한 효율적인 방법을 제공하며, T 세포의 효과기 반응을 평가하는 데 사용할 수 있는 오리를 위한 세포 내 사이토카인 염색 프로토콜을 수립합니다. 현재 오리 T 세포에 대한 체외 배양 프로토콜에 대한 발표된 보고서는 없습니다. 우리는 주로 인간 항원 특이적 T 세포에 대한 프로토콜을 참조했지만 APC의 배양 조건을 최적화하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 우리는 차별화 프로토콜의 추가 최적화를 고려하고 있습니다.

이 프로토콜에는 성공에 필수적인 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 오리 T 세포의 체외 배양은 충분한 T 세포 확장과 기능 보존을 보장하기 위해 항원 용량, APC 활성화 및 배양 기간을 포함한 자극 조건의 신중한 최적화가 필요합니다. 이러한 매개변수의 편차는 차선의 활성화 또는 세포 사멸로 이어질 수 있습니다. 둘째, ICS 분석은 IFN-γ 발현을 기능적으로 평가하기 위한 핵심 기술입니다. 성공적인 ICS를 위해서는 자극 시간, 고정/투과화 단계 및 항체 특이도의 정밀한 제어가 필요합니다. 두 단계 모두 매우 민감하며 항원 특이적 T 세포 반응의 신뢰할 수 있고 재현성 있는 검출을 달성하기 위해 신중하게 실행해야 합니다.

여기에서는 유세포 분석을 사용하여 세포 증식을 감지하고 qPCR을 사용하여 특징적인 사이토카인 생성을 조사했습니다. 가장 중요한 것은 IFN-γ 발현을 검출하는 데 사용되는 마우스 안티 덕 IFN-γ 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 성공적으로 발현하고 정제하여 T 세포의 effector 반응 수준을 평가한 것입니다. 몇 가지 사소한 수정을 통해 이 접근법은 닭과 같은 다른 종의 세포 증식 분석에도 적용할 수 있습니다.

우리는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 분리 키트를 사용하여 오리 PBMC를 분리했는데, 이 키트가 효과적이고 시간을 절약하기 때문입니다. Precoll 분리 방법과 같은 다른 분리 방법도²¹ 다른 단계를 통해 duck PBMC를 분리하는 목표를 달성할 수 있습니다. 그러나 키트에 비해 이러한 방법은 시간이 더 걸립니다.

이 프로토콜을 실행하는 동안 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. 첫째, 바이러스 자극에 의한 T세포 증식은 주로 기억 T세포 22,23,24의 반응이다. 적절한 T 세포 증식을 보장하기 위해 감염 후 4-10주가 지난 오리를 사용하는 것이 좋습니다. 현재 duck PBMC를 분리하는 데 사용할 수 있는 다양한 방법이 있으며, PBMC 분리의 효율은 사용하는 분리 매체에 따라 달라질 수 있습니다. 널리 인증된 분리 배지를 사용하고 가능한 한 많은 림프구를 추출하는 것이 좋다²⁵.

둘째, 유세포분석은 증식에서 CD8⁺ T 및 CD4⁺ T 세포의 비율이 모두 15% 미만임을 감지했는데, 이는 이 프로토콜에서 배양된 T 세포가 주로 CD8⁺ T 및 CD4⁺ T 세포의 비율이 본질적으로 낮은 PBMC에서 유래했기 때문일 수 있습니다. 비장 조직을 사용한 향후 실험에서는 더 중요한 결과를 얻을 수 있을 것입니다.

셋째, 배양 과정에서 많은 T세포 클러스터가 형성되지 않을 수 있으며, 일부 세포는 T세포 분화 과정에서 사멸할 수 있습니다. 이 현상은 자극받지 않은 대조군에서 더 두드러집니다. 이 문제는 T 세포가 배양될 때 자극되지 않은 그룹이 활성화 및 공동 자극 신호를 받지 못하여 프로그래밍된 세포 사멸로 직접 이어지기 때문일 수 있습니다.

넷째, 하이브리도마 세포주를 구축하고 다량의 마우스 anti-duck IFN-γ 항체를 성공적으로 발현 및 정제했습니다. 이러한 항체를 사용하여 오리 IFN-γ를 검출하기 위한 세포 내 사이토카인 염색 프로토콜을 개발했습니다. 다음으로, ELISA를 사용하여 항체의 민감도를 테스트하고 유세포 분석을 위해 염색 농도를 최적화하여 최종적으로 1:250의 희석에서 PE-Goat Anti-Mouse IgG3를 2차 항체로 쌍을 이루는 최적의 농도를 1:10으로 결정했습니다. 실험 결과는 자극군에서 IFN-γ의 발현이 2%-3%임을 보여주었습니다. IFN-γ 생성 세포의 비율이 상대적으로 낮은 것은 T 세포가 한 번만 자극되었다는 사실에 기인할 수 있습니다. 한 차례의 항원 자극은 항원 특이적 T 세포의 집단을 검출 가능한 수준까지 확장하기에 충분하지 않을 수 있습니다. 항원 자극을 반복하면 항원 특이적 T 세포를 풍부하게 하고 활성화를 강화하여 IFN-γ 양성 세포의 비율을 증가시킬 수 있습니다. 더욱이, 단 한 번의 자극 후에도 반응하는 T 세포 집단은 여전히 다클론성일 가능성이 높습니다. 반복적인 자극과 선택을 통해 클론이 더 풍부한 T 세포 집단을 얻을 수 있으며, 이는 더 높은 수준의 IFN-γ 생산을 나타내는 경향이 있습니다^26,27.

결론적으로, 현재 프로토콜은 in vitro 에서 오리 항원 특이적 T 세포의 증식을 유도하는 방법을 설명하고 duck IFN-γ를 검출하기 위한 세포 내 염색 프로토콜을 수립합니다. 이 접근법은 오리 T 세포 면역 반응에 대한 이해를 높이고, T 세포 반응을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 도구를 제공하며, 조류 바이러스 면역학 연구를 발전시키는 데 기여합니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32473060 및 32461120064) (MD 및 ML)의 지원을 받았습니다. 광저우 기초 및 응용 기초 연구 프로젝트(2025A04J5445) (MD에게); 양쯔강 장학생 교수 프로그램의 젊은 학자(2024, Manman Dai); "광동 특별 지원 계획"의 Young Peal River Scholar(2024, Manman Dai). 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.