In vitro Cultivo de linfocitos T de pato específicos para H5N1 y detección de respuestas inmunitarias mediante el método de tinción de citocinas intracelulares

El protocolo describe un método para cultivar células T aviares in vitro mediante el aislamiento de células T de memoria de patos infectados, lo que permite la generación de células T de pato específicas altamente purificadas. Además, se estableció un método de tinción de citocinas intracelulares (ICS) para medir con precisión la secreción de IFN-γ en las células T de pato.

El cultivo in vitro de células T es un método fundamental para estudiar las respuestas inmunitarias, las infecciones virales y las posibles estrategias terapéuticas. Sin embargo, hasta la fecha no se han reportado protocolos establecidos para el cultivo de células T aviares in vitro . En este estudio, presentamos un protocolo por primera vez, utilizando como modelo el virus de la influenza aviar altamente patógena (HPAIV) H5N1. Aquí, los patos de 4 semanas de edad se infectaron con el virus, y los linfocitos T de memoria se aislaron 28 días después de la infección para cultivar linfocitos T de pato H5N1 específicos, lo que permitió la investigación de la respuesta inmunitaria específica al virus H5N1. Los pasos clave del protocolo incluyen el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de memoria de patos infectados, la activación de células presentadoras de antígenos (APC) con una multiplicidad óptima de infección (MOI = 5) durante 6 h y la preparación de medios de cultivo de células T suplementados con IL-2 recombinante y otros aditivos específicos. La proliferación de células T, la secreción de citocinas y la actividad citotóxica se monitorearon de cerca durante todo el proceso. Además, establecimos un protocolo de tinción de citocinas intracelulares para cuantificar la secreción de IFN-γ en las células T de pato. Esto implicó la generación de una línea celular de hibridoma que expresa anticuerpos IgG3κ específicos para el IFN-γ pato, seguido de una purificación exitosa de anticuerpos. El anticuerpo purificado se diluyó 1:10 y se aplicó en citometría de flujo para medir con precisión la secreción de IFN-γ. Este método ofrece una herramienta fiable para evaluar las respuestas de las células T de pato y sienta las bases para futuras investigaciones sobre la inmunología viral aviar.

El proceso de activación, proliferación, diferenciación y conversión en células T de memoria es fundamental para las respuestas inmunitarias específicas del antígeno¹. Inicialmente, los linfocitos T se activan cuando sus receptores de linfocitos T (TCR) reconocen los péptidos antigénicos presentados en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC) por las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) ^2,3. Este proceso de activación requiere no solo la unión del TCR a las moléculas MHC, sino también la coordinación de señales coestimuladoras, que son cruciales para la plena activación de las funciones de las células T⁴. Una vez activados, los linfocitos T entran rápidamente en la fase de proliferación, generando numerosos clones que comparten la misma especificidad antigénica que el linfocito T original. Durante esta fase de proliferación, las células T se diferencian aún más en función de su función, principalmente en células T CD8⁺ y células T CD4^{+ 5}. Estas células diferenciadas median la muerte citotóxica y ayudan a las respuestas inmunitarias, respectivamente. Después de la infección inicial, una parte de las células T activadas se transforman en células T de memoria de larga vida⁶. Estas células T de memoria pueden persistir en el sistema inmunitario durante períodos prolongados, respondiendo rápidamente al mismo patógeno tras la reexposición. Como resultado, generan una respuesta inmunitaria más fuerte y eficiente, proporcionando protección inmunitaria a largo plazo para el huésped⁷. Todo este proceso es crítico para el diseño de vacunas de células T, ya que ayuda a mejorar la eficacia y durabilidad de las vacunas⁸.

En este contexto, el cultivo in vitro de linfocitos T específicos de antígeno se vuelve esencial. Este protocolo se desarrolló con base en métodos establecidos para el cultivo in vitro de células T humanas, con adaptaciones necesarias para el sistema inmune aviar⁹. Al cultivar estas células fuera del cuerpo, los investigadores pueden estudiar la respuesta de las células T bajo diferentes estados inmunológicos, como la activación, la proliferación, la diferenciación y^{la formación de} memoria. Este enfoque in vitro es muy valioso para comprender las funciones que desempeñan las células T en las respuestas inmunitarias. Además, en condiciones de cultivo in vitro, se puede monitorizar la secreción de citocinas (como el IFN-γ) por los linfocitos T^11,12. Este seguimiento es crucial para evaluar la calidad, la intensidad y la persistencia de las respuestas inmunitarias, así como para estudiar las interacciones entre las células T y otras células inmunitarias. Además, la expansión in vitro de las células T específicas de antígeno permite el enriquecimiento a gran escala, aumenta la sensibilidad de detección y mejora la evaluación de los niveles de respuesta de las células T¹³. Por lo tanto, el cultivo in vitro de células T específicas de antígeno sirve como una herramienta poderosa para comprender mejor el papel de las células T de aves de corral en las respuestas inmunitarias, lo que aumenta la sensibilidad de detección y mejora la evaluación de los niveles de respuesta de las células T. Si bien se han establecido métodos in vitro similares en los sistemas de mamíferos, la aplicación de dichas técnicas en especies de aves sigue siendo limitada. Esto es especialmente relevante en la inmunología avícola, donde las herramientas para analizar las respuestas de las células T están poco desarrolladas. Los patos, en particular, sirven como reservorios naturales de varios virus de la influenza aviar, pero se sabe poco sobre su inmunidad de células T específicas de antígeno. Por lo tanto, el desarrollo de un protocolo estandarizado de cultivo de células T in vitro adaptado a los sistemas aviares es esencial para avanzar tanto en la investigación básica como en la inmunología aplicada en aves de corral.

Una citocina clave involucrada en estos procesos es el IFN-γ, un interferón de tipo II producido principalmente por las células T CD8⁺, las células T CD4⁺ de tipo 1 y las células NK¹⁴. El IFN-γ desempeña un papel crucial en la inhibición de la replicación viral y la regulación de las respuestas inmunitarias¹⁵. El nivel de expresión de IFN-γ refleja el estado inmunitario y sirve como marcador de la activación de las células T, lo que permite a los investigadores evaluar los niveles de respuesta de las células T a través de su expresión^16,17. Un método común para detectar la expresión de citocinas en las células inmunitarias es la tinción intracelular de citocinas (ICS)^18,19. Sin embargo, debido a las limitaciones de los materiales y técnicas experimentales, la investigación sobre patos ha quedado rezagada con respecto a la de los mamíferos⁵. En la actualidad, muchos investigadores confían en la qPCR para medir los niveles de expresión de IFN-γ, aunque este método tiene ciertas limitaciones¹¹. En nuestro laboratorio, desarrollamos con éxito un anticuerpo contra el IFN-γ de pato que es compatible con la citometría de flujo. Sobre la base de ese éxito, en este estudio, establecimos un método ICS para detectar la expresión de la proteína IFN-γ en las células T de pato, proporcionando una herramienta confiable para estudios posteriores sobre las respuestas de las células T de pato.

Todos los experimentos con todos los virus de la influenza aviar A (H5N1) disponibles se llevaron a cabo en un laboratorio de bioseguridad animal de nivel 3 y en una instalación para animales de acuerdo con los protocolos de la Universidad Agrícola del Sur de China (CNAS BL0011). Todos los proyectos de investigación animal fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (código de identificación 2021f154, 29 de julio de 2021) de la Universidad de Agricultura del Sur de China. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones y lineamientos establecidos por este comité y los estándares internacionales para el bienestar animal. Los animales utilizados en este estudio fueron patos reales domésticos (Anas platyrhynchos domestica) de 4 semanas de edad, incluyendo machos y hembras, con pesos corporales que oscilaron entre 500 y 600 g.

1. Aislamiento de PBMC de pato y preparación de una suspensión unicelular

1. Recoja 2 mL de sangre heparinizada de la vena yugular de cada pato y transfiérala a tubos que contengan EDTA para evitar la coagulación de cada pato individual
2. Diluya la sangre utilizando el diluyente de muestra proporcionado por el kit de aislamiento de linfocitos o PBS. Mezclar suavemente pipeteando con una pipeta Pasteur. La relación de dilución habitual es de 1:1 para la sangre y el diluyente.
3. Transfiera un volumen igual de solución de separación de linfocitos a un tubo de centrífuga que la sangre diluida. Coloque con cuidado la suspensión de sangre sobre la solución de separación de linfocitos. Centrifugar la mezcla a 400 x g, 25 °C durante 15 min, ajustando la aceleración de caída a 1.
   NOTA: La cantidad de solución de separación de linfocitos no debe ser inferior a 4 mL. Los componentes del kit de solución de separación de linfocitos se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.
4. Después de la centrifugación, observe las cuatro capas distintas en el tubo de centrífuga de arriba a abajo. La capa superior es el diluyente de la muestra, seguida de la capa anular de linfocitos de color blanco lechoso, luego la solución de separación y la capa inferior consta de glóbulos rojos.
5. Utilice con cuidado una pipeta para recoger la segunda capa, la capa anular de linfocitos de color blanco lechoso, y transfiérala a un nuevo tubo de centrífuga. Añadir 10 mL de solución limpiadora para mezclar con las células.
6. Centrifugar la muestra a 440 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante, luego vuelva a suspender el pellet de celda en 10 mL de medio RPMI 1640 para el recuento de células.
7. Para purificar aún más la muestra, después de centrifugar a 440 x g durante 5 minutos, utilice un tampón de lisis de glóbulos rojos para eliminar los glóbulos mezclados restantes.

2. Cultivo in vitro de células T específicas para el virus H5N1

1. Compre patos reales sanos de 2 semanas de edad (Sheldrake) en una granja de patos y colóquelos en aisladores de presión negativa. Confirme que los patos son negativos para AIV mediante el uso de ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HI) antes del experimento. Infectar patos de 4 semanas de edad con H5N1 AIV 1 x 10⁶, con una dosis infecciosa de huevo del 50% [EID50]/0,2 mL por vía intranasal.
2. Aísle las PBMC de memoria de patos infectados con H5N1 28 días después de la infección, siguiendo el método descrito en el paso 1. Cuente las células con un hemocitómetro. Diluir la suspensión celular en una proporción de 1:1 con 0,08% de azul de tripán y contar las células viables (sin teñir) manualmente bajo un microscopio óptico.
   NOTA: Según lo respaldado por nuestro estudio publicado anteriormente²⁰, se considera que las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas a los 28 días después de la infección están enriquecidas en células T de memoria. En esta etapa, la fase efectora ha disminuido y las poblaciones de células de memoria son predominantes.
3. Ajuste la concentración a 3 x 10⁶ células/mL, asegurándose de que se agregue 1 mL de medio a cada pocillo de la placa de 48 pocillos.
4. Coinfectar las PBMC aisladas con el virus de la influenza aviar (AIV) H5N1 para que sirvan como APC. La dosis viral es MOI = 5. Co-cultivo de las PBMCs con el virus durante 1 h a 37 °C. Agitar suavemente con la mano cada 15 min.
5. Después de 1 h de infección, lave las células 2 veces con PBS para eliminar las partículas virales no unidas. Vuelva a suspender las PBMC lavadas en 1 mL de medio de cultivo de células T y luego incube las células suspendidas a 37 °C durante 5 h.
6. Centrifugar las celdas a 440 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, vuelva a suspender las células presentadoras de antígenos (APC) incubadas en 100 μL de medio de cultivo de células T y agréguelas a las células efectoras. La proporción de células presentadoras de antígeno con respecto a las células efectoras debe ser de 1:5.
7. Incubar las células en una atmósfera de 5% de CO₂ a 37 °C durante 14 días. Cada 2 días, reemplace la mitad del sobrenadante del cultivo celular con medio de células T frescas pipeteando cuidadosamente para garantizar una distribución uniforme. Deseche la mitad del medio que contiene las celdas, luego agregue un volumen igual de medio nuevo.
8. El día 7, observe las células bajo un microscopio óptico a 100x.
9. Utilice las PBMC de memoria tratadas con PBS como grupo de control no estimulado.

3. Éster de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) para controlar la proliferación de células T

1. Ajuste la densidad celular a 0,5-1 x 10⁷ células/mL y vuelva a suspender las células con 5 mL de PBS después de la centrifugación a 440 x g durante 5 min.
2. Diluir 10 mM de caldo a 1 μM de CFSE con 5 mL de PBS preenfriado; Operar en la oscuridad.
3. Incline los dos tubos de centrífuga a 45°, añada la dilución de CFSE a la suspensión celular con una pipeta Pasteur, mezcle bien y colóquelo en un baño de agua a 37 °C durante 15 min en la oscuridad.
4. Lave las células diluyéndolas en 10 volúmenes de PBS preenfriado que contengan 5% de FBS, sedimente por centrifugación a 440 x g durante 5 min y deseche el sobrenadante. Repita el lavado 2 veces.
5. Estimular las células marcadas con CFSE in vitro según el paso 2. Al finalizar el ensayo de proliferación, recoja las células y analícelas mediante citometría de flujo.

4. Análisis de citometría de flujo para la proliferación de células T CD8⁺ y T CD4⁺

1. Después de 7 días de cultivo, recoja todas las células de cada pocillo y divídalas en dos tubos de flujo para su análisis.
2. Transfiera las células a un nuevo tubo de centrífuga, centrifugue a 440 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.
3. Añadir 100 μL de cóctel de anticuerpos (ratón anti-pato CD8, 1:50 o ratón anti-pato CD4, 1:50) e incubar las células durante 30 min en la oscuridad a 4 °C.
4. Transfiera las células a un nuevo tubo de centrífuga, centrifugue a 440 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.
5. Añadir 100 μL de cóctel de anticuerpos (IgG2b Goat Anti-Mouse conjugado con FITC, 1:50) e incubar las células durante 30 min en la oscuridad a 4 °C.
6. Lavar las células una vez con 1 mL de PBS centrifugando a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Analice los datos con el software FlowJo. La estrategia de compuerta se muestra en la Figura 1 complementaria.

5. Respuesta de las células T mediante ensayos de expresión génica de firma mediante qPCR

1. Cuente las células al final del cultivo de células T, recoja en tubos de centrífuga de 1,5 ml y centrifugue a 400 x g durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante con cuidado.
2. Extracción de ARN
   NOTA: La extracción se puede realizar en una campana extractora o en un banco ultralimpio para evitar la contaminación por ARN.
   1. Lise las células utilizando el tampón de lisis proporcionado en el kit según las instrucciones del fabricante. Transfiera la muestra lisada a columnas de filtro de ADNg (precolocadas en tubos de recolección), centrifugue a 13.400 x g durante 30 s, deseche las columnas y recoja el filtrado. Añada 0,5 volúmenes de etanol absoluto al filtrado. Homogeneizar.
      NOTA: Es normal que haya una solución turbia o precipitado después de la adición de etanol. Agite y continúe con el siguiente paso.
   2. Transfiera la mezcla a columnas de ARN, centrifugar a 13.400 x g durante 30 s. Deseche el filtrado, añada 700 μL de tampón RW1 y vuelva a centrifugar.
   3. Deseche el filtrado, agregue 700 μL de tampón RW2 (con etanol absoluto) y centrifuga. Deseche el filtrado, agregue 500 μL de tampón RW2 (con etanol absoluto) y centrifugue durante 2 min. Retire con cuidado la columna del tubo para evitar la contaminación del filtrado. Asegúrese de eliminar todas las soluciones de enjuague para evitar interferencias en las reacciones posteriores.
   4. Transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección sin RNasa, agregue 50-200 μL de ddH₂O sin RNasa, déjela reposar a temperatura ambiente durante 1 min, luego centrifugue a 13,400 x g durante 1 min para eluir el ARN. Mida la pureza y concentración del ARN.
      NOTA: Precaliente ddH₂O sin RNasa a 65 °C para aumentar el rendimiento y realice una segunda elución si es necesario.
3. Sintetice el ADNc siguiendo las instrucciones del kit. Sintetice la cadena de ADNc según las instrucciones del fabricante, agregando 5 veces la cantidad de transcriptasa inversa. Transcripción inversa a 37 °C durante 15 min, luego a 85 °C durante 5 s y enfriar a 4 °C.
4. Configure la reacción de PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   1. En un tubo de qPCR, combine 10 μL de mezcla de enzimas de reacción de PCR 2x, 0,4 μL de cebador 1, 0,4 μL de cebador 2, 1 μL de plantilla de ADNc y 8,2 μL de ddH₂O para hacer una mezcla de 20 μL.
   2. Ejecute PCR en el instrumento de PCR cuantitativo en tiempo real con el siguiente programa:
      Etapa 1: 95 °C durante 30 s, Rep x 1
      Etapa 2: 95 °C durante 3 s, 60 °C durante 30 s, Rep x 35
      Etapa 3: 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 60 s, 95 °C durante 15 s, Rep x 1

6. Tinción de citocinas intracelulares (ICS)

NOTA: Este protocolo se desarrolló para evaluar la respuesta efectora de las células T CD8⁺ específicas de H5N1 mediante la detección de la secreción intracelular de IFN-γ en patos.

1. Cultivo in vitro de linfocitos T específicos para H5N1 siguiendo el procedimiento descrito en el paso 2. Coseche todas las células (de cada pocillo) después de 7 días del inicio del cultivo.
2. Incube las células presentadoras de antígenos (APC) como se describe en el paso 2. Añadir las APCs incubadas y la brefeldina A (1:1.000) a las células efectoras y co-incubar durante 6 h en una incubadora a 39 °C.
3. Transfiera las células a un nuevo tubo de centrífuga, centrifugue a 440 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.
4. Añadir 100 μL de cóctel de anticuerpos (ratón anti-pato CD8, 1:50) a las células e incubar durante 30 min en la oscuridad a 4 °C.
5. Lavar las células centrifugando a 400 x g durante 5 min a 4 °C y volver a suspenderlas en 1 mL de PBS. Añadir un cóctel de anticuerpos (IgG2b antiratón de cabra conjugado con FITC, 1:50) e incubar durante 30 min en la oscuridad a 4 °C.
6. Lavar de nuevo las células centrifugando a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 100 μL de tampón de fijación e incube durante 20-25 min en la oscuridad a 4 °C.
7. Lavar las células una vez más centrifugando a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Añadir 1 mL de tampón de permeabilización 1x y lavar las células 2x por centrifugación a 440 x g durante 5 min a 4 °C.
8. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 100 μL de tampón de permeabilización y agregue el anticuerpo (Mouse Anti-Duck IFN-γ, 1:10) a las células. Después de la fijación y la permeabilización de la membrana, incubar la mezcla de células y anticuerpos durante 30 minutos en la oscuridad, agitando ocasionalmente durante la incubación a 4 °C.
   NOTA: La solución de permeabilización/lavado es una solución madre 10x y debe diluirse con PBS antes de su uso.
9. Lavar las células una vez más con 1 mL de PBS centrifugando a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Añadir 100 μL de cóctel de anticuerpos (IgG3 anti-ratón de cabra conjugado con PE, 1:250) e incubar durante 30 min en la oscuridad a 4 °C.
10. Analice los datos con el software FlowJo. La estrategia de compuerta se muestra en la Figura 1.

Este protocolo se desarrolló en base a un estudio previo sobre la detección de respuestas efectoras de células T específicas de antígeno en patos²⁰. El primer paso del experimento consiste en el cultivo in vitro de células T específicas del virus, que sirven de base para posteriores estudios de respuesta a efectores. Inicialmente, las APC se incubaron y se cocultivaron con células efectoras. Las observaciones morfológicas revelaron que después de la proliferación, las células exhibieron crecimiento en racimo (Figura 2A). El marcaje CFSE confirmó aún más el éxito de la proliferación al mostrar múltiples picos de división celular (Figura 2B). Por último, utilizamos los marcadores celulares CD8/CD4 específicos de pato para evaluar la proporción y el número absoluto de células²⁰, lo que confirma el éxito del cultivo in vitro de células T específicas de antígeno (Figura 2C).

En el día 7 del cultivo, recolectamos las células y evaluamos la expresión de genes relacionados con el sistema inmunológico. Encontramos que las células T en proliferación expresaban predominantemente genes asociados a citotóxicos como Granzima A e IFN-γ^11,20 (Figura 3), lo que sugiere que contribuyen principalmente a las respuestas citotóxicas. Para investigar más a fondo esta respuesta efectora, establecimos un protocolo de tinción específico para patos para detectar cuantitativamente la secreción de IFN-γ por parte de las células T de pato. Se utilizó citometría de flujo para fijar, permeabilizar y marcar las células T CD8 de la población proliferada con un anticuerpo anti-IFN-γ. Los resultados mostraron una regulación positiva significativa en la proporción de células IFN-γ⁺ tanto en las poblaciones CD8^high+T como en CD8^low+T después de la estimulación del antígeno (Figura 4), lo que indica una respuesta efectora robusta en las células T CD8⁺ generadas por la proliferación.

Figura 1: Estrategia de activación de las células T CD4⁺/CD8⁺. (A) Activación y análisis del porcentaje y fenotipo de las células T CD4⁺ entre las células estimuladas y no estimuladas por H5N1 después de 14 días de cultivo. (B) Activación y análisis del porcentaje y fenotipo de células T CD8⁺ entre células estimuladas y no estimuladas con H5N1 después de 14 días de cultivo. Esta cifra ha sido modificada de²⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cultivo in vitro de células T de pato H5N1 específicas para el AIV. (A) Análisis morfológico de PBMCs de memoria con o sin estimulación por H5N1 AIV. Se llevaron a cabo dos experimentos independientes con dos donantes diferentes de PBMC de memoria de pato. (B) La proliferación de PBMC de memoria marcadas con CFSE se evaluó mediante la dilución de CFSE en células estimuladas por H5N1 de patos infectados con H5N1 después de 2 semanas de cultivo. La muestra roja representa las PBMC de memoria marcadas con CFSE sin estimulación, mientras que las muestras amarillas, verdes y negras representan las PBMC de memoria marcadas con CFSE estimuladas con H5N1 después de 7, 8 y 14 días de cultivo, respectivamente. (C) Se analizó el porcentaje de linfocitos T CD4⁺ y CD8⁺ entre las células estimuladas y no estimuladas por H5N1 después de 14 días de cultivo. La significación estadística se determinó mediante una prueba t no apareada. (D) Se comparó el número de células T CD4⁺ y CD8⁺ entre células estimuladas y no estimuladas con H5N1 después de 14 días de cultivo. Los datos sobre los porcentajes y números de células T se obtuvieron de dos experimentos independientes con dos réplicas cada uno. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t no apareada ns p > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01. Esta cifra ha sido modificada de²⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Detección de la respuesta de los linfocitos T de pato específicos del virus H5N1 AIV mediante qRT-PCR. Los datos se recogieron de tres réplicas en el grupo estimulado con H5N1 y en el grupo no estimulado, respectivamente. Los resultados se presentaron como medias ± SEM, y para la comparación estadística se utilizó la prueba t pareada. *p < 0,05, **p < 0,01. Esta cifra ha sido modificada de²⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis por citometría de flujo de la expresión de IFN-γ en linfocitos T CD8⁺ de PBMCs de pato estimulados. (A) Estrategia de activación de ICS para el grupo estimulado y el grupo control. (B) Análisis estadístico de la expresión de IFN-γ en células CD8^bajo+ y CD8^alto+ de PBMC de pato después de la estimulación. La diferencia en la expresión de IFN-γ entre los grupos se evaluó mediante la prueba t, y las comparaciones se consideraron significativas a p≤ 0,05. Esta cifra ha sido modificada de²⁰. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Estrategia de compuerta utilizada para los linfocitos T CD4⁺ y CD8⁺ . Haga clic aquí para descargar este archivo.

Este protocolo proporciona un método eficiente para el cultivo in vitro de células T específicas de antígeno de pato y también establece un protocolo de tinción de citocinas intracelulares para patos, que se puede utilizar para evaluar las respuestas efectoras de las células T. Actualmente, no hay informes publicados sobre protocolos de cultivo in vitro para células T de pato. Principalmente hicimos referencia a los protocolos para las células T específicas de antígeno humano, pero nos comprometemos a optimizar las condiciones de incubación para las APC. Estamos considerando una mayor optimización de nuestro protocolo de diferenciación.

Hay dos pasos críticos en este protocolo que son esenciales para su éxito. En primer lugar, el cultivo in vitro de células T de pato requiere una optimización cuidadosa de las condiciones de estimulación, incluida la dosis de antígeno, la activación de APC y la duración del cultivo, para garantizar una expansión suficiente de las células T y la preservación funcional. Cualquier desviación en estos parámetros puede conducir a una activación subóptima o a la muerte celular. En segundo lugar, el ensayo ICS es una técnica clave para evaluar funcionalmente la expresión de IFN-γ. El éxito de la CSI requiere un control preciso del tiempo de estimulación, los pasos de fijación/permeabilización y la especificidad de los anticuerpos. Ambos pasos son altamente sensibles y deben ejecutarse cuidadosamente para lograr una detección confiable y reproducible de las respuestas de las células T específicas del antígeno.

En este caso, utilizamos la citometría de flujo para detectar la proliferación celular y la qPCR para examinar la producción de citocinas distintivas. Lo que es más importante, expresamos y purificamos con éxito una línea celular de hibridoma que produce anticuerpos IFN-γ anti-pato en ratones, que se utilizaron para detectar la expresión de IFN-γ, evaluando así el nivel de respuesta efectora de las células T. Con algunas modificaciones menores, este enfoque también podría adaptarse para ensayos de proliferación celular en otras especies, como los pollos.

Utilizamos un kit de aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para aislar las PBMC de pato, ya que es eficaz y ahorra tiempo. Otros métodos de separación, como el método de separación de Precoll, también pueden^lograr el objetivo de aislar las PBMC de pato a través de diferentes etapas. Sin embargo, en comparación con el kit, estos métodos llevan más tiempo.

Pueden surgir algunos problemas durante la ejecución de este protocolo. En primer lugar, la proliferación de linfocitos T tras la estimulación viral es principalmente una respuesta de los linfocitos T de memoria 22,23,24. Para garantizar una proliferación adecuada de las células T, recomendamos utilizar patos que estén entre 4 y 10 semanas después de la infección. Actualmente, existen varios métodos disponibles para aislar las PBMC de pato, y la eficiencia del aislamiento de las PBMC puede variar según el medio de separación utilizado. Se recomienda utilizar un medio de separación ampliamente certificado y extraer el mayor número posible de linfocitos²⁵.

En segundo lugar, la citometría de flujo detectó que la proporción de linfocitos T CD8⁺ y T CD4⁺ en la proliferación era inferior al 15%, lo que puede deberse a que los linfocitos T cultivados en este protocolo provienen principalmente de PBMC, en las que la proporción de linfocitos T CD8⁺ y T CD4⁺ es inherentemente baja. Los experimentos futuros con tejido del bazo pueden arrojar resultados más significativos.

En tercer lugar, durante el proceso de cultivo, es posible que no se formen muchos grupos de células T y que algunas células mueran durante la diferenciación de las células T. Este fenómeno es más pronunciado en el grupo de control no estimulado. Este problema puede deberse al hecho de que, a medida que se cultivan las células T, el grupo no estimulado no recibe señales de activación y coestimulación, lo que conduce directamente a la muerte celular programada.

En cuarto lugar, construimos una línea celular de hibridoma y expresamos y purificamos con éxito una gran cantidad de anticuerpos IFN-γ de ratón antipato. Utilizando estos anticuerpos, desarrollamos un protocolo de tinción de citocinas intracelulares para detectar IFN-γ pato. A continuación, probamos la sensibilidad de los anticuerpos mediante ELISA y optimizamos la concentración de tinción para la citometría de flujo, determinando finalmente que la concentración óptima era 1:10, junto con PE-Goat Anti-Mouse IgG3 como anticuerpo secundario a una dilución de 1:250. Los resultados experimentales mostraron que la expresión de IFN-γ en el grupo estimulado fue del 2%-3%. La proporción relativamente baja de células productoras de IFN-γ puede atribuirse al hecho de que las células T sólo fueron estimuladas una vez. Es posible que una sola ronda de estimulación del antígeno no sea suficiente para expandir la población de células T específicas del antígeno a un nivel detectable. Las rondas repetidas de estimulación de antígenos pueden enriquecer las células T específicas de antígeno y mejorar su activación, aumentando así la proporción de células positivas para IFN-γ. Además, después de una sola estimulación, es probable que la población de células T que responden siga siendo policlonal. A través de la estimulación y selección repetidas, se puede obtener una población de linfocitos T más enriquecida clonalmente, que tiende a exhibir niveles más altos de producción de IFN-γ^26,27.

En conclusión, el protocolo actual describe un método para inducir la proliferación de células T específicas de antígeno de pato in vitro y establece un protocolo de tinción intracelular para detectar IFN-γ de pato. Este enfoque mejora nuestra comprensión de las respuestas inmunitarias de las células T de pato, ofrece una herramienta fiable para evaluar las respuestas de las células T y contribuye al avance de la investigación en inmunología viral aviar.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32473060 y 32461120064) (para MD y ML); Proyecto de Investigación Básica y Básica Aplicada de Guangzhou (2025A04J5445) (a MD); el Programa de Profesores Académicos Jóvenes del Río Yangtze (2024, Manman Dai); y el joven becario del río Peal del "Plan de apoyo especial de Guangdong" (2024, Manman Dai). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.