In vitro Kultur für H5N1-spezifische Enten-T-Zellen und Nachweis von Immunantworten mittels intrazellulärer Zytokin-Färbemethode

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultivierung von aviären T-Zellen in vitro , indem Gedächtnis-T-Zellen aus infizierten Enten isoliert werden, was die Erzeugung hochreiner spezifischer Enten-T-Zellen ermöglicht. Darüber hinaus wurde eine intrazelluläre Zytokin-Färbemethode (ICS) etabliert, um die IFN-γ-Sekretion in Enten-T-Zellen genau zu messen.

Die In-vitro-Kultur von T-Zellen ist eine wichtige Methode zur Untersuchung von Immunantworten, Virusinfektionen und potenziellen therapeutischen Strategien. Bisher wurden jedoch keine etablierten Protokolle für die Kultivierung von aviären T-Zellen in vitro berichtet. In dieser Studie stellen wir zum ersten Mal ein Protokoll vor, das das hochpathogene Vogelgrippevirus (HPAIV) H5N1 als Modell verwendet. Hier wurden 4 Wochen alte Enten mit dem Virus infiziert und 28 Tage nach der Infektion Gedächtnis-T-Lymphozyten isoliert, um H5N1-spezifische Enten-T-Lymphozyten zu kultivieren, was die Untersuchung der spezifischen Immunantwort auf das H5N1-Virus ermöglichte. Zu den wichtigsten Schritten des Protokolls gehören die Isolierung von mononukleären Zellen (PBMCs) des peripheren Blutes (PBMCs) aus infizierten Enten, die Aktivierung von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) mit einer optimalen Infektionsvielfalt (MOI = 5) für 6 Stunden und die Herstellung von T-Zell-Kulturmedien, die mit rekombinantem IL-2 und anderen spezifischen Zusätzen ergänzt werden. Die T-Zell-Proliferation, die Zytokinsekretion und die zytotoxische Aktivität wurden während des gesamten Prozesses engmaschig überwacht. Darüber hinaus haben wir ein intrazelluläres Zytokin-Färbeprotokoll zur Quantifizierung der IFN-γ-Sekretion in Enten-T-Zellen etabliert. Dazu wurde eine Hybridom-Zelllinie erzeugt, die IgG3κ-Antikörper exprimiert, die spezifisch für Enten-IFN-γ sind, gefolgt von einer erfolgreichen Antikörperreinigung. Der gereinigte Antikörper wurde 1:10 verdünnt und in der Durchflusszytometrie eingesetzt, um die IFN-γ Sekretion präzise zu messen. Diese Methode bietet ein zuverlässiges Werkzeug zur Bewertung der T-Zell-Antworten von Enten und legt den Grundstein für zukünftige Untersuchungen zur viralen Immunologie von Vögeln.

Der Prozess der Aktivierung, Proliferation, Differenzierung und Umwandlung von T-Zellen in Gedächtnis-T-Zellen ist von zentraler Bedeutung für antigenspezifische Immunantworten¹. Anfänglich werden T-Zellen aktiviert, wenn ihre T-Zell-Rezeptoren (TCR) antigene Peptide erkennen, die von Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) präsentiert^{werden 2,3}. Dieser Aktivierungsprozess erfordert nicht nur die Bindung von TCR an MHC-Moleküle, sondern auch die Koordination von co-stimulatorischen Signalen, die für die vollständige Aktivierung der T-Zellfunktionen entscheidend sind⁴. Einmal aktiviert, treten T-Zellen schnell in die Proliferationsphase ein und erzeugen zahlreiche Klone, die die gleiche Antigenspezifität wie die ursprüngliche T-Zelle aufweisen. Während dieser Proliferationsphase differenzieren sich T-Zellen aufgrund ihrer Funktion weiter, hauptsächlich in CD8⁺ T-Zellen und CD4⁺ T-Zellen⁵. Diese differenzierten Zellen vermitteln die zytotoxische Abtötung bzw. unterstützen die Immunantwort. Nach der Erstinfektion verwandelt sich ein Teil der aktivierten T-Zellen in langlebige Gedächtnis-T-Zellen⁶. Diese Gedächtnis-T-Zellen können über längere Zeiträume im Immunsystem verbleiben und bei erneuter Exposition schnell auf denselben Erreger reagieren. Infolgedessen erzeugen sie eine stärkere und effizientere Immunantwort und bieten^{dem Wirt einen} langfristigen Immunschutz 7. Dieser gesamte Prozess ist für die Entwicklung von T-Zell-Impfstoffen von entscheidender Bedeutung, da er dazu beiträgt, die Wirksamkeit und Haltbarkeit des Impfstoffs zu verbessern⁸.

In diesem Zusammenhang wird die Kultivierung antigenspezifischer T-Zellen in vitro unerlässlich. Dieses Protokoll wurde auf der Grundlage etablierter Methoden für die In-vitro-Kultivierung menschlicher T-Zellen entwickelt, mit notwendigen Anpassungen für das Immunsystem der Vögel⁹. Indem diese Zellen außerhalb des Körpers gezüchtet werden, können Forscher die T-Zell-Reaktion unter verschiedenen Immunzuständen wie Aktivierung, Proliferation, Differenzierung und Gedächtnisbildung untersuchen¹⁰. Dieser In-vitro-Ansatz ist von unschätzbarem Wert, um die Rolle zu verstehen, die T-Zellen bei Immunantworten spielen. Darüber hinaus kann unter In-vitro-Kulturbedingungen die Sekretion von Zytokinen (wie IFN-γ) durch T-Zellen überwacht werden^11,12. Dieses Monitoring ist entscheidend für die Beurteilung der Qualität, Intensität und Persistenz von Immunantworten sowie für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen T-Zellen und anderen Immunzellen. Darüber hinaus ermöglicht die In-vitro-Expansion antigenspezifischer T-Zellen eine großflächige Anreicherung, erhöht die Nachweisempfindlichkeit und verbessert die Beurteilung der T-Zell-Reaktionsniveaus¹³. Daher dient die In-vitro-Kultur von antigenspezifischen T-Zellen als leistungsfähiges Instrument, um die Rolle von Geflügel-T-Zellen bei Immunantworten besser zu verstehen, was die Empfindlichkeit des Nachweises erhöht und die Beurteilung der T-Zell-Reaktionsniveaus verbessert. Während ähnliche In-vitro-Methoden in Säugetiersystemen gut etabliert sind, ist die Anwendung solcher Techniken bei Vogelarten nach wie vor begrenzt. Dies ist besonders relevant für die Immunologie von Geflügel, wo die Werkzeuge zur Analyse von T-Zell-Antworten noch unterentwickelt sind. Vor allem Enten dienen als natürliches Reservoir für mehrere Vogelgrippeviren, doch über ihre antigenspezifische T-Zell-Immunität ist wenig bekannt. Daher ist die Entwicklung eines standardisierten In-vitro-T-Zellkulturprotokolls, das auf Vogelsysteme zugeschnitten ist, unerlässlich, um sowohl die Grundlagenforschung als auch die angewandte Immunologie bei Geflügel voranzubringen.

Ein wichtiges Zytokin, das an diesen Prozessen beteiligt ist, ist IFN-γ, ein Typ-II-Interferon, das hauptsächlich von CD8⁺-T-Zellen, Typ-1-CD4⁺-T-Zellen und NK-Zellen produziert^{wird 14}. IFN-γ spielt eine entscheidende Rolle bei der Hemmung der Virusreplikation und der Regulierung der Immunantwort¹⁵. Das Expressionsniveau von IFN-γ spiegelt den Immunstatus wider und dient als Marker für die Aktivierung von T-Zellen, was es den Forschern ermöglicht, das Antwortniveau von T-Zellen anhand seiner Expression zu beurteilen^16,17. Eine gängige Methode zum Nachweis der Zytokinexpression in Immunzellen ist die intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS)^18,19. Aufgrund von Einschränkungen bei den experimentellen Materialien und Techniken ist die Forschung an Enten jedoch hinter der an Säugetieren zurückgeblieben⁵. Gegenwärtig verlassen sich viele Forscher auf qPCR, um die IFN-γ-Expressionsniveaus zu messen, obwohl diese Methode gewisse Einschränkungen aufweist¹¹. In unserem Labor ist es uns gelungen, einen Antikörper gegen Enten-IFN-γ zu entwickeln, der mit der Durchflusszytometrie kompatibel ist. Aufbauend auf diesem Erfolg haben wir in dieser Studie eine ICS-Methode zum Nachweis der IFN-γ-Proteinexpression in Enten-T-Zellen etabliert, die ein zuverlässiges Werkzeug für weitere Studien über Enten-T-Zell-Antworten bietet.

Alle Versuche mit allen verfügbaren Viren der aviären Influenza A (H5N1) wurden in einem Labor und einer tierischen Einrichtung der Biosicherheitsstufe 3 gemäß den Protokollen der South China Agricultural University (CNAS BL0011) durchgeführt. Alle Tierversuchsprojekte wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (Identifikationscode 2021f154, 29. Juli 2021) der South China Agriculture University genehmigt. Alle Tierverfahren wurden in Übereinstimmung mit den von diesem Ausschuss festgelegten Vorschriften und Richtlinien sowie den internationalen Standards für den Tierschutz durchgeführt. Bei den in dieser Studie verwendeten Tieren handelte es sich um 4 Wochen alte Hausstockenten (Anas platyrhynchos domestica), darunter sowohl männliche als auch weibliche Tiere mit einem Körpergewicht von 500 bis 600 g.

1. Isolierung von Enten-PBMCs und Herstellung einer einzelligen Suspension

1. Entnehmen Sie 2 ml heparinisiertes Blut aus der Halsvene jeder Ente und überführen Sie es in EDTA-haltige Röhrchen, um eine Gerinnung jeder einzelnen Ente zu verhindern
2. Verdünnen Sie das Blut mit dem mitgelieferten Probenverdünnungsmittel aus dem Lymphozyten-Isolationskit oder PBS. Vorsichtig mischen, indem Sie mit einer Pasteur-Pipette pipettieren. Das übliche Verdünnungsverhältnis beträgt 1:1 für Blut zu Verdünnungsmittel.
3. Übertragen Sie ein gleiches Volumen der Lymphozytentrennungslösung in ein Zentrifugenröhrchen wie das verdünnte Blut. Schichten Sie die Blutsuspension vorsichtig auf die Lymphozytentrennlösung. Die Mischung bei 400 x g, 25 °C 15 min zentrifugieren, dabei die Fallbeschleunigung auf 1 einstellen.
   HINWEIS: Die Menge der Lymphozytentrennungslösung sollte nicht weniger als 4 ml betragen. Die Bestandteile des Lymphozytentrennungslösungskits finden Sie in der Materialtabelle.
4. Beobachten Sie nach dem Zentrifugieren die vier unterschiedlichen Schichten im Zentrifugenröhrchen von oben nach unten. Die oberste Schicht ist das Probenverdünnungsmittel, gefolgt von der ringförmigen milchig-weißen Lymphozytenschicht, dann der Trennlösung und die untere Schicht besteht aus roten Blutkörperchen.
5. Entnehmen Sie vorsichtig mit einer Pipette die zweite Schicht, die ringförmige, milchig-weiße Lymphozytenschicht, und übertragen Sie sie in ein neues Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 10 ml Reinigungslösung hinzu, um sie mit den Zellen zu vermischen.
6. Die Probe wird bei 440 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml RPMI 1640-Medium zur Zellzählung.
7. Optional) Um die Probe weiter zu reinigen, verwenden Sie nach dem Zentrifugieren bei 440 x g für 5 Minuten einen Lysepuffer für rote Blutkörperchen, um alle verbleibenden gemischten Blutzellen zu entfernen.

2. In-vitro-H5N1-AIV-spezifische T-Zellkultur

1. Kaufen Sie 2 Wochen alte, gesunde Stockenten (Sheldrake) von einer Entenfarm und halten Sie sie in Unterdruckisolatoren. Bestätigen Sie, dass die Enten negativ für AIV sind, indem Sie vor dem Experiment Hämagglutinationshemmungstests (HI) verwenden. Infizieren Sie 4 Wochen alte Enten mit H5N1 AIV 1 x 10⁶, mit 50% Ei-Infektionsdosis [EID50]/0,2 mL intranasal.
2. Isolieren Sie Gedächtnis-PBMCs von H5N1-infizierten Enten 28 Tage nach der Infektion nach der in Schritt 1 beschriebenen Methode. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer. Verdünnen Sie die Zellsuspension im Verhältnis 1:1 mit 0,08 % Trypanblau und zählen Sie lebensfähige (ungefärbte) Zellen manuell unter einem Lichtmikroskop.
   HINWEIS: Wie in unserer zuvor veröffentlichten Studie²⁰ unterstützt, gelten mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die 28 Tage nach der Infektion isoliert wurden, als mit Gedächtnis-T-Zellen angereichert. In diesem Stadium ist die Effektorphase abgeklungen, und es überwiegen Gedächtniszellpopulationen.
3. Stellen Sie die Konzentration auf 3 x 10⁶ Zellen/ml ein und stellen Sie sicher, dass 1 ml Medium in jede Vertiefung der 48-Well-Platte gegeben wird.
4. Co-Infektion der isolierten PBMCs mit dem H5N1-Vogelgrippevirus (AIV), um als APCs zu dienen. Die Virusdosis beträgt MOI = 5. Die PBMCs werden 1 h lang bei 37 °C mit dem Virus co-kultiviert. Alle 15 Min. vorsichtig mit der Hand schütteln.
5. Nach 1 h Infektion waschen Sie die Zellen 2x mit PBS, um ungebundene Viruspartikel zu entfernen. Die gewaschenen PBMCs werden in 1 ml T-Zell-Kulturmedium resuspendiert und die suspendierten Zellen 5 h lang bei 37 °C inkubiert.
6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 440 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Anschließend resuspendieren Sie die inkubierten antigenpräsentierenden Zellen (APCs) in 100 μl T-Zellkulturmedium und fügen sie den Effektorzellen hinzu. Das Verhältnis von Antigen-präsentierenden Zellen zu Effektorzellen sollte 1:5 betragen.
7. Inkubieren Sie die Zellen 14 Tage lang in einer 5%igen CO₂ -Atmosphäre bei 37 °C. Ersetzen Sie alle 2 Tage die Hälfte des Zellkulturüberstands durch frisches T-Zellmedium, indem Sie vorsichtig pipettieren, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Verwerfen Sie die Hälfte des Mediums, das die Zellen enthält, und fügen Sie dann das gleiche Volumen des neuen Mediums hinzu.
8. Beobachten Sie die Zellen an Tag 7 unter einem Lichtmikroskop bei 100x.
9. Verwenden Sie PBS-behandelte Gedächtnis-PBMCs als nicht stimulierte Kontrollgruppe.

3. Carboxy Fluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) zur Überwachung der T-Zell-Proliferation

1. Stellen Sie die Zelldichte auf 0,5-1 x 10⁷ Zellen/ml ein und resuspendieren Sie die Zellen mit 5 mL PBS nach Zentrifugation bei 440 x g für 5 Minuten.
2. 10 mM Rohmaterial auf 1 μM CFSE mit 5 mL vorgekühltem PBS verdünnen; Arbeiten Sie im Dunkeln.
3. Kippen Sie die beiden Zentrifugenröhrchen um 45°, geben Sie die CFSE-Verdünnung mit einer Pasteur-Pipette in die Zellsuspension, mischen Sie sie gut und stellen Sie sie für 15 min im Dunkeln in ein 37 °C warmes Wasserbad.
4. Die Zellen werden gewaschen, indem sie in 10 Volumina vorgekühltem PBS mit 5 % FBS verdünnt werden, durch Zentrifugation bei 440 x g für 5 min sedimentieren und der Überstand verworfen wird. Wiederholen Sie den Waschgang 2x.
5. Stimulieren Sie Zellen, die in vitro mit CFSE markiert wurden, gemäß Schritt 2. Nach Abschluss des Proliferationsassays werden die Zellen entnommen und mittels Durchflusszytometrie analysiert.

4. Durchflusszytometrische Analyse auf Proliferation von CD8⁺ T- und CD4⁺ T-Zellen

1. Entnehmen Sie nach 7 Tagen Kultur alle Zellen aus jeder Vertiefung und teilen Sie sie zur Analyse in zwei Durchflussröhrchen auf.
2. Die Zellen werden in ein neues Zentrifugenröhrchen umgefüllt, bei 440 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand entsorgt.
3. Geben Sie 100 μl Antikörper-Cocktail (Maus-Anti-Ente CD8, 1:50 oder Maus-Anti-Ente CD4, 1:50) und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C.
4. Die Zellen werden in ein neues Zentrifugenröhrchen umgefüllt, bei 440 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand entsorgt.
5. Fügen Sie 100 μl Antikörpercocktail (FITC-konjugiertes Goat Anti-Mouse IgG2b, 1:50) hinzu und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C.
6. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL PBS, indem Sie bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Analysieren Sie die Daten mit der FlowJo-Software. Die Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.

5. T-Zell-Antwort durch Signatur-Genexpressionsassays mittels qPCR

1. Zählen Sie die Zellen am Ende der T-Zellkultur, sammeln Sie sie in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 400 x g . Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
2. RNA-Extraktion
   HINWEIS: Die Extraktion kann in einem Abzug oder einer ultrareinen Bank durchgeführt werden, um eine RNA-Kontamination zu verhindern.
   1. Lysieren Sie die Zellen mit dem im Kit enthaltenen Lysepuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die lysierte Probe in gDNA-Filtersäulen überführen (vorplatziert in Sammelröhrchen), zentrifugieren Sie 30 s lang bei 13.400 x g , entsorgen Sie die Säulen und sammeln Sie das Filtrat. Dem Filtrat werden 0,5 Vol.-% absolutes Ethanol zugesetzt. Gründlich mischen.
      HINWEIS: Eine trübe Lösung oder ein trüber Niederschlag nach Zugabe von Ethanol ist normal. Schütteln und mit dem nächsten Schritt fortfahren.
   2. Das Gemisch in RNA-Säulen überführen, bei 13.400 x g für 30 s zentrifugieren. Das Filtrat verwerfen, 700 μl Puffer RW1 hinzufügen und erneut zentrifugieren.
   3. Filtrat verwerfen, 700 μl Puffer RW2 (mit absolutem Ethanol) zugeben und zentrifugieren. Filtrat verwerfen, 500 μl Puffer RW2 (mit absolutem Ethanol) zugeben und 2 Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie die Säule vorsichtig aus dem Röhrchen, um eine Kontamination durch das Filtrat zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass alle Spüllösungen entfernt werden, um Interferenzen bei nachgelagerten Reaktionen zu vermeiden.
   4. Die Säule in ein neues RNase-freies Entnahmeröhrchen umfüllen, 50-200 μl RNase-freies ddH₂O hinzufügen, 1 min bei Raumtemperatur ruhen lassen und dann 1 min lang bei 13.400 x g zentrifugieren, um RNA zu eluieren. Messen Sie die Reinheit und Konzentration der RNA.
      HINWEIS: RNase-freies ddH₂O auf 65 °C vorheizen, um die Ausbeute zu erhöhen, und bei Bedarf eine zweite Elution durchführen.
3. Synthetisieren Sie cDNA gemäß den Anweisungen des Kits. Synthetisieren Sie den cDNA-Strang gemäß den Anweisungen des Herstellers und fügen Sie die 5-fache Menge an reverser Transkriptase hinzu. Rückwärtstranskribieren bei 37 °C für 15 Minuten, dann 85 °C für 5 s und Abkühlen auf 4 °C.
4. Richten Sie die PCR-Reaktion gemäß dem Protokoll des Herstellers ein.
   1. Kombinieren Sie in einem qPCR-Röhrchen 10 μl der 2x PCR-Reaktionsenzymmischung, 0,4 μl Primer 1, 0,4 μl Primer 2, 1 μl cDNA-Template und 8,2 μl ddH₂O, um eine 20 μl-Mischung herzustellen.
   2. Führen Sie die PCR im quantitativen Echtzeit-PCR-Gerät mit dem folgenden Programm durch:
      Stufe 1: 95 °C für 30 s, Rep x 1
      Stufe 2: 95 °C für 3 s, 60 °C für 30 s, Rep x 35
      Stufe 3: 95 °C für 15 s, 60 °C für 60 s, 95 °C für 15 s, Rep x 1

6. Intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS)

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Effektorreaktion von H5N1-spezifischen CD8⁺ T-Zellen durch den Nachweis der intrazellulären IFN-γ-Sekretion bei Enten zu bewerten.

1. Züchten Sie H5N1-spezifische T-Zellen in vitro nach dem in Schritt 2 beschriebenen Verfahren. Ernten Sie alle Zellen (aus jeder Vertiefung) nach 7 Tagen nach Beginn der Kultur.
2. Inkubieren Sie die Antigen-präsentierenden Zellen (APCs), wie in Schritt 2 beschrieben. Geben Sie die inkubierten APCs und Brefeldin A (1:1.000) in die Effektorzellen und inkubieren Sie für 6 h in einem 39 °C Inkubator.
3. Die Zellen werden in ein neues Zentrifugenröhrchen umgefüllt, bei 440 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand entsorgt.
4. Geben Sie 100 μl Antikörpercocktail (Maus-Anti-Ente CD8, 1:50) in die Zellen und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C.
5. Waschen Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 400 x g für 5 min bei 4 °C und resuspendieren Sie sie in 1 mL PBS. Einen Antikörper-Cocktail (FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgG2b, 1:50) zugeben und 30 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
6. Waschen Sie die Zellen erneut, indem Sie bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Der Überstand wird verworfen, die Zellen in 100 μl Fixierungspuffer resuspendiert und 20-25 Minuten im Dunkeln bei 4 °C inkubiert.
7. Waschen Sie die Zellen erneut, indem Sie bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Fügen Sie 1 mL 1x Permeabilisierungspuffer hinzu und waschen Sie die Zellen 2x durch Zentrifugation bei 440 x g für 5 min bei 4 °C.
8. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl Permeabilisierungspuffer und geben Sie den Antikörper (Mouse Anti-Duck IFN-γ, 1:10) zu den Zellen. Nach der Fixierung und Membranpermeabilisierung das Zell-Antikörper-Gemisch 30 min im Dunkeln inkubieren, während der Inkubation bei 4 °C gelegentlich schütteln.
   HINWEIS: Die Permeabilisierungs-/Waschlösung ist eine 10-fache Stammlösung und muss vor der Verwendung mit PBS verdünnt werden.
9. Waschen Sie die Zellen erneut mit 1 mL PBS, indem Sie bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. 100 μl Antikörpercocktail (PE-konjugiertes Goat Anti-Mouse IgG3, 1:250) zugeben und 30 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
10. Analysieren Sie die Daten mit der FlowJo-Software. Die Gating-Strategie ist in Abbildung 1 dargestellt.

Dieses Protokoll wurde auf der Grundlage einer früheren Studie über den Nachweis antigenspezifischer T-Zell-Effektorantworten bei Enten entwickelt²⁰. Der erste Schritt des Experiments umfasst die In-vitro-Kultur von virusspezifischen T-Zellen, die als Grundlage für nachfolgende Effektor-Response-Studien dienen. Zunächst wurden APCs inkubiert und mit Effektorzellen cokultiviert. Morphologische Beobachtungen zeigten, dass die Zellen nach der Proliferation ein Clusterwachstum zeigten (Abbildung 2A). Die CFSE-Markierung bestätigte die erfolgreiche Proliferation weiterhin, indem sie mehrere Peaks der Zellteilung zeigte (Abbildung 2B). Schließlich verwendeten wir die Enten-spezifischen Zellmarker CD8/CD4, um den Anteil und die absolute Anzahl der Zellen²⁰ zu bestimmen, was die erfolgreiche in vitro Kultur von antigenspezifischen T-Zellen bestätigte (Abbildung 2C).

An Tag 7 der Kultur sammelten wir die Zellen und bewerteten die Expression immunbezogener Gene. Wir fanden heraus, dass die proliferierenden T-Zellen überwiegend zytotoxische assoziierte Gene wie Granzyme A und IFN-γ^{exprimierten 11,20} (Abbildung 3), was darauf hindeutet, dass sie hauptsächlich zu zytotoxischen Reaktionen beitragen. Um diese Effektorreaktion weiter zu untersuchen, haben wir ein Enten-spezifisches Färbeprotokoll zum quantitativen Nachweis der IFN-γ-Sekretion durch Enten-T-Zellen etabliert. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um CD8-T-Zellen aus der proliferierten Population mit einem Anti-IFN-γ-Antikörper zu fixieren, zu permeabilisieren und zu markieren. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Hochregulation des Anteils von IFN-γ⁺-Zellen sowohl in CD8^high+T- als auch in CD8^low+T-Populationen nach Antigenstimulation (Abbildung 4), was auf eine robuste Effektorantwort in den CD8⁺ T-Zellen hinweist, die durch Proliferation erzeugt wurde.

Abbildung 1: Gating-Strategie von CD4⁺/CD8⁺T-Zellen. (A) Gating und Analyse des Prozentsatzes und des Phänotyps von CD4⁺ T-Zellen zwischen H5N1-stimulierten und unstimulierten Zellen nach 14 Tagen Kultivierung. (B) Gating und Analyse des Prozentsatzes und des Phänotyps von CD8⁺ T-Zellen zwischen H5N1-stimulierten und unstimulierten Zellen nach 14-tägiger Kultivierung. Diese Zahl wurde von²⁰ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: In vitro Kultur von H5N1 AIV-spezifischen Enten-T-Zellen. (A) Morphologische Analyse von Gedächtnis-PBMCs mit oder ohne Stimulation durch H5N1 AIV. Es wurden zwei unabhängige Experimente mit zwei verschiedenen Entengedächtnis-PBMC-Donatoren durchgeführt. (B) Die Proliferation von CFSE-markierten Gedächtnis-PBMCs wurde durch CFSE-Verdünnung in H5N1-stimulierten Zellen von H5N1-infizierten Enten nach 2-wöchiger Kultur untersucht. Die rote Probe repräsentiert CFSE-markierte Gedächtnis-PBMCs ohne Stimulation, während die gelbe, grüne und schwarze Probe CFSE-markierte Gedächtnis-PBMCs darstellen, die nach 7, 8 bzw. 14 Tagen Kultur mit H5N1 stimuliert wurden. (C) Der prozentuale Anteil von CD4⁺ - und CD8⁺ -T-Zellen wurde zwischen H5N1-stimulierten und unstimulierten Zellen nach 14-tägiger Kultur analysiert. Die statistische Signifikanz wurde mit Hilfe eines ungepaarten t-Tests bestimmt. (D) Die Anzahl der CD4⁺ - und CD8⁺ -T-Zellen wurde zwischen H5N1-stimulierten und unstimulierten Zellen nach 14-tägiger Kultivierung verglichen. Die Daten zu den Prozentsätzen und der Anzahl der T-Zellen wurden aus zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils zwei Replikaten gewonnen. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests ns p > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01 durchgeführt. Diese Zahl wurde von²⁰ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Nachweis der H5N1 AIV-spezifischen Enten-T-Zellantwort mittels qRT-PCR. Die Daten wurden von drei Replikaten in der H5N1-stimulierten bzw. unstimulierten Gruppe gesammelt. Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte ± SEM dargestellt, und der gepaarte t-Test wurde für den statistischen Vergleich verwendet. *p < 0,05, **p < 0,01. Diese Zahl wurde von²⁰ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Durchflusszytometrische Analyse der IFN-γ-Expression in CD8⁺ T-Zellen aus stimulierten Enten-PBMCs. (A) ICS-Gating-Strategie für die stimulierte Gruppe und die Kontrollgruppe. (B) Statistische Analyse der IFN-γ-Expression in CD8^low+ und CD8^high+ Zellen aus Enten-PBMCs nach Stimulation. Der Unterschied in der IFN-γ-Expression zwischen den Gruppen wurde mittels t-Test bewertet, und Vergleiche wurden bei p≤ 0,05 als signifikant angesehen. Diese Zahl wurde von²⁰ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Gating-Strategie für CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Dieses Protokoll bietet eine effiziente Methode für die In-vitro-Kultivierung von Enten-Antigen-spezifischen T-Zellen und etabliert auch ein intrazelluläres Zytokin-Färbeprotokoll für Enten, das zur Beurteilung der Effektorreaktionen von T-Zellen verwendet werden kann. Derzeit gibt es keine veröffentlichten Berichte über In-vitro-Kulturprotokolle für Enten-T-Zellen. Wir haben uns in erster Linie auf Protokolle für humane antigenspezifische T-Zellen bezogen, sind aber bestrebt, die Inkubationsbedingungen für APCs zu optimieren. Wir denken über eine weitere Optimierung unseres Differenzierungsprotokolls nach.

Es gibt zwei kritische Schritte in diesem Protokoll, die für seinen Erfolg unerlässlich sind. Erstens erfordert die In-vitro-Kultur von Enten-T-Zellen eine sorgfältige Optimierung der Stimulationsbedingungen, einschließlich der Antigendosis, der APC-Aktivierung und der Kulturdauer, um eine ausreichende T-Zell-Expansion und Funktionserhaltung zu gewährleisten. Jede Abweichung dieser Parameter kann zu einer suboptimalen Aktivierung oder zum Zelltod führen. Zweitens ist der ICS-Assay eine Schlüsseltechnik zur funktionellen Bewertung der IFN-γ Expression. Eine erfolgreiche ICS erfordert eine präzise Kontrolle der Stimulationszeit, der Fixations-/Permeabilisierungsschritte und der Antikörperspezifität. Beide Schritte sind hochempfindlich und müssen sorgfältig durchgeführt werden, um einen zuverlässigen und reproduzierbaren Nachweis von antigenspezifischen T-Zell-Antworten zu erreichen.

Hier verwendeten wir Durchflusszytometrie zum Nachweis der Zellproliferation und qPCR zur Untersuchung der Produktion von charakteristischen Zytokinen. Am wichtigsten ist, dass wir erfolgreich eine Hybridom-Zelllinie exprimierten und aufreinigten, die Maus-Anti-Enten-IFN-γ-Antikörper produzierte, die zum Nachweis der IFN-γ-Expression verwendet wurden, wodurch das Effektor-Response-Level von T-Zellen bewertet wurde. Mit ein paar kleinen Modifikationen könnte dieser Ansatz auch für Zellproliferationsassays bei anderen Spezies, wie z.B. Hühnern, adaptiert werden.

Wir haben ein Isolationskit für mononukleäre Blutzellen (PBMC) verwendet, um Enten-PBMCs zu isolieren, da das Kit sowohl effektiv als auch zeitsparend ist. Andere Trennverfahren, wie z. B. das Precoll-Trennverfahren,^{können ebenfalls das} Ziel der Isolierung von Enten-PBMCs durch verschiedene Schritte erreichen. Im Vergleich zum Kit nehmen diese Methoden jedoch mehr Zeit in Anspruch.

Bei der Ausführung dieses Protokolls können einige Probleme auftreten. Erstens ist die T-Zell-Proliferation nach viraler Stimulation in erster Linie eine Reaktion von Gedächtnis-T-Zellen 22,23,24. Um eine ordnungsgemäße T-Zell-Proliferation zu gewährleisten, empfehlen wir die Verwendung von Enten, die 4-10 Wochen nach der Infektion sind. Derzeit gibt es verschiedene Methoden zur Isolierung von Enten-PBMCs, und die Effizienz der PBMC-Isolierung kann je nach verwendetem Trennmedium variieren. Es wird empfohlen, ein weithin zertifiziertes Trennmedium zu verwenden und so viele Lymphozyten wie möglich zu extrahieren²⁵.

Zweitens ergab die Durchflusszytometrie, dass der Anteil von CD8⁺ T- und CD4⁺ T-Zellen an der Proliferation beide weniger als 15 % betrug, was daran liegen könnte, dass die in diesem Protokoll kultivierten T-Zellen hauptsächlich aus PBMCs stammen, in denen der Anteil an CD8⁺ T- und CD4⁺ T-Zellen von Natur aus gering ist. Zukünftige Experimente mit Milzgewebe könnten aussagekräftigere Ergebnisse liefern.

Drittens kann es vorkommen, dass sich während des Kulturprozesses viele T-Zell-Cluster nicht bilden, und einige Zellen können während der T-Zell-Differenzierung absterben. Dieses Phänomen ist in der nicht stimulierten Kontrollgruppe stärker ausgeprägt. Dieses Problem könnte darauf zurückzuführen sein, dass die unstimulierte Gruppe bei der Kultivierung von T-Zellen keine Aktivierungs- und Co-Stimulationssignale erhält, was direkt zum programmierten Zelltod führt.

Viertens haben wir eine Hybridom-Zelllinie konstruiert und erfolgreich eine große Menge an Maus-Anti-Enten-IFN-γ-Antikörpern exprimiert und gereinigt. Unter Verwendung dieser Antikörper haben wir ein intrazelluläres Zytokin-Färbeprotokoll zum Nachweis von Enten-IFN-γ entwickelt. Als nächstes testeten wir die Sensitivität der Antikörper mittels ELISA und optimierten die Färbekonzentration für die Durchflusszytometrie, um schließlich die optimale Konzentration auf 1:10 zu bestimmen, gepaart mit PE-Goat Anti-Mouse IgG3 als Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:250. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die Expression von IFN-γ in der stimulierten Gruppe 2%-3% betrug. Der relativ geringe Anteil an IFN-γ-produzierenden Zellen kann darauf zurückgeführt werden, dass die T-Zellen nur einmal stimuliert wurden. Eine einzige Runde der Antigenstimulation reicht möglicherweise nicht aus, um die Population antigenspezifischer T-Zellen auf ein nachweisbares Niveau zu erweitern. Wiederholte Antigenstimulationsrunden können antigenspezifische T-Zellen anreichern und ihre Aktivierung verbessern, wodurch sich der Anteil der IFN-γ-positiven Zellen erhöht. Darüber hinaus ist die reagierende T-Zellpopulation nach nur einer Stimulation wahrscheinlich immer noch polyklonal. Durch wiederholte Stimulation und Selektion kann eine stärker klonal angereicherte T-Zellpopulation erhalten werden, die tendenziell eine höhere IFN-γ-Produktion aufweist ^26,27.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das vorliegende Protokoll ein Verfahren zur Induktion der Proliferation von Entenantigen-spezifischen T-Zellen in vitro beschreibt und ein intrazelluläres Färbeprotokoll zum Nachweis von Enten-IFN-γ etabliert. Dieser Ansatz verbessert unser Verständnis der Immunantworten von Enten-T-Zellen, bietet ein zuverlässiges Werkzeug zur Bewertung von T-Zell-Antworten und trägt dazu bei, die Forschung in der viralen Immunologie von Vögeln voranzutreiben.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (32473060 und 32461120064) (zu MD und ML); Guangzhou Basic and Applied Basic Research Project (2025A04J5445) (an MD); die Young Scholars des Yangtze River Scholar Professor Program (2024, Manman Dai); und der Young Peal River Scholar des "Guangdong Special Support Plan" (2024, Manman Dai). Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.