במבחנה תרבית לתאי T ברווז ספציפיים ל-H5N1 וזיהוי תגובות חיסוניות בשיטת צביעת ציטוקינים תוך תאית

הפרוטוקול מתאר שיטה לתרבית תאי T של עופות במבחנה על ידי בידוד תאי T זיכרון מברווזים נגועים, מה שמאפשר יצירת תאי T ספציפיים של ברווז מטוהרים מאוד. בנוסף, הוקמה שיטת צביעת ציטוקינים תוך-תאית (ICS) למדידה מדויקת של הפרשת IFN-γ בתאי T של ברווז.

תרבית חוץ גופית של תאי T היא שיטה קריטית לחקר תגובות חיסוניות, זיהומים נגיפיים ואסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות. עם זאת, עד כה לא דווח על פרוטוקולים מבוססים לתרבית תאי T של עופות במבחנה . במחקר זה, אנו מציגים לראשונה פרוטוקול, תוך שימוש בנגיף שפעת העופות הפתוגני ביותר (HPAIV) H5N1 כמודל. כאן, ברווזים בני 4 שבועות נדבקו בנגיף, ולימפוציטים מסוג T בודדו 28 ימים לאחר ההדבקה לתרבית לימפוציטים מסוג T ספציפיים ל-H5N1, מה שאפשר לחקור את התגובה החיסונית הספציפית לנגיף H5N1. השלבים העיקריים בפרוטוקול כוללים בידוד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי זיכרון (PBMCs) מברווזים נגועים, הפעלת תאים מציגי אנטיגן (APCs) עם ריבוי אופטימלי של זיהום (MOI = 5) למשך 6 שעות, והכנת מצע תרבית תאי T בתוספת IL-2 רקומביננטי ותוספים ספציפיים אחרים. התפשטות תאי T, הפרשת ציטוקינים ופעילות ציטוטוקסית היו במעקב צמוד לאורך כל התהליך. בנוסף, הקמנו פרוטוקול צביעת ציטוקינים תוך תאיים כדי לכמת הפרשת IFN-γ בתאי T ברווז. זה כלל יצירת קו תאים היברידומה המבטא נוגדנים IgG3κ ספציפיים לברווז IFN-γ, ואחריו טיהור נוגדנים מוצלח. הנוגדן המטוהר דולל ביחס של 1:10 ויושם בזרימה ציטומטרית כדי למדוד במדויק את הפרשת IFN-γ. שיטה זו מציעה כלי אמין להערכת תגובות תאי T של ברווזים ומניחה את היסודות למחקרים עתידיים באימונולוגיה של נגיף העופות.

תהליך ההפעלה, ההתרבות, ההתמיינות וההמרה של תאי T לתאי זיכרון הוא מרכזי בתגובות חיסוניות ספציפיות לאנטיגן¹. בתחילה, תאי T מופעלים כאשר קולטני תאי ה-T שלהם (TCR) מזהים פפטידים אנטיגניים המוצגים על פני התאים המציגים אנטיגן (APCs) על ידי מולקולות קומפלקס תאימות היסטולוגית (MHC) ^2,3. תהליך הפעלה זה דורש לא רק קשירה של TCR למולקולות MHC אלא גם תיאום של אותות מעוררים משותפים, שהם חיוניים להפעלה מלאה של תפקודי תאי T⁴. לאחר ההפעלה, תאי T נכנסים במהירות לשלב ההתפשטות, ויוצרים שיבוטים רבים החולקים את אותה ספציפיות אנטיגן כמו תא ה-T המקורי. במהלך שלב התפשטות זה, תאי T מתמיינים עוד יותר על סמך תפקודם, בעיקר לתאי CD8⁺ T ותאי CD4⁺ T⁵. תאים ממוינים אלה מתווכים הרג ציטוטוקסי ומסייעים לתגובות חיסוניות, בהתאמה. לאחר ההדבקה הראשונית, חלק מתאי ה-T המופעלים הופכים לתאי T זיכרון ארוכי חיים⁶. תאי זיכרון T אלה יכולים להישאר במערכת החיסון לתקופות ממושכות, ולהגיב במהירות לאותו פתוגן בחשיפה חוזרת. כתוצאה מכך, הם מייצרים תגובה חיסונית חזקה ויעילה יותר, ומספקים הגנה חיסונית ארוכת טווח למארח⁷. כל התהליך הזה הוא קריטי לתכנון חיסוני תאי T, מכיוון שהוא מסייע בשיפור יעילות החיסון ועמידותו^.

בהקשר זה, טיפוח תאי T ספציפיים לאנטיגן במבחנה הופך להיות חיוני. פרוטוקול זה פותח על בסיס שיטות מבוססות לתרבית חוץ גופית של תאי T אנושיים, עם התאמות נדרשות^למערכת החיסון של העופות. על ידי גידול תאים אלה מחוץ לגוף, חוקרים יכולים לחקור את תגובת תאי T במצבים חיסוניים שונים, כגון הפעלה, התפשטות, התמיינות ויצירת זיכרון¹⁰. גישה זו במבחנה לא תסולא בפז להבנת התפקידים שתאי T ממלאים בתגובות החיסוניות. יתר על כן, בתנאי תרבית חוץ גופית, ניתן לנטר את הפרשת הציטוקינים (כגון IFN-γ) על ידי תאי T^11,12. ניטור זה חיוני להערכת האיכות, העוצמה וההתמדה של תגובות חיסוניות, כמו גם לחקר האינטראקציות בין תאי T לתאי חיסון אחרים. בנוסף, הרחבה במבחנה של תאי T ספציפיים לאנטיגן מאפשרת העשרה בקנה מידה גדול, מגבירה את רגישות הזיהוי ומשפרת את הערכת רמות התגובה של תאי T¹³. לפיכך, תרבית חוץ גופית של תאי T ספציפיים לאנטיגן משמשת ככלי רב עוצמה להבנה טובה יותר של תפקידם של תאי T עופות בתגובות חיסוניות, מה שמגביר את רגישות הזיהוי ומשפר את הערכת רמות התגובה של תאי T. בעוד ששיטות מבחנה דומות התבססו היטב במערכות יונקים, היישום של טכניקות כאלה במיני עופות נותר מוגבל. זה רלוונטי במיוחד באימונולוגיה של עופות, שבה כלים לניתוח תגובות תאי T אינם מפותחים. ברווזים, במיוחד, משמשים כמאגרים טבעיים למספר נגיפי שפעת עופות, אך מעט ידוע על חסינות תאי ה-T הספציפית לאנטיגן שלהם. לכן, פיתוח פרוטוקול תרבית תאי T סטנדרטי במבחנה המותאם למערכות עופות חיוני לקידום מחקר בסיסי ואימונולוגיה יישומית בעופות.

ציטוקין מרכזי המעורב בתהליכים אלה הוא IFN-γ, אינטרפרון מסוג II המיוצר בעיקר על ידי תאי CD8⁺ T, תאי CD4⁺ T מסוג 1 ותאי NK¹⁴. IFN-γ ממלא תפקיד מכריע בעיכוב שכפול הנגיף ובוויסות תגובות חיסוניות¹⁵. רמת הביטוי של IFN-γ משקפת את המצב החיסוני ומשמשת כסמן להפעלת תאי T, ומאפשרת לחוקרים להעריך את רמות התגובה של תאי T באמצעות ביטויו^16,17. שיטה נפוצה אחת לזיהוי ביטוי ציטוקינים בתאי חיסון היא צביעת ציטוקינים תוך תאית (ICS)^18,19. עם זאת, בשל מגבלות בחומרים ובטכניקות ניסיוניות, המחקר על ברווזים פיגר אחרי זה של יונקים⁵. נכון לעכשיו, חוקרים רבים מסתמכים על qPCR כדי למדוד את רמות הביטוי של IFN-γ, אם כי לשיטה זו יש מגבלות מסוימות¹¹. במעבדה שלנו פיתחנו בהצלחה נוגדן ל-IFN-γ ברווז התואם לזרימה ציטומטרית. בהתבסס על הצלחה זו, במחקר זה, ביססנו שיטת ICS לאיתור ביטוי חלבון IFN-γ בתאי T ברווז, המספקת כלי אמין למחקר נוסף על תגובות תאי T של ברווז.

כל הניסויים עם כל נגיפי שפעת העופות A (H5N1) הזמינים בוצעו במעבדה ובמתקן לבעלי חיים ברמת בטיחות ביולוגית 3 על פי הפרוטוקולים של האוניברסיטה החקלאית של דרום סין (CNAS BL0011). כל פרויקטי המחקר בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (קוד זיהוי 2021f154, 29 ביולי 2021) של אוניברסיטת החקלאות של דרום סין. כל הטיפולים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לתקנות ולהנחיות שנקבעו על ידי ועדה זו ולתקנים בינלאומיים לרווחת בעלי חיים. בעלי החיים ששימשו במחקר זה היו ברווזי בית בני 4 שבועות (Anas platyrhynchos domestica), כולל זכרים ונקבות כאחד, עם משקל גוף שנע בין 500 ל-600 גרם.

1. בידוד PBMCs ברווז והכנת מתלה חד תאי

1. אוספים 2 מ"ל של דם הפריני מווריד הצוואר של כל ברווז ומעבירים לצינורות המכילים EDTA כדי למנוע קרישה מכל ברווז בודד
2. לדלל את הדם באמצעות מדלל הדגימה שסופק מערכת בידוד הלימפוציטים או PBS. מערבבים בעדינות על ידי פיפטה עם פיפטה פסטר. יחס הדילול הרגיל הוא 1:1 לדילול הדם.
3. העבירו נפח שווה של תמיסת הפרדת לימפוציטים לצינור צנטריפוגה כמו הדם המדולל. שכב בזהירות את תרחיף הדם על גבי תמיסת הפרדת הלימפוציטים. צנטריפוגה את התערובת ב-400 x גרם, 25 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, תוך הגדרת תאוצת הנפילה ל-1.
   הערה: כמות תמיסת הפרדת הלימפוציטים לא צריכה להיות פחות מ-4 מ"ל. ניתן למצוא את מרכיבי ערכת תמיסת הפרדת הלימפוציטים בטבלת החומרים.
4. לאחר הצנטריפוגה, התבונן בארבע השכבות הנפרדות בצינור הצנטריפוגה מלמעלה למטה. השכבה העליונה היא מדלל הדגימה, ואחריה שכבת הלימפוציטים הלבנה החלבית הטבעתית, ואז תמיסת ההפרדה, והשכבה התחתונה מורכבת מתאי דם אדומים.
5. השתמש בזהירות בפיפטה כדי לאסוף את השכבה השנייה, שכבת הלימפוציטים הלבנה החלבית הטבעתית, ולהעביר אותה לצינור צנטריפוגה חדש. הוסף 10 מ"ל תמיסת ניקוי כדי לערבב עם התאים.
6. צנטריפוגה את הדגימה ב-440 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט, ואז השעו מחדש את כדור התא ב-10 מ"ל של מדיום RPMI 1640 לספירת תאים.
7. אופציונלי) כדי לטהר עוד יותר את הדגימה, לאחר צנטריפוגה ב-440 x גרם למשך 5 דקות, השתמש במאגר ליזה של תאי דם אדומים כדי להסיר את כל תאי הדם המעורבים שנותרו.

2. תרבית תאי T ספציפית ל-H5N1 AIV במבחנה

1. רכשו ברווזים בריאים בני שבועיים (שלדרייק) מחוות ברווזים ושיכנו אותם במבודדים בלחץ שלילי. ודא שהברווזים שליליים ל-AIV על ידי שימוש במבחני עיכוב המגלוטינציה (HI) לפני הניסוי. הדביקו ברווזים בני 4 שבועות ב-H5N1 AIV 1 x 10⁶, עם מינון זיהומי של 50% ביצה [EID50]/0.2 מ"ל תוך האף.
2. בודדו PBMCs זיכרון מברווזים נגועים ב-H5N1 28 ימים לאחר ההדבקה, בהתאם לשיטה המתוארת בשלב 1. ספור תאים באמצעות המוציטומטר. יש לדלל את תרחיף התאים ביחס של 1:1 עם 0.08% טריפאן כחול ולספור תאים ברי קיימא (לא מוכתמים) באופן ידני תחת מיקרוסקופ אור.
   הערה: כפי שנתמך במחקר²⁰ שפורסם בעבר, תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) שבודדו 28 ימים לאחר ההדבקה נחשבים מועשרים בתאי T זיכרון. בשלב זה, שלב האפקטור שכך, ואוכלוסיות תאי הזיכרון דומיננטיות.
3. הגדר את הריכוז ל-3 x 10⁶ תאים/מ"ל, וודא ש-1 מ"ל של מדיום מתווסף לכל באר של צלחת 48 הבארות.
4. להדביק את ה-PBMCs המבודדים בנגיף שפעת העופות H5N1 (AIV) כדי לשמש כנגמ"שים. המינון הנגיפי הוא MOI = 5. תרבית משותפת של PBMCs עם הנגיף למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. יש לנער בעדינות ביד כל 15 דקות.
5. לאחר שעה אחת של זיהום, שטפו את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר חלקיקים נגיפיים לא קשורים. השעו מחדש את ה-PBMCs השטופים ב-1 מ"ל של מדיום תרבית תאי T ודגרו עוד יותר את התאים התלויים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות.
6. צנטריפוגה של התאים ב -440 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים מציגי האנטיגן המודגרים (APCs) ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי T והוסיפו אותם לתאי האפקטור. היחס בין תאים מציגי אנטיגן לתאי אפקטור צריך להיות 1:5.
7. דגרו את התאים באטמוספירה של 5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 14 יום. כל יומיים, החלף מחצית מחומר העל של תרבית התאים במדיום תאי T טרי על ידי פיפטינג זהיר כדי להבטיח פיזור אחיד. השליכו מחצית מהמדיום המכיל את התאים, ואז הוסיפו נפח שווה של מדיום חדש.
8. ביום השביעי, התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ אופטי ב-100x.
9. השתמש ב-PBMC זיכרון שטופל ב-PBS כקבוצת הבקרה הלא מגורה.

3. קרבוקסי פלואורסצאין דיאצטט סוקסינימידיל אסטר (CFSE) לניטור התפשטות תאי T

1. התאם את צפיפות התאים ל-0.5-1 x 10⁷ תאים/מ"ל והשהה מחדש את התאים עם 5 מ"ל PBS לאחר צנטריפוגה ב-440 x גרם למשך 5 דקות.
2. לדלל מלאי של 10 מ"מ ל-1 מיקרומטר CFSE עם 5 מ"ל של PBS מקורר מראש; לפעול בחושך.
3. הטה את שני צינורות הצנטריפוגה ב-45°, הוסף את דילול ה-CFSE לתרחיף התא בעזרת פיפטה פסטר, ערבב היטב והניח באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך.
4. שטפו תאים על ידי דילול שלהם ב-10 נפחים של PBS מקורר מראש המכיל 5% FBS, משקעים על ידי צנטריפוגה ב-440 x גרם למשך 5 דקות, והשליכו את הסופרנטנט. חזור על הכביסה פעמיים.
5. לעורר תאים המסומנים ב-CFSE במבחנה לפי שלב 2. בסיום בדיקת ההתפשטות, קצרו תאים ונתחו על ידי ציטומטריית זרימה.

4. אנליזה ציטומטרית זרימה לשגשוג תאי CD8⁺ T ו-CD4⁺ T

1. לאחר 7 ימי תרבית, אספו את כל התאים מכל באר וחלקו אותם לשני צינורות זרימה לניתוח.
2. העבירו את התאים לצינור צנטריפוגה חדש, צנטריפוגה בטמפרטורה של 440 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנט.
3. הוסף 100 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים (עכבר נגד ברווז CD8, 1:50 או עכבר נגד ברווז CD4, 1:50) ודגר על התאים למשך 30 דקות בחושך ב-4 מעלות צלזיוס.
4. העבירו את התאים לצינור צנטריפוגה חדש, צנטריפוגה בטמפרטורה של 440 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנט.
5. הוסף 100 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים (מצומד עזים נגד עכבר IgG2b, 1:50) ודגר על התאים למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. שטפו את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל PBS על ידי צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. נתח את הנתונים באמצעות תוכנת FlowJo. אסטרטגיית השער מוצגת באיור משלים 1.

5. תגובת תאי T על ידי מבחני ביטוי גנים חתימה באמצעות qPCR

1. ספרו תאים בסוף תרבית תאי T, אספו בצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט בזהירות.
2. מיצוי RNA
   הערה: ניתן לבצע מיצוי במכסה אדים או בספסל נקי במיוחד כדי למנוע זיהום RNA.
   1. ליזה את התאים באמצעות מאגר הליזיס המסופק בערכה בהתאם להוראות היצרן. העבר דגימה ליזה לעמודות מסנן gDNA (מונחות מראש בצינורות איסוף), צנטריפוגה ב-13,400 x גרם למשך 30 שניות, השליך עמודות ואסוף את הסינון. הוסף 0.5 נפח אתנול מוחלט לסינון. מערבבים היטב.
      הערה: תמיסה עכורה או משקעים לאחר הוספת אתנול הם נורמליים. לנער ולהמשיך לשלב הבא.
   2. מעבירים את התערובת לעמודי RNA, צנטריפוגה בחום של 13,400 x גרם למשך 30 שניות. השליכו את הסינון, הוסיפו 700 מיקרוליטר של Buffer RW1 ושוב צנטריפוגה.
   3. השליכו פילטר, הוסיפו 700 מיקרוליטר של Buffer RW2 (עם אתנול מוחלט) וצנטריפוגה. השליכו את הסינון, הוסיפו 500 מיקרוליטר של Buffer RW2 (עם אתנול מוחלט), וצנטריפוגה למשך 2 דקות. הסר בזהירות את העמוד מהצינור כדי למנוע זיהום מהפילטר. ודא שכל תמיסות השטיפה הוסרו כדי למנוע הפרעות בתגובות במורד הזרם.
   4. העבירו את העמודה לצינור איסוף חדש ללא RNase, הוסיפו 50-200 מיקרוליטר של ddH₂O ללא RNase, הניחו לו לשבת בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת, ואז צנטריפוגה ב-13,400 x g למשך דקה אחת כדי לחסל RNA. למדוד טוהר וריכוז RNA.
      הערה: מחממים מראש ddH ללא RNase₂O עד 65 מעלות צלזיוס לתפוקה מוגברת ומבצעים פליטה שנייה במידת הצורך.
3. סנתז cDNA בהתאם להוראות הערכה. סנתז את גדיל ה-cDNA לפי הוראות היצרן, והוסף פי 5 מכמות הטרנסקריפטאז ההפוך. תמלול הפוך ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, לאחר מכן 85 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, ומצנן ל-4 מעלות צלזיוס.
4. הגדר תגובת PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן.
   1. בשפופרת qPCR, שלב 10 מיקרוליטר של תערובת אנזימי תגובה של 2x PCR, 0.4 מיקרוליטר של פריימר 1, 0.4 מיקרוליטר של פריימר 2, 1 מיקרוליטר של תבנית cDNA ו-8.2 מיקרוליטר של ddH₂O כדי ליצור תערובת של 20 מיקרוליטר.
   2. הפעל PCR במכשיר PCR כמותי בזמן אמת עם התוכנית הבאה:
      שלב 1: 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, חזרה x 1
      שלב 2: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, חזרה x 35
      שלב 3: 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, חזרה x 1

6. צביעת ציטוקינים תוך תאית (ICS)

הערה: פרוטוקול זה פותח כדי להעריך את תגובת האפקטור של תאי CD8⁺ T ספציפיים ל-H5N1 על ידי זיהוי הפרשת IFN-γ תוך תאית בברווזים.

1. תרבית תאי T ספציפיים ל-H5N1 במבחנה בעקבות ההליך המתואר בשלב 2. קצרו את כל התאים (מכל באר) לאחר 7 ימים של התחלת התרבות.
2. דגרו על התאים מציגי האנטיגן (APCs) כמתואר בשלב 2. הוסף את הנגמ"שים המודגרים ואת ברפלדין A (1:1,000) לתאי האפקטור ודגירה משותפת למשך 6 שעות בחממה של 39 מעלות צלזיוס.
3. העבירו את התאים לצינור צנטריפוגה חדש, צנטריפוגה בטמפרטורה של 440 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנט.
4. הוסף 100 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים (עכבר נגד ברווז CD8, 1:50) לתאים ודגר במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. שטפו את התאים על ידי צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשעו אותם מחדש ב-1 מ"ל של PBS. הוסיפו קוקטייל נוגדנים (מצומד FITC עז נגד עכבר IgG2b, 1:50) ודגרו במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. שטפו את התאים שוב על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר קיבוע, ודגרו במשך 20-25 דקות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
7. שטפו את התאים פעם נוספת על ידי צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הוסף 1 מ"ל של מאגר חדירות 1x ושטוף את התאים פי 2 על ידי צנטריפוגה ב-440 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
8. השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר חדירה, והוסיפו את הנוגדן (Mouse Anti-Duck IFN-γ, 1:10) לתאים. לאחר קיבוע וחדירת הממברנה, יש לדגור על תערובת התאים-נוגדנים למשך 30 דקות בחושך, ומדי פעם לרעוד במהלך הדגירה ב-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: תמיסת החדירה/שטיפה היא תמיסת מלאי פי 10 ויש לדלל אותה עם PBS לפני השימוש.
9. שטפו את התאים פעם נוספת עם 1 מ"ל PBS על ידי צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הוסף 100 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים (מצומד PE עז נגד עכבר IgG3, 1:250) ודגירה למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
10. נתח את הנתונים באמצעות תוכנת FlowJo. אסטרטגיית השער מוצגת באיור 1.

פרוטוקול זה פותח על סמך מחקר קודם על זיהוי תגובות אפקטור תאי T ספציפיות לאנטיגן בברווזים²⁰. השלב הראשון של הניסוי כולל תרבית חוץ גופית של תאי T ספציפיים לנגיף, המשמשים כבסיס למחקרי תגובת אפקטור הבאים. בתחילה, APCs הודגרו ותרבו יחד עם תאי אפקטור. תצפיות מורפולוגיות גילו שאחרי ההתפשטות, התאים הראו גדילת אשכולות (איור 2A). תיוג CFSE אישר עוד יותר התפשטות מוצלחת על ידי הצגת שיאים מרובים של חלוקת תאים (איור 2B). לבסוף, השתמשנו בסמני תאים ספציפיים לברווז CD8/CD4 כדי להעריך את הפרופורציה והמספרים המוחלטים של תאים²⁰, מה שאישר את ההצלחה של תרבית מבחנה של תאי T ספציפיים לאנטיגן (איור 2C).

ביום השביעי של התרבית, אספנו את התאים והערכנו את ביטוי הגנים הקשורים למערכת החיסון. מצאנו שתאי T המתרבים ביטאו בעיקר גנים הקשורים לציטוטוקסיות כמו Granzyme A ו-IFN-γ^11,20 (איור 3), מה שמרמז על כך שהם תורמים בעיקר לתגובות ציטוטוקסיות. כדי לחקור עוד יותר את תגובת האפקטור הזו, הקמנו פרוטוקול צביעה ספציפי לברווז כדי לזהות כמותית הפרשת IFN-γ על ידי תאי T ברווז. ציטומטריית זרימה שימשה לקיבוע, חדירה ותיוג של תאי CD8 T מהאוכלוסייה המתפשטת עם נוגדן נגד IFN-γ. התוצאות הראו עלייה משמעותית בשיעור תאי IFN-γ⁺ הן באוכלוסיות CD8^גבוה+T והן באוכלוסיות CD8^{נמוכות+}T לאחר גירוי אנטיגן (איור 4), מה שמצביע על תגובת אפקטור חזקה בתאי CD8⁺ T שנוצרו על ידי התפשטות.

איור 1: אסטרטגיית שער של תאי CD4⁺/CD8⁺T. (A) שער וניתוח של האחוז והפנוטיפ של תאי CD4⁺ T בין תאים מגורים ובלתי מגורים H5N1 לאחר 14 ימי תרבית. (B) שער וניתוח של האחוז והפנוטיפ של תאי CD8⁺ T בין תאים מגורים ולא מגורים של H5N1 לאחר 14 ימי תרבית. נתון זה שונה^מ-20. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תרבית חוץ גופית של תאי T ברווז ספציפיים ל-H5N1 AIV. (A) ניתוח מורפולוגי של PBMCs זיכרון עם או בלי גירוי על ידי H5N1 AIV. שני ניסויים עצמאיים נערכו באמצעות שני תורמי PBMC שונים של זיכרון ברווז. (B) התפשטות של PBMCs זיכרון עם תווית CFSE הוערכה על ידי דילול CFSE בתאים מגורים H5N1 מברווזים נגועים ב-H5N1 לאחר שבועיים של תרבית. הדגימה האדומה מייצגת PBMCs זיכרון המסומנים ב-CFSE ללא גירוי, בעוד שהדגימות הצהובות, הירוקות והשחורות מייצגות PBMCs זיכרון המסומנים ב-CFSE המגורים עם H5N1 לאחר 7, 8 ו-14 ימים של תרבית, בהתאמה. (C) אחוז תאי CD4⁺ ו-CD8⁺ T נותח בין תאים מגורים ובלתי מגורים H5N1 לאחר 14 יום של תרבית. מובהקות סטטיסטית נקבעה באמצעות מבחן t לא מזווג. (D) מספר תאי CD4⁺ ו-CD8⁺ T הושווה בין תאים מגורים H5N1 לתאים לא מגורים לאחר 14 יום של תרבית. נתונים על אחוזים ומספרים של תאי T התקבלו משני ניסויים עצמאיים עם שני שכפולים כל אחד. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t לא מזווג ns p > 0.05, *p < 0.05, **p < 0.01. נתון זה שונה^מ-20. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: זיהוי תגובת תאי T ברווז ספציפיים ל-H5N1 AIV על ידי qRT-PCR. הנתונים נאספו משלושה שכפולים בקבוצה מגורה H5N1 ובקבוצה לא מגורה, בהתאמה. התוצאות הוצגו כאמצעים ± SEM, ומבחן ה-t הזוגי שימש להשוואה סטטיסטית. *עמ' < 0.05, **עמ' < 0.01. נתון זה שונה^מ-20. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי IFN-γ בתאי CD8⁺ T מ-PBMCs ברווז מגורה. (A) אסטרטגיית שער ICS עבור הקבוצה המגורה וקבוצת הביקורת. (B) ניתוח סטטיסטי של ביטוי IFN-γ בתאי CD8^low+ ו-CD8^high+ מ-PBMCs של ברווז לאחר גירוי. ההבדל בביטוי IFN-γ בין הקבוצות הוערך על ידי מבחן t, וההשוואות נחשבו משמעותיות ב-p≤ 0.05. נתון זה שונה^מ-20. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: אסטרטגיית שער המשמשת לתאי CD4^{+ ו-CD8+} T. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה לתרבית חוץ גופית של תאי T ספציפיים לאנטיגן ברווז וגם קובע פרוטוקול צביעת ציטוקינים תוך תאיים לברווזים, שניתן להשתמש בו כדי להעריך את תגובות האפקטור של תאי T. נכון לעכשיו, אין דיווחים שפורסמו על פרוטוקולי תרבית חוץ גופית עבור תאי T ברווזים. התייחסנו בעיקר לפרוטוקולים לתאי T ספציפיים לאנטיגן אנושי, אך אנו מחויבים לייעל את תנאי הדגירה עבור APCs. אנו שוקלים אופטימיזציה נוספת של פרוטוקול הבידול שלנו.

ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה החיוניים להצלחתו. ראשית, תרבית חוץ גופית של תאי T ברווז דורשת אופטימיזציה זהירה של תנאי הגירוי, כולל מינון אנטיגן, הפעלת APC ומשך התרבית, כדי להבטיח התרחבות מספקת של תאי T ושימור תפקודי. כל סטייה בפרמטרים אלה עלולה להוביל להפעלה לא אופטימלית או למוות של תאים. שנית, בדיקת ICS היא טכניקת מפתח להערכה פונקציונלית של ביטוי IFN-γ. ICS מוצלח דורש שליטה מדויקת בזמן הגירוי, שלבי קיבוע/חדירות וספציפיות הנוגדנים. שני השלבים רגישים ביותר ויש לבצע אותם בזהירות כדי להשיג זיהוי אמין וניתן לשחזור של תגובות תאי T ספציפיות לאנטיגן.

כאן, השתמשנו בזרימה ציטומטרית כדי לזהות התפשטות תאים ו-qPCR כדי לבחון את הייצור של ציטוקינים סימני היכר. והכי חשוב, ביטאנו וטיהרנו בהצלחה קו תאי היברידומה המייצר נוגדנים נגד ברווז IFN-γ של עכברים, ששימשו לזיהוי ביטוי IFN-γ, ובכך הערכנו את רמת תגובת האפקטור של תאי T. עם כמה שינויים קלים, גישה זו יכולה להיות מותאמת גם לבדיקות התפשטות תאים במינים אחרים, כגון תרנגולות.

השתמשנו בערכת בידוד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMC) כדי לבודד PBMCs ברווזים מכיוון שהערכה יעילה וחוסכת זמן. שיטות הפרדה אחרות, כגון שיטת ההפרדה של Precoll,^{יכולות גם להשיג} את המטרה של בידוד PBMCs ברווזים באמצעות שלבים שונים. עם זאת, בהשוואה לערכה, שיטות אלה לוקחות יותר זמן.

בעיות מסוימות עשויות להתעורר במהלך ביצוע פרוטוקול זה. ראשית, התפשטות תאי T בגירוי ויראלי היא בעיקר תגובה של תאי זיכרון T 22,23,24. כדי להבטיח התפשטות תקינה של תאי T, אנו ממליצים להשתמש בברווזים שנמצאים 4-10 שבועות לאחר ההדבקה. נכון לעכשיו, ישנן שיטות שונות זמינות לבידוד PBMCs ברווזים, והיעילות של בידוד PBMCs עשויה להשתנות בהתאם לאמצעי ההפרדה בו נעשה שימוש. מומלץ להשתמש במדיום הפרדה מוסמך באופן נרחב ולחלץ כמה שיותר לימפוציטים²⁵.

שנית, ציטומטריית זרימה זיהתה כי שיעור תאי CD8⁺ T ו-CD4⁺ T בשגשוג היה שניהם פחות מ-15%, וייתכן שהסיבה לכך היא שתאי ה-T שגודלו בפרוטוקול זה מגיעים בעיקר מ-PBMCs, שבהם שיעור תאי CD8⁺ T ו-CD4⁺ T נמוך מטבעו. ניסויים עתידיים ברקמת הטחול עשויים להניב תוצאות משמעותיות יותר.

שלישית, במהלך תהליך התרבית, אשכולות תאי T רבים עשויים שלא להיווצר, וחלק מהתאים עלולים למות במהלך התמיינות תאי T. תופעה זו בולטת יותר בקבוצת הביקורת הלא מגורה. בעיה זו עשויה לנבוע מהעובדה שכאשר תאי T מתורבתים, הקבוצה הלא מגורה אינה מקבלת אותות הפעלה וגירוי משותף, מה שמוביל ישירות למוות תאי מתוכנת.

רביעית, בנינו קו תאי היברידומה וביטאנו וטיהרנו בהצלחה כמות גדולה של נוגדנים נגד ברווזים IFN-γ עכברים. באמצעות נוגדנים אלה, פיתחנו פרוטוקול צביעת ציטוקינים תוך תאיים לזיהוי IFN-γ ברווז. לאחר מכן, בדקנו את רגישות הנוגדנים באמצעות ELISA וביצענו אופטימיזציה של ריכוז הצביעה עבור ציטומטריית זרימה, ובסופו של דבר קבענו את הריכוז האופטימלי ל-1:10, בשילוב עם PE-Goat Anti-Mouse IgG3 כנוגדנים משניים בדילול של 1:250. תוצאות הניסוי הראו כי הביטוי של IFN-γ בקבוצה המעוררת היה 2%-3%. ניתן לייחס את השיעור הנמוך יחסית של תאים המייצרים IFN-γ לעובדה שתאי T גורו רק פעם אחת. ייתכן שסבב אחד של גירוי אנטיגן לא יספיק כדי להרחיב את אוכלוסיית תאי ה-T הספציפיים לאנטיגן לרמה הניתנת לזיהוי. סבבים חוזרים ונשנים של גירוי אנטיגן יכולים להעשיר תאי T ספציפיים לאנטיגן ולהגביר את הפעלתם ובכך להגדיל את שיעור התאים החיוביים ל-IFN γ. יתר על כן, לאחר גירוי אחד בלבד, אוכלוסיית תאי ה-T המגיבה ככל הנראה עדיין רב-שבטית. באמצעות גירוי וברירה חוזרים ונשנים, ניתן להשיג אוכלוסיית תאי T מועשרת יותר באופן משובט, הנוטה להציג רמות גבוהות יותר של ייצור IFN-γ^26,27.

לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה להשראת התפשטות תאי T ספציפיים לאנטיגן ברווז במבחנה וקובע פרוטוקול צביעה תוך-תאי לזיהוי IFN-γ ברווז. גישה זו משפרת את הבנתנו את התגובות החיסוניות של תאי T ברווזים, מציעה כלי אמין להערכת תגובות תאי T ותורמת לקידום המחקר באימונולוגיה נגיפית של עופות.

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32473060 ו-32461120064) (ל-MD ו-ML); פרויקט מחקר בסיסי ויישומי בגואנגג'ואו (2025A04J5445) (ל-MD); החוקרים הצעירים של תוכנית הפרופסורים המלומדים של נהר היאנגצה (2024, מנמן דאי); וחוקר נהר פיל הצעיר של "תוכנית התמיכה המיוחדת של גואנגדונג" (2024, Manman Dai). למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף הנתונים וניתוחם, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד.