JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول طريقة لزراعة الخلايا التائية للطيور في المختبر عن طريق عزل خلايا الذاكرة التائية عن البط المصاب ، مما يسمح بتوليد خلايا تائية محددة للبط عالية النقاء. بالإضافة إلى ذلك ، تم إنشاء طريقة تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا (ICS) لقياس إفراز IFN-γ بدقة في خلايا البط التائية.

Abstract

تعد الثقافة في المختبر للخلايا التائية طريقة حاسمة لدراسة الاستجابات المناعية والالتهابات الفيروسية والاستراتيجيات العلاجية المحتملة. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن أي بروتوكولات ثابتة لزراعة الخلايا التائية للطيور في المختبر حتى الآن. في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا لأول مرة ، باستخدام فيروس أنفلونزا الطيور شديد الإمراض (HPAIV) H5N1 كنموذج. هنا ، أصيب البط البالغ من العمر 4 أسابيع بالفيروس ، وتم عزل الخلايا الليمفاوية التائية للذاكرة بعد 28 يوما من الإصابة إلى زراعة الخلايا الليمفاوية التائية للبطة الخاصة ب H5N1 ، مما مكن من التحقيق في الاستجابة المناعية المحددة لفيروس H5N1. تشمل الخطوات الرئيسية في البروتوكول عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة للذاكرة (PBMCs) من البط المصاب ، وتنشيط الخلايا العارضة للمستضد (APCs) مع تعدد مثالي للعدوى (MOI = 5) لمدة 6 ساعات ، وإعداد وسائط زراعة الخلايا التائية المكملة ب IL-2 المؤتلف وإضافات محددة أخرى. تمت مراقبة تكاثر الخلايا التائية وإفراز السيتوكين والنشاط السام للخلايا عن كثب طوال العملية. بالإضافة إلى ذلك ، أنشأنا بروتوكول تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا لتحديد إفراز IFN-γ في خلايا البط التائية. تضمن ذلك توليد خط خلية الورم الهجين الذي يعبر عن الأجسام المضادة IgG3κ الخاصة بالبط IFN-γ ، متبوعا بتنقية ناجحة للأجسام المضادة. تم تخفيف الجسم المضاد المنقى بنسبة 1:10 وتطبيقه في قياس التدفق الخلوي لقياس إفراز IFN-γ بدقة. توفر هذه الطريقة أداة موثوقة لتقييم استجابات الخلايا التائية للبط وتضع الأساس للتحقيقات المستقبلية في المناعة الفيروسية للطيور.

Introduction

تعد عملية تنشيط الخلايا التائية وتكاثرها وتمايزها وتحويلها إلى خلايا ذاكرة تائية أمرا أساسيا للاستجابات المناعية الخاصة بالمستضد1. في البداية ، يتم تنشيط الخلايا التائية عندما تتعرف مستقبلات الخلايا التائية (TCR) على الببتيدات المستضدية المعروضة على سطح الخلايا العارضة للمستضد (APCs) بواسطة جزيئات مركب التوافق النسيجي الرئيسي (MHC)2،3. لا تتطلب عملية التنشيط هذه ارتباط TCR بجزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير فحسب ، بل تتطلب أيضا تنسيق إشارات التحفيز المشترك ، والتي تعتبر ضرورية لتنشيط وظائف الخلايا التائيةبالكامل 4. بمجرد تنشيطها ، تدخل الخلايا التائية بسرعة مرحلة التكاثر ، وتولد العديد من المستنسخة التي تشترك في نفس خصوصية المستضد مثل الخلية التائية الأصلية. خلال مرحلة الانتشار هذه ، تتمايز الخلايا التائية بناء على وظيفتها ، بشكل أساسي إلى خلايا CD8 + T وخلايا CD4 + T5. تتوسط هذه الخلايا المتمايزة في قتل المواد السامة للخلايا وتساعد في الاستجابات المناعية ، على التوالي. بعد الإصابة الأولية ، يتحول جزء من الخلايا التائية المنشطة إلى خلايا تائية طويلة العمر6. يمكن أن تستمر خلايا الذاكرة التائية هذه في الجهاز المناعي لفترات طويلة ، وتستجيب بسرعة لنفس العامل الممرض عند إعادة التعرض. نتيجة لذلك ، فإنها تولد استجابة مناعية أقوى وأكثر كفاءة ، مما يوفر حماية مناعية طويلة الأمد للمضيف7. هذه العملية برمتها ضرورية لتصميم لقاحات الخلايا التائية ، لأنها تساعد على تحسين فعالية اللقاح ومتانته.

في هذا السياق ، تصبح زراعة الخلايا التائية الخاصة بالمستضد في المختبر أمرا ضروريا. تم تطوير هذا البروتوكول بناء على الأساليب المعمول بها للزراعة المختبرية للخلايا التائية البشرية ، مع التعديلات اللازمة لجهاز المناعة للطيور9. من خلال زراعة هذه الخلايا خارج الجسم ، يمكن للباحثين دراسة استجابة الخلايا التائية في ظل حالات مناعية مختلفة ، مثل التنشيط والتكاثر والتمايز وتكوين الذاكرة10. هذا النهج في المختبر لا يقدر بثمن لفهم الأدوار التي تلعبها الخلايا التائية في الاستجابات المناعية. علاوة على ذلك ، في ظل ظروف الثقافة المختبرية ، يمكن مراقبة إفراز السيتوكينات (مثل IFN-γ) بواسطة الخلايا التائية11،12. هذه المراقبة ضرورية لتقييم جودة الاستجابات المناعية وشدتها واستمرارها ، بالإضافة إلى دراسة التفاعلات بين الخلايا التائية والخلايا المناعية الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يتيح التوسع في المختبر للخلايا التائية الخاصة بالمستضد التخصيب على نطاق واسع ، ويزيد من حساسية الكشف ، ويعزز تقييم مستويات استجابة الخلاياالتائية 13. وبالتالي ، فإن الثقافة المختبرية للخلايا التائية الخاصة بالمستضد تعمل كأداة قوية لفهم دور الخلايا التائية للدواجن بشكل أفضل في الاستجابات المناعية ، مما يزيد من حساسية الكشف ويعزز تقييم مستويات استجابة الخلايا التائية. في حين أن الأساليب المتشابهة في المختبر راسخة في أنظمة الثدييات ، فإن تطبيق هذه التقنيات في أنواع الطيور لا يزال محدودا. هذا مهم بشكل خاص في علم مناعة الدواجن ، حيث تكون أدوات تحليل استجابات الخلايا التائية متخلفة. يعمل البط ، على وجه الخصوص ، كمستودعات طبيعية للعديد من فيروسات إنفلونزا الطيور ، ومع ذلك لا يعرف سوى القليل عن مناعة الخلايا التائية الخاصة بالمستضد. لذلك ، يعد تطوير بروتوكول موحد لزراعة الخلايا التائية في المختبر مصمم خصيصا لأنظمة الطيور أمرا ضروريا للنهوض بكل من البحوث الأساسية والمناعة التطبيقية في الدواجن.

السيتوكين الرئيسي المشارك في هذه العمليات هو IFN-γ ، وهو إنترفيرون من النوع الثاني تنتجه بشكل أساسي خلايا CD8 + T ، والخلايا التائية من النوع 1 CD4 + ، والخلايا التائية14. يلعب IFN-γ دورا مهما في تثبيط تكاثر الفيروس وتنظيم الاستجابات المناعية15. يعكس مستوى التعبير في IFN-γ الحالة المناعية ويعمل كعلامة لتنشيط الخلايا التائية ، مما يمكن الباحثين من تقييم مستويات استجابة الخلايا التائية من خلال تعبيرها16،17. إحدى الطرق الشائعة للكشف عن تعبير السيتوكين في الخلايا المناعية هي تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا (ICS) 18،19. ومع ذلك ، نظرا للقيود المفروضة على المواد والتقنيات التجريبية ، فقد تخلفت الأبحاث عن بحث البط عن الثدييات5. في الوقت الحاضر ، يعتمد العديد من الباحثين على qPCR لقياس مستويات تعبير IFN-γ ، على الرغم من أن هذه الطريقة لها قيودمعينة 11. في مختبرنا ، نجحنا في تطوير جسم مضاد ل البط IFN-γ متوافق مع قياس التدفق الخلوي. بناء على هذا النجاح ، في هذه الدراسة ، أنشأنا طريقة ICS للكشف عن تعبير بروتين IFN-γ في خلايا البط التائية ، مما يوفر أداة موثوقة لمزيد من الدراسة حول استجابات الخلايا التائية للبط.

Protocol

أجريت جميع التجارب على جميع فيروسات أنفلونزا الطيور A (H5N1) المتاحة في مختبر للسلامة البيولوجية الحيوانية المستوى 3 ومنشأة حيوانية وفقا لبروتوكولات جامعة جنوب الصين الزراعية (CNAS BL0011). تمت الموافقة على جميع مشاريع الأبحاث الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (رمز التعريف 2021f154 ، 29 يوليو 2021) لجامعة جنوب الصين الزراعية. تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للأنظمة والمبادئ التوجيهية التي وضعتها هذه اللجنة والمعايير الدولية لرعاية. كانت المستخدمة في هذه الدراسة هي البط المنزلي البالغ من العمر 4 أسابيع (Anas platyrhynchos domestica) ، بما في ذلك كل من الذكور والإناث ، وتتراوح أوزان الجسم من 500 إلى 600 جرام.

1. عزل PBMCs البط وإعداد تعليق أحادي الخلية

  1. اجمع 2 مل من الدم الهباريني من الوريد الوداجي لكل بطة وانقله إلى أنابيب تحتوي على EDTA لمنع التخثر من كل بطة على حدة
  2. تمييع الدم باستخدام المخفف للعينة المقدم من مجموعة عزل الخلايا الليمفاوية أو PBS. تخلط برفق عن طريق سحب العينة باستخدام ماصة باستور. نسبة التخفيف المعتادة هي 1: 1 للدم إلى المخفف.
  3. انقل كمية متساوية من محلول فصل الخلايا الليمفاوية إلى أنبوب طرد مركزي مثل الدم المخفف. ضع طبقة من معلق الدم بحذر فوق محلول فصل الخلايا الليمفاوية. قم بالطرد المركزي للخليط عند 400 × جم ، 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، مع ضبط تسارع الهبوط على 1.
    ملاحظة: يجب ألا تقل كمية محلول فصل الخلايا الليمفاوية عن 4 مل. يمكن العثور على مكونات مجموعة محلول فصل الخلايا الليمفاوية في جدول المواد.
  4. بعد الطرد المركزي ، راقب الطبقات الأربع المميزة في أنبوب الطرد المركزي من أعلى إلى أسفل. الطبقة العليا هي العينة المخففة ، تليها طبقة الخلايا الليمفاوية البيضاء الحليبية الحلبية الحلقية ، ثم محلول الفصل ، وتتكون الطبقة السفلية من خلايا الدم الحمراء.
  5. استخدم ماصة بعناية لجمع الطبقة الثانية ، طبقة الخلايا الليمفاوية البيضاء الحليبية الحلقية ، ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي جديد. أضف 10 مل من محلول التنظيف لخلطه مع الخلايا.
  6. الطرد المركزي للعينة عند 440 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية ، ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من وسط RPMI 1640 لعد الخلايا.
  7. اختياري) لمزيد من تنقية العينة ، بعد الطرد المركزي عند 440 × جم لمدة 5 دقائق ، استخدم المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء لإزالة أي خلايا دم مختلطة متبقية.

2. في المختبر H5N1 ثقافة الخلايا التائية الخاصة ب AIV

  1. قم بشراء بط البطة الصحي البالغ من العمر أسبوعين (شيلدريك) من مزرعة البط وقم بإوائه في عوازل الضغط السلبي. تأكد من أن البط سلبي بالنسبة ل AIV باستخدام فحوصات تثبيط التخثر الدموي (HI) قبل التجربة. يصيب البط البالغ من العمر 4 أسابيع ب H5N1 AIV 1 × 106 ، بجرعة معدية للبيض بنسبة 50٪ [EID50] / 0.2 مل عن طريق الأنف.
  2. عزل PBMCs الذاكرة من البط المصاب بفيروس H5N1 بعد 28 يوما من الإصابة ، باتباع الطريقة الموضحة في الخطوة 1. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. قم بتخفيف تعليق الخلية بنسبة 1: 1 مع 0.08٪ تريبان بلو واحسب الخلايا القابلة للحياة (غير الملوثة) يدويا تحت المجهر الضوئي.
    ملاحظة: كما دعمت دراستنا المنشورةسابقا 20 ، تعتبر خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) المعزولة بعد 28 يوما من الإصابة غنية بخلايا الذاكرة التائية. في هذه المرحلة ، هدأت مرحلة المستجيب ، وتسود مجموعات خلايا الذاكرة.
  3. اضبط التركيز على 3 × 106 خلايا / مل ، مع ضمان إضافة 1 مل من الوسط إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 48 بئرا.
  4. العدوى المشتركة بين ثنائي الفينيل متعدد الميكروبات المعزولة بفيروس أنفلونزا الطيور H5N1 لتكون بمثابة ناقلات ناقلة من الجنود المدرعة. الجرعة الفيروسية هي وزارة الداخلية = 5. استزراع PBMCs مع الفيروس لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. رج العبوة برفق باليد كل 15 دقيقة.
  5. بعد ساعة واحدة من العدوى ، اغسل الخلايا 2x باستخدام PBS لإزالة الجزيئات الفيروسية غير المرتبطة. أعد تعليق PBMCs المغسولة في 1 مل من وسط زراعة الخلايا التائية وقم باحتضان الخلايا العالقة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات.
  6. الطرد المركزي للخلايا عند 440 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق الخلايا العارضة للمستضد المحتضنة (APCs) في 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا التائية وإضافتها إلى الخلايا المستجيبة. يجب أن تكون نسبة الخلايا العارضة للمستضد إلى الخلايا المستجيبة 1: 5.
  7. احتضان الخلايا في جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية لمدة 14 يوما. كل يومين ، استبدل نصف المادة الطافية لزراعة الخلايا بوسط خلية تائية طازجة عن طريق سحب العينة بعناية لضمان التوزيع المتساوي. تجاهل نصف الوسيط الذي يحتوي على الخلايا ، ثم أضف حجما متساويا من الوسط الجديد.
  8. في اليوم 7 ، راقب الخلايا تحت المجهر البصري عند 100x.
  9. أستخدم PBMCs للذاكرة المعالجة ب PBS كمجموعة تحكم غير محفزة.

3. كربوكسي فلوريسين ثنائي الأسيتات السكسينيميديل إستر (CFSE) لمراقبة تكاثر الخلايا التائية

  1. اضبط كثافة الخلية على 0.5-1 × 107 خلايا / مل وأعد تعليق الخلايا ب 5 مل من PBS بعد الطرد المركزي عند 440 × جم لمدة 5 دقائق.
  2. تخفيف مخزون 10 ملي مولار إلى 1 ميكرومتر CFSE مع 5 مل من PBS المبرد مسبقا ؛ تعمل في الظلام.
  3. قم بإمالة أنبوبي الطرد المركزي عند 45 درجة ، وأضف تخفيف CFSE إلى تعليق الخلية باستخدام ماصة باستور ، واخلطها جيدا ، وضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.
  4. اغسل الخلايا عن طريق تخفيفها في 10 أحجام من PBS المبرد مسبقا الذي يحتوي على 5٪ FBS ، والرواسب عن طريق الطرد المركزي عند 440 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. كرر الغسيل 2x.
  5. تحفيز الخلايا المسمى مع CFSE في المختبر وفقا للخطوة 2. عند الانتهاء من مقايسة التكاثر ، قم بحصاد الخلايا وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

4. تحليل قياس التدفق الخلوي لتكاثر الخلايا التائية CD8 + T و CD4 +

  1. بعد 7 أيام من الثقافة ، اجمع جميع الخلايا من كل بئر وقسمها إلى أنبوبين للتدفق لتحليلها.
  2. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي جديد ، وجهاز طرد مركزي عند 440 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية.
  3. أضف 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة (الفأر المضاد للبط CD8 ، 1:50 أو الفأر المضاد للبط CD4 ، 1:50) واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
  4. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي جديد ، وجهاز طرد مركزي عند 440 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية.
  5. أضف 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة (الماعز المترافق ب FITC IgG2b ، 1:50) واحتضن الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
  6. اغسل الخلايا مرة واحدة ب 1 مل من PBS عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo. يتم عرض استراتيجية البوابات في الشكل التكميلي 1.

5. استجابة الخلايا التائية عن طريق فحوصات التعبير الجيني المميز باستخدام qPCR

  1. عد الخلايا في نهاية زراعة الخلايا التائية ، واجمعها في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية بعناية.
  2. استخراج الحمض النووي الريبي
    ملاحظة: يمكن إجراء الاستخراج في غطاء الدخان أو مقعد فائق النظافة لمنع تلوث الحمض النووي الريبي.
    1. قم بتحليل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت للتحلل الموجود في المجموعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. انقل العينة المحللة إلى أعمدة مرشح gDNA (الموضوعة مسبقا في أنابيب التجميع) ، وأجهزة الطرد المركزي عند 13,400 × جم لمدة 30 ثانية ، وتجاهل الأعمدة ، وجمع المرشح. أضف 0.5 حجم من الإيثانول المطلق إلى المرشح. تخلط جيدا.
      ملاحظة: يعد المحلول الغائم أو الترسيب بعد إضافة الإيثانول أمرا طبيعيا. رج العبوة وانتقل إلى الخطوة التالية.
    2. نقل الخليط إلى أعمدة الحمض النووي الريبي، جهاز طرد مركزي عند 13,400 × جم لمدة 30 ثانية. تخلص من المرشح ، وأضف 700 ميكرولتر من Buffer RW1 ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى.
    3. تخلص من المرشح ، وأضف 700 ميكرولتر من Buffer RW2 (مع الإيثانول المطلق) ، وجهاز الطرد المركزي. تخلص من المرشح ، وأضف 500 ميكرولتر من Buffer RW2 (مع الإيثانول المطلق) ، وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقتين. قم بإزالة العمود بعناية من الأنبوب لتجنب التلوث من المرشح. تأكد من إزالة جميع محاليل الشطف لمنع التداخل في تفاعلات المصب.
    4. انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد خال من RNase ، وأضف 50-200 ميكرولتر من ddH2O الخالي من RNase ، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 13,400 × جم لمدة 1 دقيقة لإزالة الحمض النووي الريبي. قياس نقاء الحمض النووي الريبي وتركيزه.
      ملاحظة: قم بتسخين ddH2O الخالي من RNase إلى 65 درجة مئوية لزيادة الإنتاجية وإجراء شطف ثان إذا لزم الأمر.
  3. قم بتصنيع (كدنا) باتباع تعليمات المجموعة. قم بتجميع حبلا (كدنا) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، مع إضافة 5 أضعاف كمية النسخ العكسي. قم بالنسخ العكسي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم 85 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، وتبرد إلى 4 درجات مئوية.
  4. قم بإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    1. في أنبوب qPCR ، امزج 10 ميكرولتر من مزيج إنزيم تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل 2x ، و 0.4 ميكرولتر من التمهيدي 1 ، و 0.4 ميكرولتر من التمهيدي 2 ، و 1 ميكرولتر من قالب (كدنا) ، و 8.2 ميكرولتر من ddH2O لعمل مزيج 20 ميكرولتر.
    2. قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل في أداة PCR الكمي في الوقت الفعلي باستخدام البرنامج التالي:
      المرحلة 1: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، مندوب × 1
      المرحلة 2: 95 درجة مئوية لمدة 3 ثوان ، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، مندوب × 35
      المرحلة 3: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، مندوب × 1

6. تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا (ICS)

ملاحظة: تم تطوير هذا البروتوكول لتقييم استجابة المستجيب لخلايا CD8 + T الخاصة ب H5N1 عن طريق الكشف عن إفراز IFN-γ داخل الخلايا في البط.

  1. زراعة الخلايا التائية الخاصة ب H5N1 في المختبر باتباع الإجراء الموضح في الخطوة 2. حصاد جميع الخلايا (من كل بئر) بعد 7 أيام من بدء الزراعة.
  2. احتضان الخلايا العارضة للمستضد (APCs) كما هو موضح في الخطوة 2. أضف ناقلات الجنود المدرعة المحتضنة و Brefeldin A (1: 1,000) إلى الخلايا المستجيبة واحتضانها لمدة 6 ساعات في حاضنة 39 درجة مئوية.
  3. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي جديد ، وجهاز طرد مركزي عند 440 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية.
  4. أضف 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة (الفأر المضاد للبط CD8 ، 1:50) إلى الخلايا واحتضنه لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
  5. اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وأعد تعليقها في 1 مل من PBS. أضف كوكتيل الأجسام المضادة (IGG2b المترافق مع الماعز IgG2b ، 1:50) واحتضنه لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
  6. اغسل الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت ، واحتضن لمدة 20-25 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
  7. اغسل الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أضف 1 مل من 1x المخزن المؤقت للنفاذية واغسل الخلايا 2x عن طريق الطرد المركزي عند 440 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  8. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية ، وأضف الجسم المضاد (Mouse Anti-Duck IFN-γ ، 1:10) إلى الخلايا. بعد التثبيت ونفاذية الغشاء ، احتضن خليط الخلية والأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة في الظلام ، واهتز أحيانا أثناء الحضانة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: محلول النفاذية / الغسيل عبارة عن محلول مخزون 10x ويجب تخفيفه باستخدام PBS قبل الاستخدام.
  9. اغسل الخلايا مرة أخرى ب 1 مل من PBS عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أضف 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة (الماعز المترافق ب PE IgG3 ، 1: 250) واحتضنه لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
  10. تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo. يتم عرض استراتيجية البوابات في الشكل 1.

النتائج

تم تطوير هذا البروتوكول بناء على دراسة سابقة حول الكشف عن استجابات مستجيب الخلايا التائية الخاصة بالمستضد في البط20. تتضمن الخطوة الأولى من التجربة زراعة الخلايا التائية الخاصة بالفيروسات في المختبر ، والتي تعمل كأساس لدراسات الاستجابة المستجيبة اللاحقة. في البداية ، تم احتضان APCs وزراعتها بشكل مشترك مع الخلايا المستجيبة. كشفت الملاحظات المورفولوجية أنه بعد الانتشار ، أظهرت الخلايا نموا عنقوديا (الشكل 2 أ). أكد وضع العلامات على CFSE الانتشار الناجح من خلال إظهار قمم متعددة لانقسام الخلايا (الشكل 2 ب). أخيرا ، استخدمنا علامات الخلايا الخاصة بالبط CD8 / CD4 لتقييم النسبة والأعداد المطلقة للخلايا20 ، مما يؤكد نجاح الثقافة المختبرية للخلايا التائية الخاصة بالمستضد (الشكل 2 ج).

في اليوم السابع من المزرعة ، جمعنا الخلايا وقمنا بتقييم التعبير عن الجينات المرتبطة بالمناعة. وجدنا أن الخلايا التائية المتكاثرة تعبر في الغالب عن الجينات المرتبطة بالسمية للخلايا مثل Granzyme A و IFN-γ11،20 (الشكل 3) ، مما يشير إلى أنها تساهم بشكل أساسي في الاستجابات السامة للخلايا. لمزيد من التحقيق في استجابة المستجيب هذه ، أنشأنا بروتوكول تلطيخ خاص بالبط للكشف الكمي عن إفراز IFN-γ بواسطة خلايا البط التائية. تم استخدام قياس التدفق الخلوي لإصلاح خلايا CD8 T وتنفذها وتسميتها من السكان المتكاثرين بجسم مضاد مضاد ل IFN-γ. أظهرت النتائج تنظيما كبيرا في نسبة خلايا IFN-γ + في كل من مجموعات CD8عالية + T و CD8منخفضة + T بعد تحفيز المستضد (الشكل 4) ، مما يشير إلى استجابة مستجيب قوية في خلايا CD8 + T الناتجة عن الانتشار.

figure-results-1881
الشكل 1: استراتيجية البوابات لخلية CD4 + / CD8 + T. (أ) البوابات وتحليل النسبة المئوية والنمط الظاهري للخلايا التائية CD4 + بين الخلايا المحفزة وغير المحفزة H5N1 بعد 14 يوما من الزراعة. (ب) بوابات وتحليل النسبة المئوية والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 + بين الخلايا المحفزة وغير المحفزة H5N1 بعد 14 يوما من الاستزراع. تم تعديل هذا الرقم من20. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2670
الشكل 2: مزرعة في المختبر لخلايا البط التائية الخاصة ب H5N1 AIV. (أ) التحليل المورفولوجي ل PBMCs الذاكرة مع أو بدون تحفيز بواسطة H5N1 AIV. تم إجراء تجربتين مستقلتين باستخدام اثنين من المتبرعين المختلفين لذاكرة البط PBMC. (ب) تم تقييم تكاثر PBMCs الذاكرة المسماة CFSE عن طريق تخفيف CFSE في الخلايا المحفزة H5N1 من البط المصاب ب H5N1 بعد أسبوعين من الاستزراع. تمثل العينة الحمراء PBMCs الذاكرة المسماة CFSE بدون تحفيز ، بينما تمثل العينات الصفراء والخضراء والسوداء PBMCs الذاكرة المسماة CFSE المحفزة ب H5N1 بعد 7 و 8 و 14 يوما من الثقافة ، على التوالي. (ج) تم تحليل النسبة المئوية للخلايا التائية CD4 + و CD8 + بين الخلايا المحفزة ب H5N1 والخلايا غير المحفزة بعد 14 يوما من الزراعة. تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t غير متزاوج. (د) تمت مقارنة عدد الخلايا التائية CD4 + و CD8 + بين الخلايا المحفزة ب H5N1 والخلايا غير المحفزة بعد 14 يوما من الزراعة. تم الحصول على بيانات عن النسب المئوية للخلايا التائية وأعدادها من تجربتين مستقلتين مع نسختين مكررتين لكل منهما. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير متزاوج ns p > 0.05 ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01. تم تعديل هذا الرقم من20. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4248
الشكل 3: الكشف عن استجابة الخلايا التائية البطية الخاصة ب H5N1 AIV بواسطة qRT-PCR. تم جمع البيانات من ثلاث مكررات في المجموعة المحفزة H5N1 والمجموعة غير المحفزة ، على التوالي. تم تقديم النتائج كوسيلة ± SEM ، وتم استخدام اختبار t المزدوج للمقارنة الإحصائية. * ص < 0.05 ، ** ص < 0.01. تم تعديل هذا الرقم من20. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4922
الشكل 4: تحليل قياس التدفق الخلوي لتعبير IFN-γ في خلايا CD8 + T من PBMCs البط المحفز. (أ) استراتيجية بوابة ICS للمجموعة المحفزة والمجموعة الضابطة. (ب) التحليل الإحصائي لتعبير IFN-γ في خلايا CD8منخفضة + و CD8عالية + من PBMCs البط بعد التحفيز. تم تقييم الفرق في تعبير IFN-γ بين المجموعات بواسطة t-test، واعتبرت المقارنات ذات دلالة إحصائية عند p≤ 0.05. تم تعديل هذا الرقم من20. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: استراتيجية البوابات المستخدمة لخلايا CD4 + و CD8 + T. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة للزراعة المختبرية للخلايا التائية الخاصة بمستضد البط ، كما ينشئ بروتوكول تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا للبط ، والذي يمكن استخدامه لتقييم الاستجابات المستجيبة للخلايا التائية. حاليا ، لا توجد تقارير منشورة عن بروتوكولات الثقافة في المختبر لخلايا البط التائية. لقد أشرنا في المقام الأول إلى بروتوكولات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد البشري ولكننا ملتزمون بتحسين ظروف الحضانة ل APCs. نحن نفكر في مزيد من التحسين لبروتوكول التمايز الخاص بنا.

هناك خطوتان حاسمتان في هذا البروتوكول ضروريتان لنجاحه. أولا ، تتطلب الثقافة المختبرية للخلايا التائية للبط تحسينا دقيقا لظروف التحفيز ، بما في ذلك جرعة المستضد ، وتنشيط APC ، ومدة الثقافة ، لضمان التوسع الكافي للخلايا التائية والحفاظ على الوظائف. قد يؤدي أي انحراف في هذه المعلمات إلى تنشيط دون المستوى الأمثل أو موت الخلايا. ثانيا ، يعد اختبار ICS تقنية رئيسية للتقييم الوظيفي لتعبير IFN-γ. يتطلب التحفيز التفاعلي الناجح تحكما دقيقا في وقت التحفيز وخطوات التثبيت / النفاذية وخصوصية الجسم المضاد. كلتا الخطوتين حساستان للغاية ويجب تنفيذهما بعناية لتحقيق اكتشاف موثوق وقابل للتكرار لاستجابات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد.

هنا ، استخدمنا قياس التدفق الخلوي للكشف عن تكاثر الخلايا و qPCR لفحص إنتاج السيتوكينات المميزة. الأهم من ذلك ، لقد نجحنا في التعبير عن خط خلايا الورم الهجين الذي ينتج أجساما مضادة ل IFN-γ مضادة للفأر ، والتي تم استخدامها للكشف عن تعبير IFN-γ ، وبالتالي تقييم مستوى استجابة المستجيب للخلايا التائية. مع بعض التعديلات الطفيفة ، يمكن أيضا تكييف هذا النهج مع فحوصات تكاثر الخلايا في الأنواع الأخرى ، مثل الدجاج.

استخدمنا مجموعة عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMC) لعزل PBMCs للبط لأن المجموعة فعالة وموفرة للوقت. يمكن لطرق الفصل الأخرى ، مثل طريقة فصل Precoll ، أيضاتحقيق هدف عزل PBMCs البط من خلال خطوات مختلفة. ومع ذلك ، بالمقارنة مع المجموعة ، تستغرق هذه الطرق وقتا أطول.

قد تنشأ بعض المشكلات أثناء تنفيذ هذا البروتوكول. أولا ، تكاثر الخلايا التائية عند التحفيز الفيروسي هو في المقام الأول استجابة لخلايا الذاكرة التائية22،23،24. لضمان التكاثر المناسب للخلايا التائية ، نوصي باستخدام البط بعد 4-10 أسابيع من الإصابة. حاليا ، هناك العديد من الطرق المتاحة لعزل PBMCs البط ، وقد تختلف كفاءة عزل PBMCs اعتمادا على وسيط الفصل المستخدم. يوصى باستخدام وسيط فصل معتمد على نطاق واسع واستخراج أكبر عدد ممكن من الخلايا الليمفاوية25.

ثانيا ، اكتشف قياس التدفق الخلوي أن نسبة خلايا CD8 + T و CD4 + T في التكاثر كانت أقل من 15٪ ، وقد يكون ذلك بسبب أن الخلايا التائية المزروعة في هذا البروتوكول تأتي بشكل أساسي من PBMCs ، حيث تكون نسبة خلايا CD8 + T و CD4 + T منخفضة بطبيعتها. قد تؤدي التجارب المستقبلية باستخدام أنسجة الطحال إلى نتائج أكثر أهمية.

ثالثا ، أثناء عملية الاستزراع ، قد لا تتشكل العديد من مجموعات الخلايا التائية ، وقد تموت بعض الخلايا أثناء تمايز الخلايا التائية. هذه الظاهرة أكثر وضوحا في المجموعة الضابطة غير المحفزة. قد تكون هذه المشكلة بسبب حقيقة أنه أثناء زراعة الخلايا التائية ، لا تتلقى المجموعة غير المحفزة إشارات تنشيط وتحفيز مشترك ، مما يؤدي مباشرة إلى موت الخلايا المبرمج.

رابعا ، قمنا ببناء خط خلايا الورم الهجين ونجحنا في التعبير عن كمية كبيرة من الأجسام المضادة IFN-γ المضادة للبط في الفئران. باستخدام هذه الأجسام المضادة ، قمنا بتطوير بروتوكول تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا للكشف عن البط IFN-γ. بعد ذلك ، اختبرنا حساسية الأجسام المضادة باستخدام ELISA وقمنا بتحسين تركيز التلوين لقياس التدفق الخلوي ، وحددنا في النهاية التركيز الأمثل ليكون 1:10 ، مقترنا ب PE-Goat Anti-Mouse IgG3 كجسم مضاد ثانوي عند تخفيف 1: 250. أظهرت النتائج التجريبية أن التعبير عن IFN-γ في المجموعة المحفزة كان 2٪ -3٪. يمكن أن تعزى النسبة المنخفضة نسبيا للخلايا المنتجة ل IFN-γ إلى حقيقة أن الخلايا التائية تم تحفيزها مرة واحدة فقط. قد لا تكون جولة واحدة من تحفيز المستضد كافية لتوسيع عدد الخلايا التائية الخاصة بالمستضد إلى مستوى يمكن اكتشافه. يمكن للجولات المتكررة من تحفيز المستضد إثراء الخلايا التائية الخاصة بالمستضد وتعزيز تنشيطها ، وبالتالي زيادة نسبة الخلايا الإيجابية γ ل IFN. علاوة على ذلك ، بعد تحفيز واحد فقط ، من المحتمل أن تكون مجموعة الخلايا التائية المستجيبة متعددة النسيلة. من خلال التحفيز والاختيار المتكرر ، يمكن الحصول على مجموعة أكثر إثراء من الخلايا التائية مستنيلا ، والتي تميل إلى إظهار مستويات أعلى من إنتاج IFN-γ26،27.

في الختام ، يصف البروتوكول الحالي طريقة للحث على تكاثر الخلايا التائية الخاصة بمستضد البط في المختبر ويؤسس بروتوكول تلطيخ داخل الخلايا للكشف عن البط IFN-γ. يعزز هذا النهج فهمنا للاستجابات المناعية للخلايا التائية للبط ، ويوفر أداة موثوقة لتقييم استجابات الخلايا التائية ، ويساهم في تطوير الأبحاث في علم المناعة الفيروسية للطيور.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32473060 و 32461120064) (إلى MD و ML). مشروع البحوث الأساسية والتطبيقية في قوانغتشو (2025A04J5445) (إلى MD) ؛ العلماء الشباب في برنامج أستاذ علماء نهر اليانغتسي (2024 ، مانمان داي) ؛ والباحث الشاب في نهر بيل من "خطة الدعم الخاصة في قوانغدونغ" (2024 ، مانمان داي). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL MICRO-Centrifuge tubesBiosharpCat#BS-15-M
15 mL Centrifuge tubesLabselectCat#CT-002-15A
2-mercaptoethanol (55 mM)Sigma-AldrichCat#M6250-100ML
48-Well tissue culture plate (No treated, flat bottom)BiofilCat#TCP000048
50 mL Centrifuge tubesLabselectCat#CT-002-50A
96-well Unskirted qPCR PlatesLabselectCat#PP-96-NS-0100
BD Cytofix/Cytoperm kitBD BioscienceCat#BD 554714
Brefeldin A (BFA)BD BioscienceCat#347688
Cell culture CO2 incubatorThermo FisherHeracell 150i GP
CentrifugeEppendorf5810R
CFSE-labeling kitAbcamCat#ab113853
ChamQ SYBR qPCR Master MixVazymeCat#Q341-02
Duck peripheral blood lymphocyte isolation kitTbdscienceCat#LTS1090D
Evo M-MLV RT PremixAccurate BiotechnologyCat#AG11706
FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2VazymeCat#RC112-01
Fetal Bovine SerumGibcoCat#10437-028
Flow cytometerBeckman CoulterBA43347
Flow TubeBeyotimeCat#FFC005
FlowJo v10.8.1Tree Starhttps://www.flowjo.com
Goat Anti-Mouse 488, 1:50 dilutionAbbkineCat#A23210
Goat Anti-Mouse IgG2b, FITC, 1:50 dilutionSouthern BiotechCat#1091-31
Goat Anti-Mouse IgG3, PE, 1:250 dilutionSouthern Biotech Cat#1100-09S
GraphPad prism 8.0.2GraphPad Softwarehttps://www.graphpad-prism.cn
H5N1 AIV strain DK383National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicamen of Zoonosis Prevention and ControlA/Duck/Guangdong/383/2008
L-glutamine (200 mM)GibcoCat#25030081
MicroscopeMoticAE2000
Mouse Anti-Duck CD4, 1:50 dilutionBio-RadCat#MCA2478
Mouse Anti-Duck CD8α, 1:50 dilutionGeneTex Cat#GTX41834
Mouse Anti-Duck IFN-γ mAb, 1:10 dilutionPrepared in our laboratory NA
NanoDrop One SpectrophotometerThermo FisherAZY1603209
NEAA (non-essentialGibcoCat#11140-050
PBSGibcoCat#10010023
PCR Thermal CyclerBiometraBiometra Tone 96G
Penicillin-streptomycin solutionGibcoCat#15070063
Real-Time PCR systemApplied BiosystemsABI7500
recombinant human IL-2 (10 μg)USCNKCat#RPA111Ga01
Red Blood Cell Lysis BufferTbdscienceCat#NH4CL2009
RPMI 1640GibcoCat#11875-119
Sodium pyruvate (100 mM)GibcoCat#11360-070
Trypan BlueSigma-AldrichCat#93595
Two-week-old mallard ducks (Sheldrake)a duck farm in GuangzhouNA

References

  1. Almeida, L., Lochner, M., Berod, L., Sparwasser, T. Metabolic pathways in T cell activation and lineage differentiation. Semin Immunol. 28 (5), 514-524 (2016).
  2. Weidle, U. H., Georges, G., Tiefenthaler, G. TCR-MHC/peptide interaction: prospects for new anti-tumoral agents. Cancer Genom Proteom. 11 (6), 267-277 (2014).
  3. Mazza, C., Malissen, B. What guides MHC-restricted TCR recognition. Semin Immunol. 19 (4), 225-235 (2007).
  4. Nel, A. E. T-cell activation through the antigen receptor. Part 1: signaling components, signaling pathways, and signal integration at the T-cell antigen receptor synapse. J Allergy Clin Immunol. 109 (5), 758-770 (2002).
  5. Dai, M., Xu, C., Chen, W., Liao, M. Progress on chicken T cell immunity to viruses. Cell Mol Life Sci. 76 (14), 2779-2788 (2019).
  6. Deng, G., et al. The role and therapeutic strategies for tissue-resident memory T cells, central memory T cells, and effector memory T cells in psoriasis. Immunology. 173 (3), 470-480 (2024).
  7. Corrado, M., Pearce, E. L. Targeting memory T cell metabolism to improve immunity. J Clin Invest. 132 (1), 148546(2022).
  8. Liu, X., Li, H., Li, S., Yuan, J., Pang, Y. Maintenance and recall of memory T cell populations against tuberculosis: Implications for vaccine design. Front Immunol. 14, 1100741(2023).
  9. Zanker, D., et al. An optimized method for establishing high purity murine CD8+ T cell cultures. J Immunol Methods. 387 (1-2), 173-180 (2013).
  10. Yang, W., Chen, X., Hu, H. CD4(+) T-Cell Differentiation In Vitro. Methods Mol Biol. 2111, 91-99 (2020).
  11. Jiao, W., et al. Revealing novel CD8(+) T-cell epitopes from the H5N1 avian influenza virus in HBW/B1 haplotype ducks. Vet Res. 55 (1), 169(2024).
  12. Faulkner, L., et al. The development of in vitro culture methods to characterize primary T-cell responses to drugs. Toxicol Sci. 127 (1), 150-158 (2012).
  13. Cimen Bozkus, C., Blazquez, A. B., Enokida, T., Bhardwaj, N. A T-cell-based immunogenicity protocol for evaluating human antigen-specific responses. STAR Protoc. 2 (3), 100758(2021).
  14. Masuda, Y., et al. Biological effects of chicken type III interferon on expression of interferon-stimulated genes in chickens: comparison with type I and type II interferons. J Vet Med Sci. 74 (11), 1381-1386 (2012).
  15. Ding, H., Wang, G., Yu, Z., Sun, H., Wang, L. Role of interferon-gamma (IFN-γ) and IFN-γ receptor 1/2 (IFNγR1/2) in regulation of immunity, infection, and cancer development: IFN-γ-dependent or independent pathway. Biomed Pharmacother. 155, 113683(2022).
  16. Gong, Z., Li, Q., Shi, J., Ren, G. An Artifact in Intracellular Cytokine Staining for Studying T Cell Responses and Its Alleviation. Front Immunol. 13, 759188(2022).
  17. Yu, E. D., et al. Ex vivo assays show human gamma-delta T cells specific for common allergens are Th1-polarized in allergic donors. Cell Rep Methods. 2 (12), 100350(2022).
  18. Grant, E. J., et al. Broad CD8(+) T cell cross-recognition of distinct influenza A strains in humans. Nat Commun. 9 (1), 5427(2018).
  19. Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
  20. Dai, M., et al. Duck CD8(+) T Cell Response to H5N1 Highly Pathogenic Avian Influenza Virus Infection In Vivo and In Vitro. J Immunol. 209 (5), 979-990 (2022).
  21. Jabbari, A., Harty, J. T. The generation and modulation of antigen-specific memory CD8 T cell responses. J Leukoc Biol. 80 (1), 16-23 (2006).
  22. Puleo, A., Carroll, C., Maecker, H. T., Gupta, R. Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Vacutainer Cellular Preparation Tubes (CPT(TM)). Bio Protoc. 7 (2), e2103(2017).
  23. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).
  24. Qin, S., Zhang, Y., Tian, Y., Xu, F., Zhang, P. Subcellular metabolomics: Isolation, measurement, and applications. J Pharm Biomed Anal. 210, 114557(2022).
  25. Pertoft, H., Johnsson, A., Wärmegård, B., Seljelid, R. Separation of human monocytes on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 33 (3), 221-229 (1980).
  26. Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses. J Immunol. 191 (1), 52-59 (2013).
  27. Chen, L., et al. A dominant CD4(+) T-cell response to Helicobacter pylori reduces risk for gastric disease in humans. Gastroenterology. 144 (3), 591-600 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

219 IFN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved