In vitro Culture de lymphocytes T de canard spécifiques au H5N1 et détection des réponses immunitaires à l’aide d’une méthode de coloration des cytokines intracellulaires

Le protocole décrit une méthode de culture in vitro de lymphocytes T aviaires en isolant des lymphocytes T mémoires de canards infectés, ce qui permet de générer des lymphocytes T de canard spécifiques hautement purifiés. De plus, une méthode de coloration intracellulaire des cytokines (ICS) a été mise en place pour mesurer avec précision la sécrétion d’IFN-γ dans les lymphocytes T de canard.

La culture in vitro de lymphocytes T est une méthode essentielle pour étudier les réponses immunitaires, les infections virales et les stratégies thérapeutiques potentielles. Cependant, aucun protocole établi pour l’élevage in vitro de lymphocytes T aviaires n’a été signalé à ce jour. Dans cette étude, nous présentons pour la première fois un protocole, en utilisant le virus H5N1 de l’influenza aviaire hautement pathogène (HPAIV) comme modèle. Ici, des canards âgés de 4 semaines ont été infectés par le virus, et des lymphocytes T mémoires ont été isolés 28 jours après l’infection pour cultiver des lymphocytes T de canard spécifiques au virus H5N1, ce qui a permis d’étudier la réponse immunitaire spécifique au virus H5N1. Les étapes clés du protocole comprennent l’isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à mémoire de canards infectés, l’activation des cellules présentatrices d’antigène (APC) avec une multiplicité optimale d’infection (MOI = 5) pendant 6 h, et la préparation de milieux de culture de cellules T complétés par de l’IL-2 recombinante et d’autres additifs spécifiques. La prolifération des lymphocytes T, la sécrétion de cytokines et l’activité cytotoxique ont été étroitement surveillées tout au long du processus. De plus, nous avons établi un protocole de coloration intracellulaire des cytokines pour quantifier la sécrétion d’IFN-γ dans les lymphocytes T de canard. Il s’agissait de générer une lignée cellulaire d’hybridome exprimant des anticorps IgG3κ spécifiques à l’IFN-γ de canard, suivie d’une purification réussie des anticorps. L’anticorps purifié a été dilué à l’échelle 1:10 et appliqué en cytométrie en flux pour mesurer avec précision la sécrétion d’IFN-γ. Cette méthode offre un outil fiable pour évaluer les réponses des lymphocytes T de canard et jette les bases de futures recherches sur l’immunologie virale aviaire.

Le processus d’activation, de prolifération, de différenciation et de conversion des lymphocytes T à mémoire est essentiel aux réponses immunitaires spécifiques de l’antigène¹. Initialement, les lymphocytes T sont activés lorsque leurs récepteurs de lymphocytes T (TCR) reconnaissent les peptides antigéniques présentés à la surface des cellules présentatrices d’antigènes (APC) par les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) ^2,3. Ce processus d’activation nécessite non seulement la liaison du TCR aux molécules du CMH, mais aussi la coordination des signaux de co-stimulation, qui sont cruciaux pour l’activation complète des fonctions des lymphocytes T⁴. Une fois activés, les lymphocytes T entrent rapidement dans la phase de prolifération, générant de nombreux clones qui partagent la même spécificité antigénique que les lymphocytes T d’origine. Au cours de cette phase de prolifération, les lymphocytes T se différencient davantage en fonction de leur fonction, principalement en lymphocytes T CD8⁺ et en lymphocytes T CD4^{+ 5}. Ces cellules différenciées médient la destruction cytotoxique et aident les réponses immunitaires, respectivement. Après l’infection initiale, une partie des lymphocytes T activés se transforme en lymphocytes T mémoire à longue durée de vie⁶. Ces lymphocytes T mémoires peuvent persister dans le système immunitaire pendant de longues périodes, réagissant rapidement au même agent pathogène lors d’une réexposition. En conséquence, ils génèrent une réponse immunitaire plus forte et plus efficace, fournissant une protection immunitaire à long terme à l’hôte⁷. L’ensemble de ce processus est essentiel pour la conception des vaccins à cellules T, car il contribue à améliorer l’efficacité et la durabilité des vaccins⁸.

Dans ce contexte, la culture in vitro de lymphocytes T spécifiques de l’antigène devient essentielle. Ce protocole a été développé sur la base de méthodes établies pour la culture in vitro de cellules T humaines, avec les adaptations nécessaires pour le système immunitaire aviaire⁹. En cultivant ces cellules à l’extérieur du corps, les chercheurs peuvent étudier la réponse des lymphocytes T sous différents états immunitaires, tels que l’activation, la prolifération, la différenciation et la formation de la mémoire¹⁰. Cette approche in vitro est inestimable pour comprendre le rôle que jouent les lymphocytes T dans les réponses immunitaires. De plus, dans des conditions de culture in vitro, la sécrétion de cytokines (telles que l’IFN-γ) par les lymphocytes T peut être surveillée^11,12. Cette surveillance est cruciale pour évaluer la qualité, l’intensité et la persistance des réponses immunitaires, ainsi que pour étudier les interactions entre les lymphocytes T et les autres cellules immunitaires. De plus, l’expansion in vitro des lymphocytes T spécifiques de l’antigène permet un enrichissement à grande échelle, augmente la sensibilité de détection et améliore l’évaluation des niveaux de réponse des lymphocytes T¹³. Ainsi, la culture in vitro de lymphocytes T spécifiques de l’antigène constitue un outil puissant pour mieux comprendre le rôle des lymphocytes T de volaille dans les réponses immunitaires, ce qui augmente la sensibilité de la détection et améliore l’évaluation des niveaux de réponse des lymphocytes T. Bien que des méthodes in vitro similaires aient été bien établies dans les systèmes mammifères, l’application de ces techniques chez les espèces aviaires reste limitée. Ceci est particulièrement pertinent en immunologie de la volaille, où les outils d’analyse des réponses des lymphocytes T sont sous-développés. Les canards, en particulier, servent de réservoirs naturels pour plusieurs virus de la grippe aviaire, mais on sait peu de choses sur leur immunité des lymphocytes T spécifiques à l’antigène. Par conséquent, la mise au point d’un protocole normalisé de culture de cellules T in vitro adapté aux systèmes aviaires est essentielle pour faire progresser la recherche fondamentale et l’immunologie appliquée chez les volailles.

L’une des cytokines clés impliquées dans ces processus est l’IFN-γ, un interféron de type II principalement produit par les lymphocytes T CD8⁺, les lymphocytes T CD4⁺ de type 1 et les lymphocytes NK¹⁴. L’IFN-γ joue un rôle crucial dans l’inhibition de la réplication virale et la régulation des réponses immunitaires¹⁵. Le niveau d’expression de l’IFN-γ reflète l’état immunitaire et sert de marqueur de l’activation des lymphocytes T, ce qui permet aux chercheurs d’évaluer les niveaux de réponse des lymphocytes T grâce à son expression^16,17. Une méthode courante pour détecter l’expression des cytokines dans les cellules immunitaires est la coloration intracellulaire des cytokines (ICS)^18,19. Cependant, en raison des limites des matériaux et des techniques expérimentales, la recherche sur les canards a pris du retard par rapport à celle sur les mammifères⁵. À l’heure actuelle, de nombreux chercheurs s’appuient sur la qPCR pour mesurer les niveaux d’expression de l’IFN-γ, bien que cette méthode présente certaines limites¹¹. Dans notre laboratoire, nous avons réussi à mettre au point un anticorps contre l’IFN-γ de canard qui est compatible avec la cytométrie en flux. Forts de ce succès, dans cette étude, nous avons établi une méthode ICS pour détecter l’expression de la protéine IFN-γ dans les lymphocytes T de canard, fournissant ainsi un outil fiable pour une étude plus approfondie des réponses des lymphocytes T de canard.

Toutes les expériences avec tous les virus de l’influenza aviaire A (H5N1) disponibles ont été réalisées dans un laboratoire de niveau de biosécurité animale 3 et dans une animalerie conformément aux protocoles de l’Université agricole de Chine méridionale (CNAS BL0011). Tous les projets de recherche sur les animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (code d’identification 2021f154, 29 juillet 2021) de l’Université d’agriculture de Chine du Sud. Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux règlements et aux directives établis par ce comité et aux normes internationales en matière de bien-être animal. Les animaux utilisés dans cette étude étaient des canards colverts domestiques (Anas platyrhynchos domestica) âgés de 4 semaines, comprenant des mâles et des femelles, avec des poids corporels allant de 500 à 600 g.

1. Isolement des PBMC de canard et préparation d’une suspension unicellulaire

1. Prélever 2 mL de sang hépariné dans la veine jugulaire de chaque canard et transférer dans des tubes contenant de l’EDTA pour prévenir la coagulation de chaque canard
2. Diluez le sang à l’aide de l’échantillon de diluant fourni à partir du kit d’isolement des lymphocytes ou PBS. Mélangez délicatement par pipetage à l’aide d’une pipette Pasteur. Le rapport de dilution habituel est de 1:1 pour le sang par rapport au diluant.
3. Transférez un volume égal de solution de séparation des lymphocytes dans un tube à centrifuger comme le sang dilué. Superposez soigneusement la suspension sanguine sur la solution de séparation des lymphocytes. Centrifuger le mélange à 400 x g, 25 °C pendant 15 min, en réglant l’accélération de chute à 1.
   REMARQUE : La quantité de solution de séparation des lymphocytes ne doit pas être inférieure à 4 ml. Les composants du kit de solution de séparation des lymphocytes se trouvent dans la table des matériaux.
4. Après la centrifugation, observez les quatre couches distinctes du tube de centrifugation de haut en bas. La couche supérieure est le diluant de l’échantillon, suivie de la couche annulaire de lymphocytes blanc laiteux, puis de la solution de séparation et de la couche inférieure constituée de globules rouges.
5. À l’aide d’une pipette, on recueille la deuxième couche, la couche annulaire de lymphocytes blanc laiteux, et on la transfère dans un nouveau tube à centrifuger. Ajouter 10 ml de solution de nettoyage à mélanger avec les cellules.
6. Centrifuger l’échantillon à 440 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant, puis remettre en suspension la pastille dans 10 mL de milieu RPMI 1640 pour le comptage des cellules.
7. Facultatif) Pour purifier davantage l’échantillon, après une centrifugation à 440 x g pendant 5 min, utilisez un tampon de lyse des globules rouges pour éliminer toutes les cellules sanguines mélangées restantes.

2. Culture in vitro de lymphocytes T spécifiques du virus A5N1

1. Achetez des canards colverts sains (Sheldrake) de 2 semaines dans un élevage de canards et logez-les dans des isolateurs à pression négative. Confirmez que les canards sont négatifs pour l’AIV en utilisant des tests d’inhibition de l’hémagglutination (IH) avant l’expérience. Infecter les canards de 4 semaines avec le virus H5N1 AIV 1 x 10⁶, avec une dose infectieuse de 50 % d’œuf [EID50]/0,2 mL par voie intranasale.
2. Isolez les PBMC mémoire de canards infectés par le virus H5N1 28 jours après l’infection, en suivant la méthode décrite à l’étape 1. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Diluez la suspension cellulaire dans un rapport de 1:1 avec 0,08 % de bleu de trypan et comptez manuellement les cellules viables (non colorées) au microscope optique.
   REMARQUE : Comme le confirme notre étude²⁰ publiée précédemment, les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) isolées 28 jours après l’infection sont considérées comme enrichies en cellules T mémoire. À ce stade, la phase effectrice s’est atténuée et les populations de cellules mémoires sont prédominantes.
3. Réglez la concentration à 3 x 10⁶ cellules/mL, en veillant à ce que 1 mL de milieu soit ajouté à chaque puits de la plaque à 48 puits.
4. Co-infecter les PBMC isolés avec le virus de l’influenza aviaire H5N1 (AIV) pour servir de VAP. La dose virale est MOI = 5. Co-cultivez les PBMC avec le virus pendant 1 h à 37 °C. Agiter doucement à la main toutes les 15 minutes.
5. Après 1 h d’infection, lavez les cellules 2 fois avec du PBS pour éliminer les particules virales non liées. Remettre en suspension les PBMC lavés dans 1 mL de milieu de culture de cellules T et incuber davantage les cellules en suspension à 37 °C pendant 5 h.
6. Centrifuger les cellules à 440 x g pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, réintroduisez les cellules présentatrices d’antigène (CPA) incubées dans 100 μL de milieu de culture de cellules T et ajoutez-les aux cellules effectrices. Le rapport entre les cellules présentatrices d’antigène et les cellules effectrices doit être de 1:5.
7. Incuber les cellules dans une atmosphère à 5 % de CO₂ à 37 °C pendant 14 jours. Tous les 2 jours, remplacez la moitié du surnageant de culture cellulaire par un milieu de cellules T frais en pipetant soigneusement pour assurer une distribution uniforme. Jetez la moitié du milieu contenant les cellules, puis ajoutez un volume égal de nouveau milieu.
8. Le jour 7, observez les cellules au microscope optique à 100x.
9. Utilisez des PBMC à mémoire traitée PBS comme groupe témoin non stimulé.

3. Carboxy fluorescéine Diacétate Succinimidyl Ester (CFSE) pour surveiller la prolifération des lymphocytes T

1. Ajustez la densité des cellules à 0,5-1 x 10⁷ cellules/mL et remettez en suspension les cellules avec 5 mL de PBS après centrifugation à 440 x g pendant 5 min.
2. Diluer 10 mM de stock à 1 μM CFSE avec 5 mL de PBS pré-réfrigéré ; opérer dans l’obscurité.
3. Inclinez les deux tubes de centrifugation à 45°, ajoutez la dilution CFSE à la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette Pasteur, mélangez bien et placez dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 min dans l’obscurité.
4. Laver les cellules en les diluant dans 10 volumes de PBS pré-refroidi contenant 5 % de FBS, sédimenter par centrifugation à 440 x g pendant 5 min, et jeter le surnageant. Répétez le lavage 2 fois.
5. Stimulez les cellules marquées avec CFSE in vitro selon l’étape 2. À la fin de l’essai de prolifération, prélever des cellules et les analyser par cytométrie en flux.

4. Analyse cytométrique en flux pour la prolifération des lymphocytes T CD8⁺ et CD4⁺

1. Après 7 jours de culture, prélevez toutes les cellules de chaque puits et divisez-les dans deux tubes d’écoulement pour analyse.
2. Transférez les cellules dans un nouveau tube à centrifuger, centrifugez à 440 x g pendant 5 min à température ambiante et jetez le surnageant.
3. Ajouter 100 μL de cocktail d’anticorps (CD8 anti-canard de souris ou CD4 anti-canard de souris, 1:50) et incuber les cellules pendant 30 min dans l’obscurité à 4 °C.
4. Transférez les cellules dans un nouveau tube à centrifuger, centrifugez à 440 x g pendant 5 min à température ambiante et jetez le surnageant.
5. Ajouter 100 μL de cocktail d’anticorps (IgG2b de chèvre conjugué au FITC, 1:50) et incuber les cellules pendant 30 min dans l’obscurité à 4 °C.
6. Laver une fois les cellules avec 1 mL de PBS par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Analysez les données à l’aide du logiciel FlowJo. La stratégie de contrôle est illustrée à la figure supplémentaire 1.

5. Réponse des lymphocytes T par des tests d’expression génique de signature à l’aide de la qPCR

1. Compter les cellules à la fin de la culture de cellules T, les prélever dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL et centrifuger à 400 x g pendant 5 min. Jetez soigneusement le surnageant.
2. Extraction de l’ARN
   REMARQUE : L’extraction peut être effectuée dans une hotte ou un banc ultra-propre pour éviter la contamination par l’ARN.
   1. Lyser les cellules à l’aide du tampon de lyse fourni dans la trousse selon les instructions du fabricant. Transférez l’échantillon lysé dans des colonnes de filtre à ADNg (pré-placées dans des tubes de collecte), centrifugez à 13 400 x g pendant 30 s, jetez les colonnes et collectez le filtrat. Ajouter 0,5 volume d’éthanol absolu au filtrat. Mélanger.
      REMARQUE : Une solution trouble ou un précipité après l’ajout d’éthanol est normal. Secouez et passez à l’étape suivante.
   2. Transvaser le mélange dans des colonnes d’ARN, centrifuger à 13 400 x g pendant 30 s. Jeter le filtrat, ajouter 700 μL de tampon RW1 et centrifuger à nouveau.
   3. Jeter le filtrat, ajouter 700 μL de tampon RW2 (avec de l’éthanol absolu) et centrifuger. Jeter le filtrat, ajouter 500 μL de tampon RW2 (avec de l’éthanol absolu) et centrifuger pendant 2 min. Retirez soigneusement la colonne du tube pour éviter la contamination par le filtrat. Assurez-vous que toutes les solutions de rinçage sont éliminées pour éviter toute interférence dans les réactions en aval.
   4. Transférez la colonne dans un nouveau tube de prélèvement sans RNase, ajoutez 50 à 200 μL de ddH₂O sans RNase, laissez-la reposer à température ambiante pendant 1 min, puis centrifugez-la à 13 400 x g pendant 1 min pour éluer l’ARN. Mesurez la pureté et la concentration de l’ARN.
      REMARQUE : Préchauffez le ddH sans RNase₂O à 65 °C pour un rendement accru et effectuez une deuxième élution si nécessaire.
3. Synthétisez l’ADNc en suivant les instructions du kit. Synthétisez le brin d’ADNc selon les instructions du fabricant, en ajoutant 5 fois la quantité de transcriptase inverse. Transcrire inverser à 37 °C pendant 15 min, puis à 85 °C pendant 5 s et refroidir à 4 °C.
4. Configurez la réaction PCR selon le protocole du fabricant.
   1. Dans un tube qPCR, combinez 10 μL de 2 mélanges d’enzymes de réaction PCR, 0,4 μL d’amorce 1, 0,4 μL d’amorce 2, 1 μL de matrice d’ADNc et 8,2 μL de ddH₂O pour former un mélange de 20 μL.
   2. Exécutez la PCR dans l’instrument de PCR quantitative en temps réel avec le programme suivant :
      Etape 1 : 95 °C pendant 30 s, Rep x 1
      Etape 2 : 95 °C pendant 3 s, 60 °C pendant 30 s, Rep x 35
      Etape 3 : 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 60 s, 95 °C pendant 15 s, Rep x 1

6. Coloration intracellulaire des cytokines (ICS)

REMARQUE : Ce protocole a été mis au point pour évaluer la réponse effectrice des lymphocytes T CD8⁺ spécifiques du H5N1 en détectant la sécrétion intracellulaire de γ d’IFN chez les canards.

1. Cultiver des lymphocytes T spécifiques du H5N1 in vitro en suivant la procédure décrite à l’étape 2. Récoltez toutes les cellules (de chaque puits) après 7 jours d’initiation de la culture.
2. Incuber les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) comme indiqué à l’étape 2. Ajouter les APC incubés et Brefeldin A (1:1 000) dans les cellules effectrices et co-incuber pendant 6 h dans un incubateur à 39 °C.
3. Transférez les cellules dans un nouveau tube à centrifuger, centrifugez à 440 x g pendant 5 min à température ambiante et jetez le surnageant.
4. Ajouter 100 μL de cocktail d’anticorps (CD8 anti-canard de souris, 1:50) dans les cellules et incuber pendant 30 min dans l’obscurité à 4 °C.
5. Laver les cellules par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et les remettre en suspension dans 1 mL de PBS. Ajouter un cocktail d’anticorps (IgG2b de chèvre conjugué à la FITC, 1:50) et incuber pendant 30 min dans l’obscurité à 4 °C.
6. Laver à nouveau les cellules en centrifugeant à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 100 μL de tampon de fixation et incubez pendant 20 à 25 min dans l’obscurité à 4 °C.
7. Lavez à nouveau les cellules en les centrifugant à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Ajouter 1 mL de 1x tampon de perméabilisation et laver les cellules 2x par centrifugation à 440 x g pendant 5 min à 4 °C.
8. Jeter le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 100 μL de tampon de perméabilisation et ajouter l’anticorps (IFN-γ anti-canard de souris, 1:10) aux cellules. Après la fixation et la perméabilisation membranaire, incuber le mélange cellule-anticorps pendant 30 min dans l’obscurité, en agitant de temps en temps pendant l’incubation à 4 °C.
   REMARQUE : La solution de perméabilisation/lavage est une solution mère 10x et doit être diluée avec du PBS avant utilisation.
9. Lavez à nouveau les cellules avec 1 mL de PBS en les centrifugant à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Ajouter 100 μL de cocktail d’anticorps (IgG3 de chèvre conjuguée au PE, 1:250) et incuber 30 min dans l’obscurité à 4°C.
10. Analysez les données à l’aide du logiciel FlowJo. La stratégie de contrôle est illustrée à la figure 1.

Ce protocole a été développé sur la base d’une étude antérieure sur la détection des réponses effectrices des lymphocytes T spécifiques à l’antigène chez les canards²⁰. La première étape de l’expérience consiste à cultiver in vitro des lymphocytes T spécifiques du virus, qui servent de base aux études ultérieures sur la réponse effectrice. Initialement, les APC ont été incubés et co-cultivés avec des cellules effectrices. Les observations morphologiques ont révélé qu’après prolifération, les cellules présentaient une croissance en grappes (Figure 2A). L’étiquetage CFSE a également confirmé la prolifération réussie en montrant plusieurs pics de division cellulaire (Figure 2B). Enfin, nous avons utilisé les marqueurs cellulaires CD8/CD4 spécifiques aux canards pour évaluer la proportion et le nombre absolu de cellules²⁰, confirmant ainsi le succès de la culture in vitro de cellules T spécifiques de l’antigène (Figure 2C).

Au 7e jour de la culture, nous avons collecté les cellules et évalué l’expression des gènes liés au système immunitaire. Nous avons constaté que les lymphocytes T proliférants exprimaient principalement des gènes associés à des cytotoxiques tels que Granzyme A et IFN-γ^11,20 (Figure 3), ce qui suggère qu’ils contribuent principalement aux réponses cytotoxiques. Pour étudier plus en détail cette réponse effectrice, nous avons établi un protocole de coloration spécifique aux canards afin de détecter quantitativement la sécrétion d’IFN-γ par les lymphocytes T de canard. La cytométrie en flux a été utilisée pour fixer, perméabiliser et marquer les lymphocytes T CD8 de la population proliférée avec un anticorps anti-IFN-γ. Les résultats ont montré une régulation à la hausse significative de la proportion de cellules IFN-γ⁺ dans les populations CD8^haut+T et CD8^faible+T après stimulation antigénique (Figure 4), indiquant une réponse effectrice robuste dans les lymphocytes T CD8⁺ générés par la prolifération.

Figure 1 : Stratégie de déclenchement des lymphocytes T CD4⁺/CD8⁺. (A) Gating et analyse du pourcentage et du phénotype des lymphocytes T CD4⁺ entre les cellules stimulées et non stimulées par le H5N1 après 14 jours de culture. (B) Gating et analyse du pourcentage et du phénotype de lymphocytes T CD8⁺ entre les cellules stimulées et non stimulées par le H5N1 après 14 jours de culture. Ce chiffre a été modifié au lieu de²⁰. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Culture in vitro de lymphocytes T de canard spécifiques du virus H5N1 AIV. (A) Analyse morphologique des PBMC à mémoire avec ou sans stimulation par l’AIV H5N1. Deux expériences indépendantes ont été menées en utilisant deux donneurs différents de PBMC à mémoire de canard. (B) La prolifération des PBMC à mémoire marqués au CFSE a été évaluée par dilution du CFSE dans des cellules stimulées par le H5N1 de canards infectés par le H5N1 après 2 semaines de culture. L’échantillon rouge représente les PBMC à mémoire marqués CFSE sans stimulation, tandis que les échantillons jaune, vert et noir représentent les PBMC à mémoire marqués CFSE stimulés par H5N1 après 7, 8 et 14 jours de culture, respectivement. (C) Le pourcentage de lymphocytes T CD4⁺ et CD8⁺ a été analysé entre les cellules stimulées par le H5N1 et les cellules non stimulées après 14 jours de culture. La signification statistique a été déterminée à l’aide d’un test t non apparié. (D) Le nombre de lymphocytes T CD4⁺ et CD8⁺ a été comparé entre les cellules stimulées par le H5N1 et les cellules non stimulées après 14 jours de culture. Les données sur les pourcentages et les nombres de lymphocytes T ont été obtenues à partir de deux expériences indépendantes avec deux répétitions chacune. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un test t non apparié ns p > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01. Ce chiffre a été modifié au lieu de²⁰. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Détection de la réponse des lymphocytes T de canard spécifiques au virus H5N1 AIV par qRT-PCR. Les données ont été recueillies à partir de trois répétitions dans le groupe stimulé par le H5N1 et le groupe non stimulé, respectivement. Les résultats ont été présentés sous forme de moyens ± MEB, et le test t apparié a été utilisé pour la comparaison statistique. *p < 0,05, **p < 0,01. Ce chiffre a été modifié au lieu de²⁰. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse par cytométrie en flux de l’expression de l’IFN-γ dans les lymphocytes T CD8⁺ à partir de PBMC de canard stimulés. (A) Stratégie de déclenchement ICS pour le groupe stimulé et le groupe témoin. (B) Analyse statistique de l’expression de l’IFN-γ dans les cellules CD8^low+ et CD8^high+ des PBMC de canard après stimulation. La différence d’expression de l’IFN-γ entre les groupes a été évaluée par le test t, et les comparaisons ont été considérées comme significatives à p≤ 0,05. Ce chiffre a été modifié au lieu de²⁰. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Stratégie de contrôle utilisée pour les lymphocytes T CD4⁺ et CD8⁺ . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Ce protocole fournit une méthode efficace pour la culture in vitro de lymphocytes T spécifiques de l’antigène de canard et établit également un protocole de coloration intracellulaire des cytokines pour les canards, qui peut être utilisé pour évaluer les réponses effectrices des lymphocytes T. À l’heure actuelle, il n’existe aucun rapport publié sur les protocoles de culture in vitro des lymphocytes T de canard. Nous avons principalement référencé des protocoles pour les lymphocytes T spécifiques de l’antigène humain, mais nous nous sommes engagés à optimiser les conditions d’incubation des APC. Nous envisageons d’optimiser davantage notre protocole de différenciation.

Il y a deux étapes critiques dans ce protocole qui sont essentielles à son succès. Tout d’abord, la culture in vitro de lymphocytes T de canard nécessite une optimisation minutieuse des conditions de stimulation, y compris la dose d’antigène, l’activation de l’APC et la durée de la culture, afin d’assurer une expansion suffisante et une préservation fonctionnelle des lymphocytes T. Tout écart dans ces paramètres peut entraîner une activation sous-optimale ou la mort cellulaire. Deuxièmement, le dosage de l’ICS est une technique clé pour évaluer fonctionnellement l’expression de l’IFN-γ. La réussite de l’ICS nécessite un contrôle précis du temps de stimulation, des étapes de fixation/perméabilisation et de la spécificité de l’anticorps. Les deux étapes sont très sensibles et doivent être exécutées avec soin pour obtenir une détection fiable et reproductible des réponses des lymphocytes T spécifiques de l’antigène.

Ici, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour détecter la prolifération cellulaire et la qPCR pour examiner la production de cytokines caractéristiques. Plus important encore, nous avons réussi à exprimer et à purifier une lignée cellulaire d’hybridome produisant des anticorps anti-IFN-γ de canard de souris, qui ont été utilisés pour détecter l’expression de l’IFN-γ, évaluant ainsi le niveau de réponse effectrice des lymphocytes T. Avec quelques modifications mineures, cette approche pourrait également être adaptée aux tests de prolifération cellulaire chez d’autres espèces, comme les poulets.

Nous avons utilisé un kit d’isolement de cellules mononucléées de sang périphérique (PBMC) pour isoler les PBMC de canard, car ce kit est à la fois efficace et permet de gagner du temps. D’autres méthodes de séparation, telles que la méthode de séparation Precoll,^{peuvent également atteindre} l’objectif d’isoler les PBMC de canard par différentes étapes. Cependant, par rapport au kit, ces méthodes prennent plus de temps.

Certains problèmes peuvent survenir lors de l’exécution de ce protocole. Tout d’abord, la prolifération des lymphocytes T lors de la stimulation virale est principalement une réponse des lymphocytes T mémoires 22,23,24. Pour assurer une bonne prolifération des lymphocytes T, nous vous recommandons d’utiliser des canards qui sont 4 à 10 semaines après l’infection. À l’heure actuelle, il existe diverses méthodes pour isoler les PBMC de canard, et l’efficacité de l’isolement des PBMC peut varier en fonction du milieu de séparation utilisé. Il est recommandé d’utiliser un milieu de séparation largement certifié et d’extraire autant de lymphocytes que possible²⁵.

Deuxièmement, la cytométrie en flux a détecté que la proportion de lymphocytes T CD8⁺ et de lymphocytes T CD4⁺ dans la prolifération était inférieure à 15 %, ce qui peut s’expliquer par le fait que les lymphocytes T cultivés dans ce protocole proviennent principalement de PBMC, dans lesquels la proportion de lymphocytes T CD8⁺ et de lymphocytes T CD4⁺ est intrinsèquement faible. De futures expériences utilisant du tissu de rate pourraient donner des résultats plus significatifs.

Troisièmement, au cours du processus de culture, de nombreux amas de lymphocytes T peuvent ne pas se former et certaines cellules peuvent mourir pendant la différenciation des lymphocytes T. Ce phénomène est plus prononcé dans le groupe témoin non stimulé. Ce problème peut être dû au fait que, lorsque les lymphocytes T sont cultivés, le groupe non stimulé ne reçoit pas de signaux d’activation et de co-stimulation, ce qui conduit directement à la mort cellulaire programmée.

Quatrièmement, nous avons construit une lignée cellulaire d’hybridome et avons réussi à exprimer et à purifier une grande quantité d’anticorps anti-IFN-γ de canard de souris. À l’aide de ces anticorps, nous avons développé un protocole de coloration intracellulaire des cytokines pour détecter l’IFN-γ de canard. Ensuite, nous avons testé la sensibilité des anticorps à l’aide d’ELISA et optimisé la concentration de coloration pour la cytométrie en flux, déterminant finalement la concentration optimale à 1:10, associée à PE-Goat Anti-Mouse IgG3 comme anticorps secondaire à une dilution de 1:250. Les résultats expérimentaux ont montré que l’expression de l’IFN-γ dans le groupe stimulé était de 2 % à 3 %. La proportion relativement faible de cellules productrices d’IFN-γ peut être attribuée au fait que les lymphocytes T n’ont été stimulés qu’une seule fois. Une seule série de stimulation de l’antigène peut ne pas suffire à élargir la population de lymphocytes T spécifiques de l’antigène à un niveau détectable. Des cycles répétés de stimulation de l’antigène peuvent enrichir les lymphocytes T spécifiques de l’antigène et améliorer leur activation, augmentant ainsi la proportion de cellules positives à l’IFN-γ. De plus, après une seule stimulation, la population de lymphocytes T répondeurs est probablement encore polyclonale. Grâce à une stimulation et une sélection répétées, il est possible d’obtenir une population de lymphocytes T plus enrichie par clonage, qui tend à présenter des niveaux plus élevés de production de γ d’IFN-26,27.

En conclusion, le protocole actuel décrit une méthode pour induire la prolifération de cellules T spécifiques de l’antigène de canard in vitro et établit un protocole de coloration intracellulaire pour détecter l’IFN-γ de canard. Cette approche améliore notre compréhension des réponses immunitaires des lymphocytes T des canards, offre un outil fiable pour évaluer les réponses des lymphocytes T et contribue à faire progresser la recherche en immunologie virale aviaire.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32473060 et 32461120064) (à MD et ML) ; Projet de recherche fondamentale et appliquée de Guangzhou (2025A04J5445) (à MD) ; le programme de professeurs Young Scholars of the Yangtze River Scholar (2024, Manman Dai) ; et le jeune boursier de la rivière Peal du « Plan spécial de soutien du Guangdong » (2024, Manman Dai). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.