In Vitro H5N1'e Özgü Ördek T Hücreleri için Kültür ve İntrahücre İçi Sitokin Boyama Yöntemi ile İmmün Yanıtların Saptanması

Protokol, enfekte ördeklerden bellek T hücrelerini izole ederek kuş T hücrelerinin in vitro olarak kültürlenmesi için bir yöntemi açıklar ve yüksek oranda saflaştırılmış spesifik ördek T hücrelerinin üretilmesine izin verir. Ek olarak, ördek T hücrelerinde IFN-γ sekresyonunu doğru bir şekilde ölçmek için hücre içi sitokin boyama (ICS) yöntemi oluşturulmuştur.

T hücrelerinin in vitro kültürü, immün yanıtları, viral enfeksiyonları ve potansiyel terapötik stratejileri incelemek için kritik bir yöntemdir. Bununla birlikte, kuş T hücrelerinin in vitro olarak kültürlenmesi için bugüne kadar belirlenmiş bir protokol bildirilmemiştir. Bu çalışmada, yüksek patojenik kuş gribi (HPAIV) H5N1 virüsünü model olarak kullanan bir protokolü ilk kez sunuyoruz. Burada, 4 haftalık ördekler virüsle enfekte edildi ve hafıza T lenfositleri, enfeksiyondan 28 gün sonra H5N1'e özgü ördek T lenfositlerini kültürlemek için izole edildi ve H5N1 virüsüne karşı spesifik bağışıklık tepkisinin araştırılmasını sağladı. Protokoldeki temel adımlar, enfekte ördeklerden bellek periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) izole edilmesini, antijen sunan hücrelerin (APC'ler) 6 saat boyunca optimal bir enfeksiyon çokluğu (MOI = 5) ile aktive edilmesini ve rekombinant IL-2 ve diğer spesifik katkı maddeleri ile desteklenmiş T hücre kültürü ortamının hazırlanmasını içerir. T hücresi proliferasyonu, sitokin sekresyonu ve sitotoksik aktivite süreç boyunca yakından izlendi. Ek olarak, ördek T hücrelerinde IFN-γ sekresyonunu ölçmek için hücre içi bir sitokin boyama protokolü oluşturduk. Bu, ördek IFN-γ'ye özgü IgG3κ antikorlarını eksprese eden bir hibridoma hücre hattının oluşturulmasını ve ardından başarılı antikor saflaştırılmasını içeriyordu. Saflaştırılmış antikor 1:10 oranında seyreltildi ve IFN-γ sekresyonunu hassas bir şekilde ölçmek için akış sitometrisinde uygulandı. Bu yöntem, ördek T hücresi yanıtlarını değerlendirmek için güvenilir bir araç sunar ve kuş viral immünolojisine yönelik gelecekteki araştırmalar için temel oluşturur.

T hücresi aktivasyonu, proliferasyonu, farklılaşması ve bellek T hücrelerine dönüştürülmesi süreci, antijene özgü bağışıklık tepkilerinin merkezinde yer alır¹. Başlangıçta, T hücreleri, T hücresi reseptörleri (TCR), antijen sunan hücrelerin (APC'ler) yüzeyinde majör histouyumluluk kompleksi (MHC) molekülleri tarafından sunulan antijenik peptitleri tanıdığında aktive edilir ^2,3. Bu aktivasyon işlemi sadece TCR'nin MHC moleküllerine bağlanmasını değil, aynı zamanda T hücresi fonksiyonlarını tam olarak aktive etmek için çok önemli olan yardımcı uyarıcı sinyallerin koordinasyonunu da gerektirir⁴. Aktive edildikten sonra, T hücreleri hızla proliferasyon fazına girer ve orijinal T hücresi ile aynı antijen özgüllüğünü paylaşan çok sayıda klon üretir. Bu proliferasyon fazı sırasında, T hücreleri, işlevlerine bağlı olarak, öncelikle CD8 ⁺ T hücrelerine ve CD4 ⁺ T hücrelerine⁵ farklılaşır. Bu farklılaşmış hücreler sırasıyla sitotoksik öldürmeye aracılık eder ve bağışıklık tepkilerine yardımcı olur. İlk enfeksiyonu takiben, aktive edilmiş T hücrelerinin bir kısmı uzun ömürlü hafıza T hücrelerine dönüşür⁶. Bu bellek T hücreleri, bağışıklık sisteminde uzun süre kalabilir ve yeniden maruz kalma üzerine aynı patojene hızla yanıt verebilir. Sonuç olarak, konakçı için uzun süreli bağışıklık koruması sağlayarak daha güçlü ve daha verimli bir bağışıklık tepkisi oluştururlar⁷. Tüm bu süreç, aşı etkinliğini ve dayanıklılığını artırmaya yardımcı olduğu için T hücresi aşılarının tasarımı için kritik öneme sahiptir⁸.

Bu bağlamda, antijene özgü T hücrelerinin in vitro olarak yetiştirilmesi zorunlu hale gelir. Bu protokol, kuş bağışıklık sistemi için gerekli adaptasyonlarla birlikte insan T hücrelerinin in vitro kültürü için yerleşik yöntemlere dayalı olarak geliştirilmiştir⁹. Araştırmacılar, bu hücreleri vücudun dışında büyüterek, aktivasyon, proliferasyon, farklılaşma ve hafıza oluşumu gibi farklı bağışıklık durumları altında T hücresi tepkisini inceleyebilirler¹⁰. Bu in vitro yaklaşım, T hücrelerinin bağışıklık tepkilerinde oynadığı rolleri anlamak için paha biçilmezdir. Ayrıca, in vitro kültür koşulları altında, sitokinlerin (IFN-γ gibi) T hücreleri tarafından salgılanması izlenebilir^11,12. Bu izleme, bağışıklık tepkilerinin kalitesini, yoğunluğunu ve kalıcılığını değerlendirmenin yanı sıra T hücreleri ile diğer bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için çok önemlidir. Ek olarak, antijene özgü T hücrelerinin in vitro genişlemesi, büyük ölçekli zenginleştirmeyi mümkün kılar, algılama hassasiyetini artırır ve T hücresi yanıt seviyelerinin^{değerlendirmesini geliştirir 13}. Bu nedenle, antijene özgü T hücrelerinin in vitro kültürü, kanatlı T hücrelerinin immün tepkilerdeki rolünü daha iyi anlamak için güçlü bir araç olarak hizmet eder, bu da tespit hassasiyetini arttırır ve T hücresi yanıt seviyelerinin değerlendirmesini geliştirir. Benzer in vitro yöntemler memeli sistemlerinde iyi kurulmuş olsa da, bu tür tekniklerin kuş türlerinde uygulanması sınırlı kalmaktadır. Bu, özellikle T hücresi tepkilerini analiz etmek için araçların az gelişmiş olduğu kümes hayvanı immünolojisi ile ilgilidir. Özellikle ördekler, çeşitli kuş gribi virüsleri için doğal rezervuar görevi görür, ancak antijene özgü T hücresi bağışıklıkları hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu nedenle, kanatlılarda hem temel araştırmaları hem de uygulamalı immünolojiyi ilerletmek için kuş sistemlerine uyarlanmış standartlaştırılmış bir in vitro T hücre kültürü protokolü geliştirmek esastır.

Bu işlemlerde yer alan önemli bir sitokin, esas olarak CD8 ⁺ T hücreleri, tip 1 CD4 ⁺ T hücreleri ve NK hücreleri¹⁴ tarafından üretilen bir tip II interferon olan IFN-γ'dir. IFN-γ, viral replikasyonu inhibe etmede ve bağışıklık tepkilerini düzenlemede çok önemli bir rol oynar¹⁵. IFN-γ'nin ekspresyon seviyesi, bağışıklık durumunu yansıtır ve T hücresi aktivasyonu için bir belirteç görevi görür ve araştırmacıların^16,17 ifadesi aracılığıyla T hücresi yanıt seviyelerini değerlendirmelerini sağlar. Bağışıklık hücrelerinde sitokin ekspresyonunu tespit etmek için yaygın bir yöntem, hücre içi sitokin boyamadır (ICS)^18,19. Bununla birlikte, deneysel materyal ve tekniklerdeki sınırlamalar nedeniyle, ördekler üzerinde yapılan araştırmalar memelilerinkinin gerisinde kalmıştır⁵. Şu anda, birçok araştırmacı IFN-γ ekspresyon seviyelerini ölçmek için qPCR'ye güvenmektedir, ancak bu yöntemin belirli sınırlamaları vardır¹¹. Laboratuvarımızda, ördek IFN-γ için akış sitometrisi ile uyumlu bir antikoru başarıyla geliştirdik. Bu başarıya dayanarak, bu çalışmada, ördek T hücrelerinde IFN-γ protein ekspresyonunu tespit etmek için bir ICS yöntemi oluşturduk ve ördek T hücresi tepkileri üzerinde daha fazla çalışma için güvenilir bir araç sağladık.

Mevcut tüm kuş gribi A (H5N1) virüsleri ile yapılan tüm deneyler, Güney Çin Tarım Üniversitesi (CNAS BL0011) protokollerine göre bir hayvan biyogüvenlik seviye 3 laboratuvarında ve hayvan tesisinde gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan araştırma projeleri, Güney Çin Tarım Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (kimlik kodu 2021f154, 29 Temmuz 2021) tarafından onaylanmıştır. Tüm hayvan prosedürleri, bu komite tarafından belirlenen düzenlemelere ve yönergelere ve hayvan refahı için uluslararası standartlara göre gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan hayvanlar, vücut ağırlıkları 500 ila 600 g arasında değişen, hem erkek hem de dişi olmak üzere 4 haftalık evcil yeşilbaş ördeklerdi (Anas platyrhynchos domestica).

1. Ördek PBMC'lerin izolasyonu ve tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması

1. Her ördeğin şah damarından 2 mL heparinize kan toplayın ve her bir ördeğin pıhtılaşmasını önlemek için EDTA içeren tüplere aktarın
2. Lenfosit izolasyon kitinden veya PBS'den sağlanan örnek seyrelticiyi kullanarak kanı seyreltin. Bir Pasteur pipeti ile pipetleyerek nazikçe karıştırın. Kanın seyreltici için normal seyreltme oranı 1:1'dir.
3. Seyreltilmiş kan olarak eşit hacimde lenfosit ayırma solüsyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın. Kan süspansiyonunu lenfosit ayırma çözeltisinin üzerine dikkatlice yerleştirin. Karışımı 400 x g, 25 °C'de 15 dakika santrifüjleyin ve düşen ivmeyi 1'e ayarlayın.
   NOT: Lenfosit ayırma çözeltisinin miktarı 4 mL'den az olmamalıdır. Lenfosit ayırma solüsyon kitinin bileşenleri Malzeme Tablosunda bulunabilir.
4. Santrifüjlemeden sonra, santrifüj tüpündeki dört farklı katmanı yukarıdan aşağıya doğru gözlemleyin. Üst tabaka numune seyrelticidir, ardından halka şeklindeki süt beyazı lenfosit tabakası, daha sonra ayırma çözeltisi ve alt tabaka kırmızı kan hücrelerinden oluşur.
5. İkinci katmanı, halka şeklindeki süt beyazı lenfosit katmanını toplamak için dikkatlice bir pipet kullanın ve yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücrelerle karıştırmak için 10 mL temizleme solüsyonu ekleyin.
6. Numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, ardından hücre sayımı için hücre peletini 10 mL RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin.
7. İsteğe bağlı) Numuneyi daha da saflaştırmak için, 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjledikten sonra, kalan karışık kan hücrelerini çıkarmak için kırmızı kan hücresi lizis tamponu kullanın.

2. İn vitro H5N1 AIV'ye özgü T hücre kültürü

1. Bir ördek çiftliğinden 2 haftalık sağlıklı yeşilbaş ördekler (Sheldrake) satın alın ve onları negatif basınçlı izolatörlerde barındırın. Deneyden önce hemaglutinasyon inhibisyonu (HI) deneylerini kullanarak ördeklerin AIV için negatif olduğunu onaylayın. 4 haftalık ördekleri H5N1 AIV 1 x 10⁶ ile,% 50 yumurta enfeksiyöz dozu [EID50] / 0.2 mL intranazal olarak enfekte edin.
2. Bellek PBMC'lerini enfeksiyondan 28 gün sonra H5N1 ile enfekte olmuş ördeklerden 1. adımda açıklanan yöntemi izleyerek izole edin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücre süspansiyonunu 1: 1 oranında% 0.08 tripan mavisi ile seyreltin ve canlı (boyanmamış) hücreleri bir ışık mikroskobu altında manuel olarak sayın.
   NOT: Daha önce yayınlanmış çalışmamız²⁰ tarafından desteklendiği gibi, enfeksiyondan 28 gün sonra izole edilen periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) hafıza T hücreleri açısından zenginleştirilmiş olduğu düşünülmektedir. Bu aşamada, efektör faz azalmıştır ve hafıza hücresi popülasyonları baskındır.
3. Konsantrasyonu 3 x 10⁶ hücre / mL'ye ayarlayın ve 48 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1 mL ortam eklendiğinden emin olun.
4. İzole edilmiş PBMC'leri APC olarak hizmet etmek için H5N1 kuş gribi virüsü (AIV) ile birlikte enfekte edin. Viral doz MOI = 5'tir. PBMC'leri 37 ° C'de 1 saat boyunca virüsle birlikte kültürleyin. Her 15 dakikada bir elinizle hafifçe sallayın.
5. Enfeksiyondan 1 saat sonra, bağlanmamış viral partikülleri çıkarmak için hücreleri 2x PBS ile yıkayın. Yıkanmış PBMC'leri 1 mL T hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve ayrıca askıdaki hücreleri 37 ° C'de 5 saat inkübe edin.
6. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjleyin. Daha sonra, inkübe edilmiş antijen sunan hücreleri (APC'ler) 100 μL T hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve bunları efektör hücrelere ekleyin. Antijen sunan hücrelerin efektör hücrelere oranı 1:5 olmalıdır.
7. Hücreleri 14 gün boyunca 37 ° C'de% 5 CO₂ atmosferinde inkübe edin. Her 2 günde bir, eşit dağılımı sağlamak için dikkatlice pipetleyerek hücre kültürü süpernatantının yarısını taze T hücresi ortamıyla değiştirin. Hücreleri içeren ortamın yarısını atın, ardından eşit hacimde yeni ortam ekleyin.
8. 7. günde, hücreleri 100x'te optik mikroskop altında gözlemleyin.
9. Uyarılmamış kontrol grubu olarak PBS ile muamele edilmiş bellek PBMC'lerini kullanın.

3. T hücresi proliferasyonunu izlemek için karboksi floresein Diasetat Süksinimidil Ester (CFSE)

1. Hücre yoğunluğunu 0.5-1 x 10⁷ hücre / mL'ye ayarlayın ve 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjlemeden sonra hücreleri 5 mL PBS ile yeniden süspanse edin.
2. 5 mL önceden soğutulmuş PBS ile 10 mM stoğu 1 μM CFSE'ye seyreltin; karanlıkta çalışın.
3. İki santrifüj tüpünü 45 ° 'de eğin, CFSE seyreltmesini bir Pasteur pipeti ile hücre süspansiyonuna ekleyin, iyice karıştırın ve karanlıkta 15 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun.
4. Hücreleri,% 5 FBS içeren 10 hacim önceden soğutulmuş PBS içinde seyrelterek, 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjleme ile çökelterek yıkayın ve süpernatanı atın. Yıkamayı 2 kez tekrarlayın.
5. Adım 2'ye göre in vitro olarak CFSE ile etiketlenmiş hücreleri uyarın. Proliferasyon testinin tamamlanmasının ardından, hücreleri hasat edin ve akış sitometrisi ile analiz edin.

4. CD8 + T ve ^{CD4 +} T hücrelerinin proliferasyonu için akış sitometrik analizi

1. 7 günlük kültürden sonra, her bir oyuktan tüm hücreleri toplayın ve analiz için iki akış tüpüne bölün.
2. Hücreleri yeni bir santrifüj tüpüne aktarın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
3. 100 μL antikor kokteyli (fare anti-ördek CD8, 1:50 veya fare anti-ördek CD4, 1:50) ekleyin ve hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
4. Hücreleri yeni bir santrifüj tüpüne aktarın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
5. 100 μL antikor kokteyli (FITC konjuge Keçi Anti-Fare IgG2b, 1:50) ekleyin ve hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
6. Hücreleri 1 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyerek 4 mL PBS ile bir kez yıkayın. FlowJo yazılımını kullanarak verileri analiz edin. Geçit stratejisi Ek Şekil 1'de gösterilmiştir.

5. qPCR kullanılarak imza gen ekspresyonu testleri ile T hücresi yanıtı

1. T hücresi kültürünün sonunda hücreleri sayın, 1.5 mL santrifüj tüplerinde toplayın ve 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın.
2. RNA ekstraksiyonu
   NOT: Ekstraksiyon, RNA kontaminasyonunu önlemek için çeker ocakta veya ultra temiz tezgahta gerçekleştirilebilir.
   1. Üreticinin talimatlarına göre kitte verilen lizis tamponunu kullanarak hücreleri parçalayın. Parçalanmış numuneyi gDNA-Filtre Kolonlarına (toplama tüplerine önceden yerleştirilmiş) aktarın, 30 saniye boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin, kolonları atın ve süzüntüyü toplayın. Süzüntüye 0.5 hacim mutlak etanol ekleyin. İyice karıştırın.
      NOT: Etanol ilavesinden sonra bulanık bir çözelti veya çökelti normaldir. Sallayın ve bir sonraki adıma geçin.
   2. Karışımı RNA kolonlarına aktarın, 30 saniye boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin. Süzüntüyü atın, 700 μL Tampon RW1 ekleyin ve tekrar santrifüjleyin.
   3. Süzüntüyü atın, 700 μL Tampon RW2 (mutlak etanol ile) ekleyin ve santrifüjleyin. Süzüntüyü atın, 500 μL Tampon RW2 (mutlak etanol ile) ekleyin ve 2 dakika santrifüjleyin. Filtrattan kontaminasyonu önlemek için sütunu tüpten dikkatlice çıkarın. Aşağı akış reaksiyonlarında paraziti önlemek için tüm durulama çözeltilerinin çıkarıldığından emin olun.
   4. Sütunu yeni bir RNaz içermeyen toplama tüpüne aktarın, 50-200 μL RNaz içermeyen ddH₂O ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika bekletin, ardından RNA'yı elüte etmek için 1 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin. RNA saflığını ve konsantrasyonunu ölçün.
      NOT: Daha fazla verim için RNaz içermeyen ddH₂O'yu 65 °C'ye önceden ısıtın ve gerekirse ikinci bir elüsyon gerçekleştirin.
3. Kit talimatlarını izleyerek cDNA'yı sentezleyin. cDNA zincirini üreticinin talimatlarına göre sentezleyin ve 5 kat daha fazla ters transkriptaz ekleyin. 37 °C'de 15 dakika, ardından 85 °C'de 5 saniye ters yazıya dökün ve 4 °C'ye soğutun.
4. PCR reaksiyonunu üreticinin protokolüne göre ayarlayın.
   1. Bir qPCR tüpünde, 20 μL'lik bir karışım yapmak için 10 μL 2x PCR reaksiyon enzim karışımı, 0.4 μL primer 1, 0.4 μL primer 2, 1 μL cDNA şablonu ve 8.2 μL ddH₂O'yu birleştirin.
   2. Aşağıdaki programla PCR'yi gerçek zamanlı kantitatif PCR cihazında çalıştırın:
      Aşama 1: 30 sn boyunca 95 °C, Tekrar x 1
      Aşama 2: 3 sn için 95 °C, 30 sn için 60 °C, Rep x 35
      Aşama 3: 15 sn için 95 °C, 60 sn için 60 °C, 15 sn için 95 °C, Rep x 1

6. Hücre İçi Sitokin Boyama (ICS)

NOT: Bu protokol, ördeklerde hücre içi IFN-γ sekresyonunu tespit ederek H5N1'e özgü CD8⁺ T hücrelerinin efektör yanıtını değerlendirmek için geliştirilmiştir.

1. H5N1'e özgü T hücrelerini in vitro olarak adım 2'de açıklanan prosedürü takiben kültürleyin. Kültürün başlamasından 7 gün sonra tüm hücreleri (her kuyudan) hasat edin.
2. Antijen sunan hücreleri (APC'ler) adım 2'de belirtildiği gibi inkübe edin. İnkübe edilmiş APC'leri ve Brefeldin A'yı (1: 1.000) efektör hücrelere ekleyin ve 39 ° C'lik bir inkübatörde 6 saat birlikte inkübe edin.
3. Hücreleri yeni bir santrifüj tüpüne aktarın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 440 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
4. Hücrelere 100 μL antikor kokteyli (fare anti-ördek CD8, 1:50) ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
5. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyerek yıkayın ve 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Bir antikor kokteyli (FITC konjuge Keçi Anti-Fare IgG2b, 1:50) ekleyin ve karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
6. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyerek tekrar yıkayın. Süpernatanı atın, hücreleri 100 μL fiksasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve karanlıkta 4 ° C'de 20-25 dakika inkübe edin.
7. Hücreleri 400 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüj ederek bir kez daha yıkayın. 1 mL 1x geçirgenleştirme tamponu ekleyin ve hücreleri 2x 440 x g'da santrifüjleme ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca yıkayın.
8. Süpernatanı atın, hücreleri 100 μL geçirgenlik tamponunda yeniden süspanse edin ve antikoru (Fare Anti-Ördek IFN-γ, 1:10) hücrelere ekleyin. Fiksasyon ve membran geçirgenliğinden sonra, hücre-antikor karışımını karanlıkta 30 dakika inkübe edin, inkübasyon sırasında ara sıra 4 ° C'de çalkalayın.
   NOT: Geçirgenleştirme/Yıkama solüsyonu 10x stok solüsyonudur ve kullanılmadan önce PBS ile seyreltilmelidir.
9. Hücreleri bir kez daha 1 mL PBS ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyerek yıkayın. 100 μL antikor kokteyli (PE konjuge Keçi Anti-Fare IgG3, 1:250) ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
10. FlowJo yazılımını kullanarak verileri analiz edin. Geçit stratejisi Şekil 1'de gösterilmiştir.

Bu protokol, ördeklerde antijene özgü T hücresi efektör yanıtlarının tespiti üzerine daha önceki bir çalışmaya dayanarak geliştirilmiştir²⁰. Deneyin ilk adımı, sonraki efektör yanıt çalışmaları için temel teşkil eden virüse özgü T hücrelerinin in vitro kültürünü içerir. Başlangıçta, APC'ler inkübe edildi ve efektör hücrelerle birlikte kültürlendi. Morfolojik gözlemler, proliferasyondan sonra hücrelerin küme büyümesi sergilediğini ortaya koymuştur (Şekil 2A). CFSE etiketlemesi, hücre bölünmesinin çoklu zirvelerini göstererek başarılı proliferasyonu daha da doğruladı (Şekil 2B). Son olarak,²⁰ hücresinin oranını ve mutlak sayısını değerlendirmek için ördeğe özgü hücre belirteçleri CD8/CD4 kullandık ve bu da antijene özgü T hücrelerinin başarılı in vitro kültürünü doğruladı (Şekil 2C).

Kültürün 7. gününde, hücreleri topladık ve bağışıklıkla ilgili genlerin ekspresyonunu değerlendirdik. Proliferatif T hücrelerinin ağırlıklı olarak Granzyme A ve IFN-γ^11,20 gibi sitotoksikle ilişkili genleri eksprese ettiğini bulduk (Şekil 3), bu da bunların öncelikle sitotoksik yanıtlara katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. Bu efektör tepkisini daha fazla araştırmak için, ördek T hücreleri tarafından IFN-γ sekresyonunu kantitatif olarak tespit etmek için ördeğe özgü bir boyama protokolü oluşturduk. Akış sitometrisi, prolifere edilmiş popülasyondan CD8 T hücrelerini bir anti-IFN-γ antikoru ile sabitlemek, geçirgenleştirmek ve etiketlemek için kullanıldı. Sonuçlar, antijen stimülasyonunu takiben hem CD8^{yüksek +} T hem de CD8^{düşük +} T popülasyonlarında IFN-γ ⁺ hücrelerinin oranında önemli bir yukarı regülasyon gösterdi (Şekil 4), bu da proliferasyon tarafından üretilen CD8 ⁺ T hücrelerinde sağlam bir efektör tepkisini gösterir.

Şekil 1: CD4⁺/CD8+T hücresinin geçit stratejisi. (A) 14 günlük kültürlemeden sonra H5N1 ile uyarılan ve uyarılmayan hücreler arasındaki CD4⁺ T hücrelerinin yüzdesi ve fenotipinin geçitlenmesi ve analizi. (B) 14 günlük kültürlemeden sonra H5N1 uyarılmış ve uyarılmamış hücreler arasındaki CD8 ⁺ T hücrelerinin yüzdesi ve fenotipinin geçitlenmesi ve analizi. Bu rakam^20'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: H5N1 AIV'ye özgü ördek T hücrelerinin in vitro kültürü. (A) H5N1 AIV ile stimülasyonu olan veya olmayan bellek PBMC'lerinin morfolojik analizi. İki farklı ördek hafızası PBMC donörü kullanılarak iki bağımsız deney yapıldı. (B) CFSE etiketli bellek PBMC'lerinin proliferasyonu, 2 haftalık kültürden sonra H5N1 ile enfekte ördeklerden H5N1 ile uyarılan hücrelerde CFSE seyreltmesi ile değerlendirildi. Kırmızı numune, stimülasyon olmadan CFSE etiketli bellek PBMC'lerini temsil ederken, sarı, yeşil ve siyah numuneler, sırasıyla 7, 8 ve 14 günlük kültürden sonra H5N1 ile uyarılan CFSE etiketli bellek PBMC'lerini temsil eder. (C) CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ T hücrelerinin yüzdesi, 14 günlük kültürden sonra H5N1 ile uyarılan ve uyarılmayan hücreler arasında analiz edildi. İstatistiksel anlamlılık, eşleşmemiş bir t-testi kullanılarak belirlendi. (D) CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ T hücrelerinin sayısı, 14 günlük kültürden sonra H5N1 ile uyarılan ve uyarılmayan hücreler arasında karşılaştırıldı. T hücresi yüzdeleri ve sayıları ile ilgili veriler, her biri iki kopya içeren iki bağımsız deneyden elde edildi. İstatistiksel analiz, eşleşmemiş t-testi ns p > 0.05, *p < 0.05, **p < 0.01 kullanılarak yapıldı. Bu rakam^20'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: qRT-PCR ile H5N1 AIV'ye özgü ördek T hücresi yanıtının tespiti. Veriler, sırasıyla H5N1 uyarılmış ve uyarılmamış gruptaki üç tekrardan toplandı. Sonuçlar SEM ± ortalama olarak sunuldu ve istatistiksel karşılaştırma için eşleştirilmiş t-testi kullanıldı. *p < 0.05, **p < 0.01. Bu rakam^20'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Uyarılan ördek PBMC'lerden alınan CD8⁺ T hücrelerinde IFN-γ ekspresyonunun akış sitometrisi analizi. (A) Uyarılmış grup ve kontrol grubu için ICS geçit stratejisi. (B) Stimülasyondan sonra ördek PBMC'lerinden CD8^düşük+ ve CD8^yüksek+ hücrelerde IFN-γ ekspresyonunun istatistiksel analizi. Gruplar arasında IFN-γ ekspresyonu farkı t-testi ile değerlendirildi ve karşılaştırmalar p≤ 0.05 olarak anlamlı kabul edildi. Bu rakam^20'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: CD4⁺ ve CD8⁺ T hücreleri için kullanılan geçit stratejisi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu protokol, ördek antijenine özgü T hücrelerinin in vitro kültürü için etkili bir yöntem sağlar ve ayrıca ördekler için T hücrelerinin efektör yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilecek bir hücre içi sitokin boyama protokolü oluşturur. Şu anda, ördek T hücreleri için in vitro kültür protokolleri hakkında yayınlanmış bir rapor bulunmamaktadır. Öncelikle insan antijenine özgü T hücreleri için protokollere atıfta bulunduk, ancak APC'ler için inkübasyon koşullarını optimize etmeye kararlıyız. Farklılaştırma protokolümüzü daha da optimize etmeyi düşünüyoruz.

Bu protokolün başarısı için gerekli olan iki kritik adım vardır. İlk olarak, ördek T hücrelerinin in vitro kültürü, yeterli T hücresi genişlemesini ve fonksiyonel korumayı sağlamak için antijen dozu, APC aktivasyonu ve kültür süresi dahil olmak üzere stimülasyon koşullarının dikkatli bir şekilde optimize edilmesini gerektirir. Bu parametrelerdeki herhangi bir sapma, suboptimal aktivasyona veya hücre ölümüne yol açabilir. İkincisi, ICS testi, IFN-γ ekspresyonunu işlevsel olarak değerlendirmek için anahtar bir tekniktir. Başarılı ICS, stimülasyon süresinin, fiksasyon/geçirgenlik adımlarının ve antikor özgüllüğünün hassas kontrolünü gerektirir. Her iki adım da oldukça hassastır ve antijene özgü T hücresi yanıtlarının güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde tespit edilmesini sağlamak için dikkatli bir şekilde uygulanmalıdır.

Burada, hücre proliferasyonunu tespit etmek için akış sitometrisi ve ayırt edici sitokinlerin üretimini incelemek için qPCR kullandık. En önemlisi, IFN-γ ekspresyonunu tespit etmek için kullanılan fare anti-ördek IFN-γ antikorları üreten bir hibridoma hücre hattını başarılı bir şekilde eksprese ettik ve saflaştırdık, böylece T hücrelerinin efektör yanıt seviyesini değerlendirdik. Birkaç küçük değişiklikle, bu yaklaşım, tavuklar gibi diğer türlerde hücre proliferasyon testleri için de uyarlanabilir.

Ördek PBMC'lerini izole etmek için bir periferik kan mononükleer hücre (PBMC) izolasyon kiti kullandık çünkü kit hem etkili hem de zaman kazandırıyor. Precoll ayırma yöntemi gibi diğer ayırma yöntemleri de²¹ ördek PBMC'lerini farklı adımlarla izole etme hedefine ulaşabilir. Ancak kit ile karşılaştırıldığında bu yöntemler daha fazla zaman alır.

Bu protokolün yürütülmesi sırasında bazı sorunlar ortaya çıkabilir. İlk olarak, viral stimülasyon üzerine T hücresi proliferasyonu, öncelikle hafıza T hücrelerinin bir yanıtıdır 22,23,24. Uygun T hücresi proliferasyonunu sağlamak için, enfeksiyondan 4-10 hafta sonra ördekleri kullanmanızı öneririz. Şu anda, ördek PBMC'lerini izole etmek için çeşitli yöntemler mevcuttur ve PBMC'lerin izolasyonunun verimliliği, kullanılan ayırma ortamına bağlı olarak değişebilir. Yaygın olarak onaylanmış bir ayırma ortamının kullanılması ve mümkün olduğunca çok lenfositin çıkarılması önerilir²⁵.

İkinci olarak, akış sitometrisi, proliferasyondaki CD8 ⁺ T ve CD4 ⁺ T hücrelerinin oranının her ikisinin de %15'ten az olduğunu tespit etti, bunun nedeni bu protokolde kültürlenen T hücrelerinin esas olarak CD8 ⁺ T ve CD4 ⁺ T hücrelerinin oranının doğal olarak düşük olduğu PBMC'lerden gelmesi olabilir. Dalak dokusu kullanılarak yapılacak gelecekteki deneyler daha önemli sonuçlar verebilir.

Üçüncüsü, kültür işlemi sırasında birçok T hücresi kümesi oluşmayabilir ve bazı hücreler T hücresi farklılaşması sırasında ölebilir. Bu fenomen, uyarılmamış kontrol grubunda daha belirgindir. Bu sorun, T hücreleri kültürlenirken, uyarılmamış grubun aktivasyon ve ko-stimülasyon sinyallerini almaması ve doğrudan programlanmış hücre ölümüne yol açması gerçeğinden kaynaklanıyor olabilir.

Dördüncüsü, bir hibridoma hücre hattı oluşturduk ve büyük miktarda fare anti-ördek IFN-γ antikorunu başarıyla eksprese ettik ve saflaştırdık. Bu antikorları kullanarak, ördek IFN-γ'yi tespit etmek için hücre içi sitokin boyama protokolü geliştirdik. Daha sonra, ELISA kullanarak antikorların duyarlılığını test ettik ve akış sitometrisi için boyama konsantrasyonunu optimize ettik, sonuçta optimal konsantrasyonu 1:10 olarak belirledik ve 1:250'lik bir seyreltmede ikincil antikor olarak PE-Goat Anti-Mouse IgG3 ile eşleştirildik. Deneysel sonuçlar, uyarılan grupta IFN-γ ekspresyonunun %2-%3 olduğunu göstermiştir. IFN-γ üreten hücrelerin nispeten düşük oranı, T hücrelerinin yalnızca bir kez uyarılmış olmasına bağlanabilir. Tek bir antijen stimülasyonu turu, antijene özgü T hücrelerinin popülasyonunu saptanabilir bir seviyeye genişletmek için yeterli olmayabilir. Tekrarlanan antijen stimülasyon turları, antijene özgü T hücrelerini zenginleştirebilir ve aktivasyonlarını artırabilir, böylece IFN-γ pozitif hücrelerin oranını artırabilir. Ayrıca, sadece bir stimülasyondan sonra, yanıt veren T hücresi popülasyonu muhtemelen hala poliklonaldir. Tekrarlanan stimülasyon ve seçim yoluyla, daha yüksek seviyelerde IFN-γ üretimi sergileme eğiliminde olan daha klonal olarak zenginleştirilmiş bir T hücresi popülasyonu elde edilebilir^26,27.

Sonuç olarak, mevcut protokol, ördek antijenine özgü T hücrelerinin proliferasyonunu in vitro olarak indüklemek için bir yöntemi tanımlar ve ördek IFN-γ tespit etmek için bir hücre içi boyama protokolü oluşturur. Bu yaklaşım, ördek T hücresi bağışıklık tepkileri hakkındaki anlayışımızı geliştirir, T hücresi yanıtlarını değerlendirmek için güvenilir bir araç sunar ve kuş viral immünolojisinde araştırmaların ilerlemesine katkıda bulunur.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32473060 ve 32461120064) tarafından desteklenmiştir (MD ve ML'ye); Guangzhou Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Projesi (2025A04J5445) (MD'ye); Yangtze Nehri Akademik Profesör Programının Genç Akademisyenleri (2024, Manman Dai); ve "Guangdong Özel Destek Planı"nın Genç Peal Nehri Bilgini (2024, Manman Dai). Fon sağlayıcıların çalışma tasarımında, veri toplama ve analizinde, yayınlama kararında veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.