In vitro Cultura para células T de pato específicas para H5N1 e detecção de respostas imunes usando o método de coloração de citocinas intracelulares

O protocolo descreve um método para cultivar células T aviárias in vitro , isolando células T de memória de patos infectados, permitindo a geração de células T específicas de pato altamente purificadas. Além disso, um método de coloração de citocinas intracelulares (ICS) foi estabelecido para medir com precisão a secreção de IFN-γ em células T de pato.

A cultura in vitro de células T é um método crítico para estudar respostas imunes, infecções virais e possíveis estratégias terapêuticas. No entanto, nenhum protocolo estabelecido para a cultura de células T aviárias in vitro foi relatado até o momento. Neste estudo, apresentamos um protocolo pela primeira vez, utilizando o vírus H5N1 da influenza aviária de alta patogenicidade (HPAIV) como modelo. Aqui, patos de 4 semanas de idade foram infectados com o vírus e os linfócitos T de memória foram isolados 28 dias após a infecção para cultivar linfócitos T de pato específicos para H5N1, permitindo a investigação da resposta imune específica ao vírus H5N1. As principais etapas do protocolo incluem isolar células mononucleares do sangue periférico de memória (PBMCs) de patos infectados, ativar células apresentadoras de antígenos (APCs) com uma multiplicidade ideal de infecção (MOI = 5) por 6 h e preparar meios de cultura de células T suplementados com IL-2 recombinante e outros aditivos específicos. A proliferação de células T, a secreção de citocinas e a atividade citotóxica foram monitoradas de perto durante todo o processo. Além disso, estabelecemos um protocolo de coloração de citocinas intracelulares para quantificar a secreção de IFN-γ em células T de pato. Isso envolveu a geração de uma linha celular de hibridoma expressando anticorpos IgG3κ específicos para IFN-γ pato, seguido por uma purificação bem-sucedida de anticorpos. O anticorpo purificado foi diluído 1:10 e aplicado em citometria de fluxo para medir com precisão a secreção de IFN-γ. Este método oferece uma ferramenta confiável para avaliar as respostas das células T do pato e estabelece as bases para futuras investigações sobre imunologia viral aviária.

O processo de ativação, proliferação, diferenciação e conversão de células T em células T de memória é central para as respostas imunes específicas do antígeno¹. Inicialmente, as células T são ativadas quando seus receptores de células T (TCR) reconhecem peptídeos antigênicos apresentados na superfície das células apresentadoras de antígenos (APCs) por moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) ^2,3. Esse processo de ativação requer não apenas a ligação do TCR às moléculas de MHC, mas também a coordenação de sinais co-estimulatórios, que são cruciais para a ativação total das funções das células T⁴. Uma vez ativadas, as células T entram rapidamente na fase de proliferação, gerando vários clones que compartilham a mesma especificidade de antígeno que a célula T original. Durante esta fase de proliferação, as células T se diferenciam ainda mais com base em sua função, principalmente em células T CD8⁺ e células T CD4^{+ 5}. Essas células diferenciadas medeiam a morte citotóxica e auxiliam nas respostas imunes, respectivamente. Após a infecção inicial, uma parte das células T ativadas se transforma em células T de memória de longa duração⁶. Essas células T de memória podem persistir no sistema imunológico por longos períodos, respondendo rapidamente ao mesmo patógeno após a reexposição. Como resultado, eles geram uma resposta imune mais forte e eficiente, fornecendo proteção imunológica de longo prazo para o hospedeiro⁷. Todo esse processo é fundamental para o design de vacinas de células T, pois ajuda a melhorar a eficácia e a durabilidade da vacina⁸.

Nesse contexto, o cultivo de células T antígeno-específicas in vitro torna-se essencial. Este protocolo foi desenvolvido com base em métodos consagrados para cultivo in vitro de células T humanas, com adaptações necessárias para o sistema imunológico aviário⁹. Ao cultivar essas células fora do corpo, os pesquisadores podem estudar a resposta das células T em diferentes estados imunológicos, como ativação, proliferação, diferenciação^{e formação de} memória. Essa abordagem in vitro é inestimável para entender os papéis que as células T desempenham nas respostas imunes. Além disso, em condições de cultivo in vitro, a secreção de citocinas (como IFN-γ) pelas células T pode ser monitorada^11,12. Esse monitoramento é crucial para avaliar a qualidade, intensidade e persistência das respostas imunes, bem como estudar as interações entre as células T e outras células imunológicas. Além disso, a expansão in vitro de células T específicas do antígeno permite o enriquecimento em larga escala, aumenta a sensibilidade de detecção e melhora a avaliação dos níveis de resposta das células T¹³. Assim, o cultivo in vitro de células T específicas do antígeno serve como uma ferramenta poderosa para entender melhor o papel das células T de aves nas respostas imunes, o que aumenta a sensibilidade de detecção e melhora a avaliação dos níveis de resposta das células T. Embora métodos in vitro semelhantes tenham sido bem estabelecidos em sistemas de mamíferos, a aplicação de tais técnicas em espécies aviárias permanece limitada. Isso é especialmente relevante na imunologia avícola, onde as ferramentas para analisar as respostas das células T são subdesenvolvidas. Os patos, em particular, servem como reservatórios naturais para vários vírus da gripe aviária, mas pouco se sabe sobre sua imunidade de células T específicas do antígeno. Portanto, o desenvolvimento de um protocolo padronizado de cultura de células T in vitro adaptado aos sistemas aviários é essencial para o avanço da pesquisa básica e da imunologia aplicada em aves.

Uma citocina-chave envolvida nesses processos é o IFN-γ, um interferon tipo II produzido principalmente por células T CD8⁺, células T CD4⁺ tipo 1 e células NK¹⁴. O IFN-γ desempenha um papel crucial na inibição da replicação viral e na regulação das respostas imunes¹⁵. O nível de expressão de IFN-γ reflete o estado imunológico e serve como um marcador para a ativação de células T, permitindo que os pesquisadores avaliem os níveis de resposta das células T por meio de sua expressão^16,17. Um método comum para detectar a expressão de citocinas em células imunes é a coloração intracelular de citocinas (ICS)^18,19. No entanto, devido a limitações em materiais e técnicas experimentais, a pesquisa em patos ficou atrás da dos mamíferos⁵. Atualmente, muitos pesquisadores contam com qPCR para medir os níveis de expressão de IFN-γ, embora esse método tenha certas limitações¹¹. Em nosso laboratório, desenvolvemos com sucesso um anticorpo para IFN-γ de pato que é compatível com citometria de fluxo. Com base nesse sucesso, neste estudo, estabelecemos um método ICS para detectar a expressão da proteína IFN-γ em células T de pato, fornecendo uma ferramenta confiável para estudos adicionais sobre as respostas das células T de pato.

Todos os experimentos com todos os vírus da gripe aviária A (H5N1) disponíveis foram realizados em um laboratório de nível 3 de biossegurança animal e biotânica de acordo com os protocolos da Universidade Agrícola do Sul da China (CNAS BL0011). Todos os projetos de pesquisa com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (código de identificação 2021f154, 29 de julho de 2021) da Universidade de Agricultura do Sul da China. Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com os regulamentos e diretrizes estabelecidos por este comitê e padrões internacionais para o bem-estar animal. Os animais utilizados neste estudo foram patos-reais domésticos (Anas platyrhynchos domestica) com 4 semanas de idade, incluindo machos e fêmeas, com pesos corporais variando de 500 a 600 g.

1. Isolamento de PBMCs de pato e preparação de uma suspensão de célula única

1. Colete 2 mL de sangue heparinizado da veia jugular de cada pato e transfira para tubos contendo EDTA para evitar a coagulação de cada pato individual
2. Dilua o sangue usando o diluente de amostra fornecido do kit de isolamento de linfócitos ou PBS. Misture delicadamente pipetando com uma pipeta Pasteur. A proporção de diluição usual é de 1:1 para o sangue para o diluente.
3. Transfira um volume igual de solução de separação de linfócitos para um tubo de centrífuga como o sangue diluído. Coloque cuidadosamente a suspensão de sangue em cima da solução de separação de linfócitos. Centrifugar a mistura a 400 x g, 25 °C durante 15 min, regulando a aceleração de descida para 1.
   NOTA: A quantidade de solução de separação de linfócitos não deve ser inferior a 4 mL. Os componentes do kit de solução de separação de linfócitos podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
4. Após a centrifugação, observe as quatro camadas distintas no tubo da centrífuga de cima para baixo. A camada superior é o diluente da amostra, seguida pela camada de linfócitos brancos leitosos anulares, depois a solução de separação e a camada inferior consiste em glóbulos vermelhos.
5. Use cuidadosamente uma pipeta para coletar a segunda camada, a camada anular de linfócitos brancos leitosos, e transfira-a para um novo tubo de centrífuga. Adicione 10 mL de solução de limpeza para misturar com as células.
6. Centrifugue a amostra a 440 x g por 5 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o pellet celular em 10 mL de meio RPMI 1640 para contagem de células.
7. Opcional) Para purificar ainda mais a amostra, após centrifugar a 440 x g por 5 min, use tampão de lise de glóbulos vermelhos para remover quaisquer células sanguíneas misturadas restantes.

2. Cultura de células T específicas para H5N1 AIV in vitro

1. Compre patos-reais saudáveis de 2 semanas (Sheldrake) de uma fazenda de patos e abrigue-os em isoladores de pressão negativa. Confirme se os patos são negativos para AIV usando ensaios de inibição da hemaglutinação (HI) antes do experimento. Infecte patos de 4 semanas com H5N1 AIV 1 x 10⁶, com dose infecciosa de 50% de ovo [EID50] / 0,2 mL por via intranasal.
2. Isole PBMCs de memória de patos infectados com H5N1 28 dias após a infecção, seguindo o método descrito na etapa 1. Conte as células usando um hemocitômetro. Dilua a suspensão celular na proporção de 1:1 com 0,08% de azul de tripano e conte as células viáveis (não coradas) manualmente sob um microscópio óptico.
   NOTA: Conforme apoiado por nosso estudo publicado anteriormente²⁰, as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) isoladas 28 dias após a infecção são consideradas enriquecidas em células T de memória. Nesse estágio, a fase efetora diminuiu e as populações de células de memória são predominantes.
3. Defina a concentração para 3 x 10⁶ células/mL, garantindo que 1 mL de meio seja adicionado a cada poço da placa de 48 poços.
4. Co-infectar os PBMCs isolados com o vírus da gripe aviária H5N1 (AIV) para servir como APCs. A dose viral é MOI = 5. Co-cultura dos PBMCs com o vírus por 1 h a 37 ° C. Agite suavemente com a mão a cada 15 min.
5. Após 1 h de infecção, lave as células 2x com PBS para remover as partículas virais não ligadas. Ressuspender as PBMCs lavadas em 1 ml de meio de cultura de células T e incubar as células suspensas a 37 °C durante 5 h.
6. Centrifugue as células a 440 x g por 5 min em temperatura ambiente. Em seguida, ressuspenda as células apresentadoras de antígenos incubadas (APCs) em 100 μL de meio de cultura de células T e adicione-as às células efetoras. A proporção de células apresentadoras de antígenos para células efetoras deve ser de 1:5.
7. Incubar as células numa atmosfera de CO₂ a 5% a 37 °C durante 14 dias. A cada 2 dias, substitua metade do sobrenadante da cultura de células por meio de células T frescas, pipetando cuidadosamente para garantir uma distribuição uniforme. Descarte metade do meio que contém as células e adicione um volume igual de novo meio.
8. No dia 7, observe as células sob um microscópio óptico a 100x.
9. Use PBMCs de memória tratados com PBS como o grupo de controle não estimulado.

3. Éster succinimidílico de diacetato de fluoresceína carboxina (CFSE) para monitorar a proliferação de células T

1. Ajuste a densidade celular para 0,5-1 x 10⁷ células / mL e ressuspenda as células com 5 mL de PBS após centrifugação a 440 x g por 5 min.
2. Diluir o estoque de 10 mM para 1 μM CFSE com 5 mL de PBS pré-resfriado; operar no escuro.
3. Inclinar os dois tubos de centrífuga a 45°, adicionar a diluição CFSE à suspensão de células com uma pipeta Pasteur, misturar bem e colocar em banho-maria a 37 °C durante 15 min no escuro.
4. Lave as células diluindo-as em 10 volumes de PBS pré-resfriado contendo 5% de FBS, sedimento por centrifugação a 440 x g por 5 min e descarte o sobrenadante. Repita a lavagem 2x.
5. Estimule as células marcadas com CFSE in vitro conforme a etapa 2. Na conclusão do ensaio de proliferação, colher células e analisar por citometria de fluxo.

4. Análise por citometria de fluxo para proliferação de células T CD8⁺ e T CD4⁺

1. Após 7 dias de cultura, coletar todas as células de cada poço e dividi-las em dois tubos de fluxo para análise.
2. Transfira as células para um novo tubo de centrífuga, centrifugue a 440 x g por 5 min em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
3. Adicione 100 μL de coquetel de anticorpos (camundongo anti-pato CD8, 1:50 ou camundongo anti-pato CD4, 1:50) e incube as células por 30 minutos no escuro a 4 °C.
4. Transfira as células para um novo tubo de centrífuga, centrifugue a 440 x g por 5 min em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
5. Adicione 100 μL de coquetel de anticorpos (Goat-Conjugated FITC-Rat Anti-Mouse IgG2b, 1:50) e incube as células por 30 min no escuro a 4 ° C.
6. Lave as células uma vez com 1 mL de PBS centrifugando a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Analise os dados usando o software FlowJo. A estratégia de gating é mostrada na Figura 1 suplementar.

5. Resposta de células T por ensaios de expressão gênica de assinatura usando qPCR

1. Conte as células no final da cultura de células T, colete em tubos de centrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 400 x g por 5 min. Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante.
2. Extração de RNA
   NOTA: A extração pode ser realizada em uma capela ou bancada ultralimpa para evitar a contaminação por RNA.
   1. Lise as células usando o tampão de lise fornecido no kit de acordo com as instruções do fabricante. Transferir a amostra lisada para colunas de filtro de gADN (pré-colocadas em tubos de recolha), centrifugar a 13.400 x g durante 30 s, rejeitar as colunas e recolher o filtrado. Adicionar 0,5 volume de etanol absoluto ao filtrado. Homogeneizar.
      NOTA: Uma solução turva ou precipitado após a adição de etanol é normal. Agite e prossiga para a próxima etapa.
   2. Transferir a mistura para colunas de ARN, centrifugar a 13.400 x g durante 30 s. Descarte o filtrado, adicione 700 μL de tampão RW1 e centrifugue novamente.
   3. Rejeitar o filtrado, adicionar 700 μL de tampão RW2 (com etanol absoluto) e centrifugar. Rejeitar o filtrado, adicionar 500 μL de tampão RW2 (com etanol absoluto) e centrifugar durante 2 min. Remova cuidadosamente a coluna do tubo para evitar contaminação do filtrado. Certifique-se de que todas as soluções de enxágue sejam removidas para evitar interferência nas reações a jusante.
   4. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta sem RNase, adicione 50-200 μL de ddH₂O livre de RNase, deixe descansar em temperatura ambiente por 1 min e, em seguida, centrifugue a 13.400 x g por 1 min para eluir o RNA. Meça a pureza e a concentração do RNA.
      NOTA: Pré-aqueça ddH₂O sem RNase a 65 °C para aumentar o rendimento e execute uma segunda eluição, se necessário.
3. Sintetize o cDNA seguindo as instruções do kit. Sintetize a fita de cDNA de acordo com as instruções do fabricante, adicionando 5x a quantidade de transcriptase reversa. Transcreva inversamente a 37 °C durante 15 min, depois a 85 °C durante 5 s e arrefecer a 4 °C.
4. Configure a reação de PCR de acordo com o protocolo do fabricante.
   1. Em um tubo de qPCR, combine 10 μL de mistura enzimática de reação 2x PCR, 0,4 μL de primer 1, 0,4 μL de primer 2, 1 μL de molde de cDNA e 8,2 μL de ddH₂O para fazer uma mistura de 20 μL.
   2. Execute a PCR no instrumento de PCR quantitativo em tempo real com o seguinte programa:
      Estágio 1: 95 °C por 30 s, Rep x 1
      Estágio 2: 95 °C por 3 s, 60 °C por 30 s, Rep x 35
      Estágio 3: 95 °C por 15 s, 60 °C por 60 s, 95 °C por 15 s, Rep x 1

6. Coloração de citocinas intracelulares (ICS)

NOTA: Este protocolo foi desenvolvido para avaliar a resposta efetora de células T CD8⁺ específicas para H5N1, detectando secreção intracelular de IFN-γ em patos.

1. Cultura de células T específicas para H5N1 in vitro seguindo o procedimento descrito na etapa 2. Colha todas as células (de cada poço) após 7 dias do início da cultura.
2. Incube as células apresentadoras de antígenos (APCs) conforme descrito na etapa 2. Adicione os APCs incubados e Brefeldin A (1:1.000) às células efetoras e co-incube por 6 h em uma incubadora a 39 °C.
3. Transfira as células para um novo tubo de centrífuga, centrifugue a 440 x g por 5 min em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
4. Adicione 100 μL de coquetel de anticorpos (camundongo anti-pato CD8, 1:50) às células e incube por 30 minutos no escuro a 4 ° C.
5. Lave as células centrifugando a 400 x g por 5 min a 4 ° C e ressuspenda-as em 1 mL de PBS. Adicione um coquetel de anticorpos (Goat-Conjugated Goat Anti-Mouse IgG2b, 1:50) e incube por 30 min no escuro a 4 ° C.
6. Lavar novamente as pilhas centrifugando a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em 100 μL de tampão de fixação e incube por 20-25 min no escuro a 4 ° C.
7. Lavar as células mais uma vez centrifugando a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Adicione 1 mL de tampão de permeabilização 1x e lave as células 2x por centrifugação a 440 x g por 5 min a 4 °C.
8. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em 100 μL de tampão de permeabilização e adicione o anticorpo (Mouse Anti-Duck IFN-γ, 1:10) às células. Após fixação e permeabilização da membrana, incubar a mistura célula-anticorpo durante 30 min na obscuridade, agitando ocasionalmente durante a incubação a 4 °C.
   NOTA: A solução de permeabilização/lavagem é uma solução estoque 10x e deve ser diluída com PBS antes do uso.
9. Lave as células mais uma vez com 1 mL de PBS centrifugando a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Adicione 100 μL de coquetel de anticorpos (Goat Anti-Mouse IgG3 conjugado com PE, 1:250) e incube por 30 min no escuro a 4 ° C.
10. Analise os dados usando o software FlowJo. A estratégia de gating é mostrada na Figura 1.

Este protocolo foi desenvolvido com base em um estudo anterior sobre a detecção de respostas efetoras de células T específicas do antígeno em patos²⁰. A primeira etapa do experimento envolve o cultivo in vitro de células T específicas do vírus, que servem como base para estudos subsequentes de resposta efetora. Inicialmente, as APCs foram incubadas e co-cultivadas com células efetoras. As observações morfológicas revelaram que, após a proliferação, as células exibiram crescimento de cluster (Figura 2A). A marcação CFSE confirmou ainda mais a proliferação bem-sucedida, mostrando vários picos de divisão celular (Figura 2B). Finalmente, usamos marcadores de células específicas de pato CD8 / CD4 para avaliar a proporção e o número absoluto de células²⁰, confirmando o sucesso da cultura in vitro de células T específicas do antígeno (Figura 2C).

No 7º dia da cultura, coletamos as células e avaliamos a expressão de genes relacionados ao sistema imunológico. Descobrimos que as células T em proliferação expressaram predominantemente genes associados a citotóxicos, como Granzyme A e IFN-γ^11,20 (Figura 3), sugerindo que elas contribuem principalmente para respostas citotóxicas. Para investigar melhor essa resposta efetora, estabelecemos um protocolo de coloração específico para pato para detectar quantitativamente a secreção de IFN-γ pelas células T pato. A citometria de fluxo foi usada para fixar, permeabilizar e marcar células T CD8 da população proliferada com um anticorpo anti-IFN-γ. Os resultados mostraram uma regulação positiva significativa na proporção de células IFN-γ⁺ nas populações CD8^high+T e CD8^low+T após a estimulação do antígeno (Figura 4), indicando uma resposta efetora robusta nas células T CD8⁺ geradas pela proliferação.

Figura 1: Estratégia de gating de células T CD4⁺/CD8⁺. (A) Gating e análise da porcentagem e fenótipo de células T CD4⁺ entre células estimuladas e não estimuladas por H5N1 após 14 dias de cultivo. (B) Gating e análise da porcentagem e fenótipo de células T CD8 ⁺ entre células estimuladas e não estimuladas por H5N1 após 14 dias de cultivo. Este número foi modificado de²⁰. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Cultura in vitro de células T de pato específicas para H5N1 AIV. (A) Análise morfológica de PBMCs de memória com ou sem estimulação por H5N1 AIV. Dois experimentos independentes foram conduzidos usando dois doadores PBMC de memória de pato diferentes. (B) A proliferação de PBMCs de memória marcadas com CFSE foi avaliada pela diluição de CFSE em células estimuladas por H5N1 de patos infectados com H5N1 após 2 semanas de cultivo. A amostra vermelha representa PBMCs de memória marcados com CFSE sem estimulação, enquanto as amostras amarela, verde e preta representam PBMCs de memória marcadas com CFSE estimuladas com H5N1 após 7, 8 e 14 dias de cultura, respectivamente. (C) A porcentagem de células T CD4⁺ e CD8⁺ foi analisada entre células H5N1 estimuladas e não estimuladas após 14 dias de cultivo. A significância estatística foi determinada usando um teste t não pareado. (D) O número de células T CD4⁺ e CD8⁺ foi comparado entre células H5N1 estimuladas e não estimuladas após 14 dias de cultivo. Os dados sobre porcentagens e números de células T foram obtidos de dois experimentos independentes com duas repetições cada. A análise estatística foi realizada usando um teste t não pareado ns p > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01. Este número foi modificado de²⁰. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Detecção da resposta de células T de pato específicas do H5N1 AIV por qRT-PCR. Os dados foram coletados de três repetições no grupo estimulado por H5N1 e no grupo não estimulado, respectivamente. Os resultados foram apresentados como médias ± EPM, e o teste t pareado foi utilizado para comparação estatística. *p < 0,05, **p < 0,01. Este número foi modificado de²⁰. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise de citometria de fluxo da expressão de IFN-γ em células T CD8⁺ de PBMCs de pato estimuladas. (A) Estratégia de gating de ICS para o grupo estimulado e o grupo controle. (B) Análise estatística da expressão de IFN-γ em células CD8^low+ e CD8^high+ de PBMCs de pato após estimulação. A diferença na expressão de IFN-γ entre os grupos foi avaliada pelo teste t, e as comparações foram consideradas significativas em p≤ 0,05. Este número foi modificado de²⁰. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Estratégia de gating usada para células T CD4⁺ e CD8⁺ . Clique aqui para baixar este arquivo.

Este protocolo fornece um método eficiente para o cultivo in vitro de células T específicas do antígeno do pato e também estabelece um protocolo de coloração de citocinas intracelulares para patos, que pode ser usado para avaliar as respostas efetoras das células T. Atualmente, não há relatos publicados sobre protocolos de cultivo in vitro para células T de pato. Referenciamos principalmente protocolos para células T específicas de antígenos humanos, mas estamos comprometidos em otimizar as condições de incubação para APCs. Estamos considerando uma otimização adicional do nosso protocolo de diferenciação.

Existem duas etapas críticas neste protocolo que são essenciais para seu sucesso. Primeiro, a cultura in vitro de células T de pato requer uma otimização cuidadosa das condições de estimulação, incluindo dose de antígeno, ativação de APC e duração da cultura, para garantir expansão suficiente de células T e preservação funcional. Qualquer desvio nesses parâmetros pode levar à ativação abaixo do ideal ou à morte celular. Em segundo lugar, o ensaio ICS é uma técnica chave para avaliar funcionalmente a expressão de IFN-γ. O ICS bem-sucedido requer controle preciso do tempo de estimulação, etapas de fixação/permeabilização e especificidade do anticorpo. Ambas as etapas são altamente sensíveis e devem ser cuidadosamente executadas para obter uma detecção confiável e reprodutível das respostas das células T específicas do antígeno.

Aqui, usamos citometria de fluxo para detectar proliferação celular e qPCR para examinar a produção de citocinas características. Mais importante ainda, expressamos e purificamos com sucesso uma linhagem celular de hibridoma produzindo anticorpos anti-IFN-γ de camundongos, que foram usados para detectar a expressão de IFN-γ, avaliando assim o nível de resposta efetora das células T. Com algumas pequenas modificações, essa abordagem também pode ser adaptada para ensaios de proliferação celular em outras espécies, como galinhas.

Usamos um kit de isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) para isolar PBMCs de pato porque o kit é eficaz e economiza tempo. Outros métodos de separação, como o método de separação Precoll, também podem²¹ atingir o objetivo de isolar PBMCs de pato por meio de diferentes etapas. No entanto, em comparação com o kit, esses métodos levam mais tempo.

Alguns problemas podem surgir durante a execução deste protocolo. Em primeiro lugar, a proliferação de células T após estimulação viral é principalmente uma resposta das células T de memória 22,23,24. Para garantir a proliferação adequada de células T, recomendamos o uso de patos 4 a 10 semanas após a infecção. Atualmente, existem vários métodos disponíveis para isolar PBMCs de pato, e a eficiência do isolamento de PBMCs pode variar dependendo do meio de separação usado. Recomenda-se o uso de um meio de separação amplamente certificado e a extração do maior número possível de linfócitos²⁵.

Em segundo lugar, a citometria de fluxo detectou que a proporção de células T CD8⁺ e T CD4⁺ na proliferação foi inferior a 15%, o que pode ser porque as células T cultivadas neste protocolo vêm principalmente de PBMCs, nas quais a proporção de células T CD8⁺ e CD4⁺ é inerentemente baixa. Experimentos futuros usando tecido do baço podem produzir resultados mais significativos.

Em terceiro lugar, durante o processo de cultura, muitos aglomerados de células T podem não se formar e algumas células podem morrer durante a diferenciação de células T. Esse fenômeno é mais pronunciado no grupo controle não estimulado. Esse problema pode ser devido ao fato de que, como as células T são cultivadas, o grupo não estimulado não recebe sinais de ativação e co-estimulação, levando diretamente à morte celular programada.

Em quarto lugar, construímos uma linhagem celular de hibridoma e expressamos e purificamos com sucesso uma grande quantidade de anticorpos anti-IFN-γ de camundongos. Usando esses anticorpos, desenvolvemos um protocolo de coloração de citocinas intracelulares para detectar IFN-γ de pato. Em seguida, testamos a sensibilidade dos anticorpos usando ELISA e otimizamos a concentração de coloração para citometria de fluxo, determinando a concentração ideal em 1:10, emparelhada com PE-Goat Anti-Mouse IgG3 como anticorpo secundário em uma diluição de 1:250. Os resultados experimentais mostraram que a expressão de IFN-γ no grupo estimulado foi de 2%-3%. A proporção relativamente baixa de células produtoras de IFN-γ pode ser atribuída ao fato de que as células T foram estimuladas apenas uma vez. Uma única rodada de estimulação de antígeno pode não ser suficiente para expandir a população de células T específicas do antígeno para um nível detectável. Rodadas repetidas de estimulação de antígenos podem enriquecer as células T específicas do antígeno e aumentar sua ativação, aumentando assim a proporção de células positivas para IFN-γ. Além disso, após apenas uma estimulação, a população de células T que responde provavelmente ainda é policlonal. Por meio de estimulação e seleção repetidas, pode-se obter uma população de células T mais enriquecida clonalmente, que tende a exibir níveis mais altos de produção de IFN-γ^26,27.

Em conclusão, o protocolo atual descreve um método para induzir a proliferação de células T específicas do antígeno de pato in vitro e estabelece um protocolo de coloração intracelular para detectar IFN-γ de pato. Essa abordagem aprimora nossa compreensão das respostas imunes das células T de pato, oferece uma ferramenta confiável para avaliar as respostas das células T e contribui para o avanço da pesquisa em imunologia viral aviária.

Os autores não têm nada a divulgar.

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32473060 e 32461120064) (para MD e ML); Projeto de Pesquisa Básica e Aplicada de Guangzhou (2025A04J5445) (para MD); o Programa de Jovens Acadêmicos do Rio Yangtze (2024, Manman Dai); e o Young Peal River Scholar do "Plano de Apoio Especial de Guangdong" (2024, Manman Dai). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.