В пробирке Посев H5N1-специфичных Т-клеток уток и выявление иммунных реакций методом внутриклеточного окрашивания цитокинов

Протокол описывает метод культивирования птичьих Т-клеток in vitro путем выделения Т-клеток памяти от инфицированных уток, что позволяет получать высокоочищенные специфические Т-клетки уток. Кроме того, был разработан метод внутриклеточного окрашивания цитокинов (ИКС) для точного измерения секреции ИФН-γ в Т-клетках уток.

Культура Т-клеток in vitro является критически важным методом для изучения иммунных реакций, вирусных инфекций и потенциальных терапевтических стратегий. Тем не менее, до настоящего времени не сообщалось об установленных протоколах культивирования птичьих Т-клеток in vitro . В этом исследовании мы впервые представляем протокол, используя в качестве модели высокопатогенный вирус птичьего гриппа (HPAIV) H5N1. Здесь 4-недельные утки были инфицированы вирусом, а Т-лимфоциты памяти были выделены через 28 дней после заражения для культивирования H5N1-специфичных Т-лимфоцитов уток, что позволило исследовать специфический иммунный ответ на вирус H5N1. Ключевыми этапами протокола являются выделение мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) памяти от инфицированных уток, активация антигенпрезентирующих клеток (АПК) с оптимальной кратностью инфекции (MOI = 5) в течение 6 ч, а также приготовление питательных сред Т-клеток с добавлением рекомбинантного IL-2 и других специфических добавок. Пролиферация Т-клеток, секреция цитокинов и цитотоксическая активность тщательно контролировались на протяжении всего процесса. Кроме того, мы разработали протокол внутриклеточного окрашивания цитокинов для количественной оценки секреции ИФН-γ в Т-клетках уток. Это включало в себя создание гибридомной клеточной линии, экспрессирующей антитела IgG3κ, специфичные к утиному ИФН-γ, с последующей успешной очисткой антител. Очищенное антитело разбавляли в соотношении 1:10 и применяли в проточной цитометрии для точного измерения секреции ИФН-γ. Этот метод является надежным инструментом для оценки реакции Т-клеток уток и закладывает основу для будущих исследований в области вирусной иммунологии птиц.

Процесс активации, пролиферации, дифференцировки и превращения Т-клеток в Т-клетки памяти занимает центральное место в антиген-специфических иммунных реакциях¹. Первоначально Т-клетки активируются, когда их Т-клеточные рецепторы (TCR) распознают антигенные пептиды, представленные на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC) молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) ^2,3. Этот процесс активации требует не только связывания TCR с молекулами MHC, но и координации костимулирующих сигналов, которые имеют решающее значение для полной^{активации функций} Т-клеток. После активации Т-клетки быстро вступают в фазу пролиферации, производя многочисленные клоны, которые имеют ту же антигенную специфичность, что и исходные Т-клетки. Во время этой фазы пролиферации Т-клетки далее дифференцируются в зависимости от своей функции, в первую очередь в CD8⁺ Т-клетки и CD4^{+ Т-клетки5}. Эти дифференцированные клетки опосредуют цитотоксическое убийство и помогают иммунным реакциям, соответственно. После первичной инфекции часть активированных Т-клеток трансформируется в долгоживущие Т-клетки памяти⁶. Эти Т-клетки памяти могут сохраняться в иммунной системе в течение длительного времени, быстро реагируя на тот же патоген при повторном воздействии. В результате они генерируют более сильный и эффективный иммунный ответ, обеспечивая долгосрочную иммунную защиту хозяина⁷. Весь этот процесс имеет решающее значение для разработки Т-клеточных вакцин, поскольку он помогает повысить эффективность и долговечность вакцины⁸.

В этом контексте выращивание антиген-специфических Т-клеток in vitro становится необходимым. Этот протокол был разработан на основе установленных методов культивирования in vitro Т-клеток человека с необходимыми адаптациями для иммунной системы птиц⁹. Выращивая эти клетки вне организма, исследователи могут изучать реакцию Т-клеток при различных иммунных состояниях, таких как активация, пролиферация, дифференцировка^{и формирование памяти}. Этот подход in vitro бесценен для понимания роли, которую Т-клетки играют в иммунных реакциях. Кроме того, в условиях культивирования in vitro можно контролировать секрецию цитокинов (таких как ИФН-γ) Т-клетками^11,12. Этот мониторинг имеет решающее значение для оценки качества, интенсивности и стойкости иммунных реакций, а также для изучения взаимодействий между Т-клетками и другими иммунными клетками. Кроме того, экстракорпоральная экспансия антиген-специфичных Т-клеток in vitro обеспечивает крупномасштабное обогащение, повышает чувствительность обнаружения и улучшает оценку уровней ответа Т-клеток¹³. Таким образом, культура антиген-специфических Т-клеток in vitro служит мощным инструментом для лучшего понимания роли Т-клеток птицы в иммунных реакциях, что повышает чувствительность обнаружения и усиливает оценку уровней Т-клеточного ответа. В то время как подобные методы in vitro хорошо зарекомендовали себя в системах млекопитающих, применение таких методов у видов птиц остается ограниченным. Особенно это актуально в иммунологии птицы, где инструменты для анализа Т-клеточных ответов недостаточно развиты. Утки, в частности, служат естественными резервуарами для нескольких вирусов птичьего гриппа, но мало что известно об их антиген-специфическом Т-клеточном иммунитете. Таким образом, разработка стандартизированного протокола культивирования Т-клеток in vitro, адаптированного к птичьим системам, имеет важное значение для продвижения как фундаментальных исследований, так и прикладной иммунологии у домашней птицы.

Ключевым цитокином, участвующим в этих процессах, является ИФН-γ, интерферон II типа, продуцируемый в основном CD8⁺ Т-клетками, CD4⁺ Т-клетками 1 типа и NK-клетками¹⁴. ИФН-γ играет решающую роль в подавлении репликации вируса и регуляции иммунных реакций¹⁵. Уровень экспрессии ИФН-γ отражает иммунный статус и служит маркером активации Т-клеток, что позволяет исследователям оценивать уровни ответа Т-клеток через его экспрессию ^16,17. Одним из распространенных методов определения экспрессии цитокинов в иммунных клетках является внутриклеточное окрашивание цитокинов (ИКС)^18,19. Однако из-за ограничений в экспериментальных материалах и методах исследования уток отстают от исследований млекопитающих^. В настоящее время многие исследователи полагаются на кПЦР для измерения уровня экспрессии ИФН-γ, хотя этот метод имеет определенные^{ограничения11}. В нашей лаборатории мы успешно разработали антитело к ИФН-γ у уток, совместимое с проточной цитометрией. Основываясь на этом успехе, в этом исследовании мы разработали метод ICS для обнаружения экспрессии белка ИФН-γ в Т-клетках уток, обеспечив надежный инструмент для дальнейшего изучения реакций Т-клеток уток.

Все эксперименты со всеми имеющимися вирусами птичьего гриппа A (H5N1) проводились в лаборатории биобезопасности животных уровня 3 и в помещении для животных в соответствии с протоколами Южно-Китайского сельскохозяйственного университета (CNAS BL0011). Все исследовательские проекты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (идентификационный код 2021f154, 29 июля 2021 г.) Южно-Китайского сельскохозяйственного университета. Все процедуры с животными выполнялись в соответствии с правилами и руководящими принципами, установленными этим комитетом, и международными стандартами благополучия животных. В этом исследовании использовались 4-недельные домашние кряквы (Anas platyrhynchos domestica), включая как самцов, так и самок, с массой тела от 500 до 600 г.

1. Выделение утиных ПБМК и приготовление одноклеточной суспензии

1. Соберите 2 мл гепаринизированной крови из яремной вены каждой утки и перенесите в пробирки, содержащие ЭДТА, чтобы предотвратить свертывание крови у каждой отдельной утки
2. Разбавьте кровь с помощью предоставленного образца разбавителя из набора для выделения лимфоцитов или PBS. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки с помощью пастеровской пипетки. Обычное соотношение разведения крови к разбавлению составляет 1:1.
3. Переведите в центрифужную пробирку такой же объем раствора для разделения лимфоцитов, как и разбавленную кровь. Тщательно налейте кровяную суспензию поверх раствора для разделения лимфоцитов. Центрифугируйте смесь при температуре 400 x g, 25 °C в течение 15 минут, установив ускорение падения на 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество раствора для разделения лимфоцитов должно быть не менее 4 мл. С компонентами набора раствора для разделения лимфоцитов можно ознакомиться в Таблице материалов.
4. После центрифугирования наблюдайте за четырьмя отдельными слоями в центрифужной пробирке сверху донизу. Верхний слой представляет собой разбавитель образца, за ним следует кольцевой молочно-белый слой лимфоцитов, затем разделительный раствор, а нижний слой состоит из эритроцитов.
5. Осторожно с помощью пипетки соберите второй слой, кольцевой молочно-белый слой лимфоцитов, и перенесите его в новую центрифужную пробирку. Добавьте 10 мл чистящего раствора для смешивания с клетками.
6. Центрифугируйте образец при давлении 440 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл среды RPMI 1640 для подсчета клеток.
7. Необязательно) Для дальнейшей очистки образца после центрифугирования при 440 x g в течение 5 минут используйте буфер для лизиса эритроцитов для удаления любых оставшихся смешанных клеток крови.

2. Культура Т-клеток in vitro H5N1 AIV-специфичная для Вас культура

1. Купите 2-недельных здоровых крякв (Шелдрейк) на утиной ферме и разместите их в изоляторах с отрицательным давлением. Подтвердите отрицательный результат теста на AIV у уток с помощью тестов на ингибирование гемагглютинации (HI) до начала эксперимента. Инфицировать 4-недельных уток H5N1 AIV 1 x 10⁶ интраназально 50% инфекцией яиц [EID50]/0,2 мл интраназально.
2. Изолируйте PBMC памяти от инфицированных H5N1 уток через 28 дней после заражения, следуя методу, описанному в шаге 1. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Разбавьте клеточную суспензию в соотношении 1:1 0,08% трипанового синего и подсчитайте жизнеспособные (неокрашенные) клетки вручную под световым микроскопом.
   Примечание: Как подтверждается нашим ранее опубликованным исследованием²⁰, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), выделенные через 28 дней после заражения, считаются обогащенными Т-клетками памяти. На этой стадии эффекторная фаза ослабевает, и популяции клеток памяти преобладают.
3. Установите концентрацию на 3 x 10⁶ клеток/мл, обеспечивая добавление 1 мл среды в каждую лунку 48-луночного планшета.
4. Коинфицировать выделенные PBMC вирусом птичьего гриппа H5N1 (AIV) в качестве APC. Доза вируса составляет MOI = 5. Совместное культивирование PBMC с вирусом в течение 1 ч при 37 °C. Осторожно встряхивайте рукой каждые 15 минут.
5. Через 1 час после заражения промойте клетки 2 раза PBS, чтобы удалить несвязанные вирусные частицы. Ресуспендируйте промытые PBMC в 1 мл питательной среды для Т-клеток и далее инкубируйте взвешенные клетки при 37 °C в течение 5 ч.
6. Центрифугируйте клетки при давлении 440 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. После этого ресуспендируют инкубированные антигенпрезентирующие клетки (АПК) в 100 мкл питательной среды для Т-клеток и добавляют их к эффекторным клеткам. Соотношение антигенпрезентирующих клеток к эффекторным клеткам должно составлять 1:5.
7. Инкубируйте клетки в атмосфере с содержанием_CO2 5% при 37 °C в течение 14 дней. Каждые 2 дня заменяйте половину надосадочной жидкости клеточной культуры свежей Т-клеточной средой путем тщательного пипетирования для обеспечения равномерного распределения. Выбросьте половину среды, содержащей клетки, затем добавьте такой же объем новой среды.
8. На 7-й день наблюдайте за клетками под оптическим микроскопом при 100-кратном увеличении.
9. Используйте PBMC памяти, обработанные PBS, в качестве нестимулированной контрольной группы.

3. Карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидиловый эфир (CFSE) для мониторинга пролиферации Т-клеток

1. Отрегулируйте плотность клеток до 0,5-1 x 10⁷ клеток/мл и повторно суспендируйте клетки 5 мл PBS после центрифугирования при 440 x g в течение 5 минут.
2. Разбавьте 10 мМ исходных данных до 1 мкМ CFSE с 5 мл предварительно охлажденного PBS; Работа в темное время суток.
3. Наклоните две центрифужные пробирки под углом 45°, добавьте раствор CFSE в клеточную суспензию с помощью пипетки Пастера, хорошо перемешайте и поставьте на водяную баню при температуре 37 °C на 15 минут в темноте.
4. Промойте ячейки, разбавив их в 10 объемах предварительно охлажденного PBS, содержащего 5% FBS, осадите центрифугированием при 440 x g в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите стирку 2 раза.
5. Стимулируйте клетки, меченные CFSE in vitro , в соответствии с шагом 2. По завершении пролиферационного анализа проводят забор клеток и анализ с помощью проточной цитометрии.

4. Проточный цитометрический анализ на пролиферацию CD8⁺ Т и CD4⁺ Т-клеток

1. После 7 дней культивирования соберите все клетки из каждой лунки и разделите их на две проточные трубки для анализа.
2. Переложите клетки в новую центрифужную пробирку, центрифугируйте при 440 x g в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
3. Добавьте 100 мкл коктейля антител (мышиный антиутиный CD8, 1:50 или мышиный антиутиный CD4, 1:50) и инкубируйте клетки в течение 30 мин в темноте при 4 °C.
4. Переложите клетки в новую центрифужную пробирку, центрифугируйте при 440 x g в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
5. Добавьте 100 мкл коктейля антител (FITC-конъюгированный козий антимышиный IgG2b, 1:50) и инкубируйте клетки в течение 30 мин в темноте при 4 °C.
6. Один раз промойте ячейки 1 мл PBS центрифугированием при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения FlowJo. Стратегия стробирования показана на дополнительном рисунке 1.

5. Ответ Т-клеток с помощью анализов экспрессии сигнатурных генов с использованием количественной ПЦР

1. Подсчитайте клетки в конце культивирования Т-клеток, соберите их в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 400 х г в течение 5 минут. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
2. Экстракция РНК
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция может быть выполнена в вытяжном шкафу или ультрачистом стенде для предотвращения загрязнения РНК.
   1. Лизируйте клетки с помощью буфера для лизиса, входящего в комплект, в соответствии с инструкциями производителя. Перенесите лизированный образец в колонки с фильтром gDNA (предварительно помещенные в пробирки для сбора), центрифугируйте при давлении 13 400 x g в течение 30 с, выбросьте колонки и соберите фильтрат. Добавьте в фильтрат 0,5 объема абсолютного этанола. Тщательно перемешиваем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мутный раствор или осадок после добавления этанола являются нормальным явлением. Встряхните и переходите к следующему шагу.
   2. Перенесите смесь в колонки с РНК, центрифугируйте при давлении 13 400 x g в течение 30 с. Выбросьте фильтрат, добавьте 700 мкл буфера RW1 и снова центрифугируйте.
   3. Выбросьте фильтрат, добавьте 700 мкл буфера RW2 (с абсолютным этанолом) и центрифугуйте. Выбросьте фильтрат, добавьте 500 μл буфера RW2 (с абсолютным этанолом) и центрифугируйте в течение 2 минут. Осторожно снимите колонку с трубки, чтобы избежать загрязнения фильтратом. Убедитесь, что все растворы для промывки удалены, чтобы предотвратить вмешательство в последующие реакции.
   4. Переложите колонку в новую пробирку для сбора, не содержащую РНКазы, добавьте 50-200 мкл ddH₂O, не содержащую РНКазы, дайте ей постоять при комнатной температуре в течение 1 минуты, затем центрифугируйте при 13 400 x g в течение 1 минуты для элюирования РНК. Измерьте чистоту и концентрацию РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разогрейте ddH без РНКазы₂O до 65 °C для увеличения выхода и при необходимости выполните повторное элюирование.
3. Синтезируйте кДНК, следуя инструкциям набора. Синтезируйте цепь кДНК в соответствии с инструкциями производителя, добавив в 5 раз больше обратной транскриптазы. Выполните обратную транскрибацию при 37 °C в течение 15 минут, затем при 85 °C в течение 5 секунд и охладите до 4 °C.
4. Настройте реакцию ПЦР в соответствии с протоколом производителя.
   1. В пробирке для количественной ПЦР смешайте 10 мкл 2x смеси ферментов для ПЦР-реакции, 0,4 мкл праймера 1, 0,4 мкл праймера 2, 1 мкл матрицы кДНК и 8,2 мкл ddH₂O для получения смеси объемом 20 мкл.
   2. Запустите ПЦР в приборе для количественной ПЦР в реальном времени с помощью следующей программы:
      Ступень 1: 95 °C в течение 30 с, Rep x 1
      Ступень 2: 95 °C в течение 3 с, 60 °C в течение 30 с, Rep x 35
      Ступень 3: 95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 60 с, 95 °C в течение 15 с, Rep x 1

6. Внутриклеточное окрашивание цитокинов (ИКС)

Примечание: Этот протокол был разработан для оценки эффекторного ответа H5N1-специфичных CD8⁺ Т-клеток путем обнаружения внутриклеточной секреции ИФН-γ у уток.

1. Культивируйте H5N1-специфичные Т-клетки in vitro в соответствии с процедурой, описанной на шаге 2. Соберите все клетки (из каждой лунки) через 7 дней после начала культивирования.
2. Инкубируйте антигенпрезентирующие клетки (APC), как описано в шаге 2. Добавьте инкубированные APC и Brefeldin A (1:1000) к эффекторным клеткам и соинкубируйте в течение 6 ч в инкубаторе при температуре 39 °C.
3. Переложите клетки в новую центрифужную пробирку, центрифугируйте при 440 x g в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
4. Добавьте в клетки 100 μL коктейля антител (мышиный анти-утиный CD8, 1:50) и инкубируйте в течение 30 минут в темноте при 4 °C.
5. Промойте клетки центрифугированием при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C и повторно суспендируйте их в 1 мл PBS. Добавьте коктейль антител (FITC-конъюгированный козий антимышиный IgG2b, 1:50) и инкубируйте в течение 30 минут в темноте при температуре 4 °C.
6. Снова промойте ячейки центрифугированием при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в 100 мкл фиксирующего буфера и инкубируйте в течение 20-25 мин в темноте при 4 °C.
7. Промойте ячейки еще раз, центрифугируя при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Добавьте 1 мл 1x пермеабилизационного буфера и промойте клетки 2 раза центрифугированием при 440 x g в течение 5 минут при 4 °C.
8. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в 100 мкл буфера для пермеабилизации и добавьте антитело (Mouse Anti-Duck IFN-γ, 1:10) к клеткам. После фиксации и мембранной пермеабилизации смесь клеток-антител инкубировать в течение 30 мин в темноте, периодически встряхивая во время инкубации при 4 °С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для пермеабилизации/промывки представляет собой 10-кратный исходный раствор и должен быть разбавлен PBS перед использованием.
9. Еще раз промойте ячейки 1 мл PBS, центрифугируя при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Добавьте 100 μл коктейля антител (PE-конъюгированный козий антимышиный IgG3, 1:250) и инкубируйте в течение 30 минут в темноте при 4°C.
10. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения FlowJo. Стратегия стробирования показана на рисунке 1.

Этот протокол был разработан на основе более раннего исследования по выявлению антиген-специфических эффекторных ответов Т-клеток у^уток20. Первый этап эксперимента включает в себя культивирование in vitro вирус-специфических Т-клеток, которые служат основой для последующих исследований эффекторного ответа. Первоначально АПК инкубировали и совместно культивировали с эффекторными клетками. Морфологические наблюдения показали, что после пролиферации клетки демонстрировали кластерный рост (рис. 2A). Мечение CFSE также подтвердило успешную пролиферацию, показав множественные пики деления клеток (рис. 2B). Наконец, мы использовали утиные специфические клеточные маркеры CD8/CD4 для оценки доли и абсолютного числа клеток²⁰, подтвердив успешное культивирование in vitro антиген-специфических Т-клеток (рисунок 2C).

На 7-й день культивирования мы собрали клетки и оценили экспрессию иммунородственных генов. Мы обнаружили, что пролиферирующие Т-клетки преимущественно экспрессируют цитотокс-ассоциированные гены, такие как Granzyme A и ИФН-γ^11,20 (рис. 3), что позволяет предположить, что они в первую очередь участвуют в цитотоксических реакциях. Для дальнейшего изучения этого эффекторного ответа мы разработали специфический для уток протокол окрашивания для количественного обнаружения секреции ИФН-γ утиными Т-клетками. Проточная цитометрия использовалась для фиксации, пермеабилизации и мечения CD8 Т-клеток из пролиферировавшей популяции антителом против ИФН-γ. Результаты показали значительную апрегуляцию доли клеток ИФН-γ⁺ в популяциях CD8^high+T и CD8^low+T после стимуляции антигеном (рис. 4), что указывает на устойчивый эффекторный ответ в CD8⁺ Т-клетках, генерируемый пролиферацией.

Рисунок 1: Стратегия гейтирования CD4⁺/CD8⁺Т-клеток. (A) Гейтинг и анализ процентного соотношения и фенотипа CD4⁺ Т-клеток между H5N1-стимулированными и нестимулированными клетками после 14 дней культивирования. (B) Гейтинг и анализ процентного соотношения и фенотипа CD8⁺ Т-клеток между H5N1-стимулированными и нестимулированными клетками после 14-дневного культивирования. Эта цифра была изменена с²⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Культура in vitro AIV-специфичных Т-клеток утки H5N1. (A) Морфологический анализ PBMC памяти со стимуляцией H5N1 AIV или без нее. Были проведены два независимых эксперимента с использованием двух разных доноров PBMC с утиной памятью. (B) Пролиферацию меченых CFSE PBMC памяти оценивали путем разведения CFSE в H5N1-стимулированных клетках инфицированных H5N1 уток после 2 недель культивирования. Красный образец представляет меченые CFSE PBMC памяти без стимуляции, в то время как желтый, зеленый и черный образцы представляют меченые CFSE PBMC памяти, стимулированные H5N1 после 7, 8 и 14 дней культивирования соответственно. (C) Процентное соотношение CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток было проанализировано между H5N1-стимулированными и нестимулированными клетками после 14 дней культивирования. Статистическую значимость определяли с помощью непарного t-критерия. (D) Количество CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток сравнивали между H5N1-стимулированными и нестимулированными клетками после 14 дней культивирования. Данные о процентном соотношении и количестве Т-клеток были получены в ходе двух независимых экспериментов с двумя повторами в каждом. Статистический анализ проводили с использованием непарного t-критерия ns p > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01. Эта цифра была изменена с²⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Обнаружение AIV-специфичного для H5N1 ответа утиных Т-клеток с помощью qRT-PCR. Данные были собраны из трех повторов в группе с H5N1 и группе без стимуляции соответственно. Результаты были представлены в виде средних ± СЭМ, а для статистического сравнения использовался парный t-критерий. *p < 0,05, **p < 0,01. Эта цифра была изменена с²⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Проточный цитометрический анализ экспрессии ИФН-γ в CD8⁺ Т-клетках из стимулированных PBMC уток. (A) Стратегия стробирования ИКС для стимулированной и контрольной групп. (B) Статистический анализ экспрессии ИФН-γ в клетках CD8^low+ и CD8^high+ из PBMC уток после стимуляции. Разница в экспрессии ИФН-γ между группами оценивалась с помощью t-критерия, а сравнения считались значимыми при p≤ 0,05. Эта цифра была изменена с²⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1: Стратегия стробирования, используемая для CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Этот протокол обеспечивает эффективный метод культивирования in vitro антиген-специфических Т-клеток уток, а также устанавливает протокол внутриклеточного окрашивания цитокинов для уток, который может быть использован для оценки эффекторных ответов Т-клеток. В настоящее время нет опубликованных отчетов о протоколах культивирования in vitro для Т-клеток уток. В первую очередь мы ссылались на протоколы для антиген-специфических Т-клеток человека, но стремимся оптимизировать условия инкубации для APC. Мы рассматриваем возможность дальнейшей оптимизации нашего протокола дифференциации.

В этом протоколе есть два важнейших шага, которые необходимы для его успеха. Во-первых, культура Т-клеток уток in vitro требует тщательной оптимизации условий стимуляции, включая дозу антигена, активацию APC и продолжительность культивирования, чтобы обеспечить достаточную экспансию Т-клеток и функциональное сохранение. Любое отклонение этих параметров может привести к неоптимальной активации или гибели клеток. Во-вторых, анализ ИКС является ключевым методом функциональной оценки экспрессии ИФН-γ. Успешный ИКС требует точного контроля времени стимуляции, этапов фиксации/пермеабилизации и специфичности антител. Оба этапа являются высокочувствительными и должны быть тщательно выполнены для достижения надежного и воспроизводимого обнаружения антиген-специфических Т-клеточных ответов.

Здесь мы использовали проточную цитометрию для обнаружения пролиферации клеток и кПЦР для изучения продукции знаковых цитокинов. Наиболее важным является то, что мы успешно экспрессировали и очистили гибридомную клеточную линию, продуцировавшую антитела к ИФН-γ у мышей, которые были использованы для детектирования экспрессии ИФН-γ, тем самым оценивая уровень эффекторного ответа Т-клеток. С некоторыми незначительными изменениями этот подход также может быть адаптирован для анализов пролиферации клеток у других видов, таких как куры.

Мы использовали набор для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) для выделения PBMC уток, потому что он эффективен и экономит время. Другие методы разделения, такие как метод разделения по методу Преколла^{, также могут} достичь цели выделения утиных PBMC с помощью различных этапов. Однако, по сравнению с набором, эти способы занимают больше времени.

Некоторые проблемы могут возникнуть во время выполнения этого протокола. Во-первых, пролиферация Т-клеток при вирусной стимуляции является в первую очередь ответом Т-клеток памяти 22,23,24. Чтобы обеспечить правильную пролиферацию Т-клеток, мы рекомендуем использовать уток через 4-10 недель после заражения. В настоящее время существуют различные методы выделения утиных PBMC, и эффективность выделения PBMC может варьироваться в зависимости от используемой разделительной среды. Рекомендуется использовать широко сертифицированную разделительную среду и извлекать как можно больше^{лимфоцитов25}.

Во-вторых, проточная цитометрия показала, что доля CD8⁺ Т и CD4⁺ Т-клеток в пролиферации составляет менее 15%, что может быть связано с тем, что Т-клетки, культивируемые в этом протоколе, в основном происходят из PBMC, в которых доля CD8⁺ T и CD4⁺ Т-клеток изначально низкая. Будущие эксперименты с использованием ткани селезенки могут дать более значимые результаты.

В-третьих, в процессе культивирования многие кластеры Т-клеток могут не образовываться, а некоторые клетки могут погибать во время дифференцировки Т-клеток. Этот феномен более выражен в нестимулированной контрольной группе. Эта проблема может быть связана с тем, что при культивировании Т-клеток нестимулированная группа не получает сигналов активации и костимуляции, что напрямую приводит к запрограммированной гибели клеток.

В-четвертых, мы создали гибридомную клеточную линию и успешно экспрессировали и очистили большое количество мышиных антител против ИФН-γ у уток. Используя эти антитела, мы разработали протокол внутриклеточного окрашивания цитокинов для выявления ИФН-γ уток. Затем мы проверили чувствительность антител с помощью иммуноферментного анализа и оптимизировали концентрацию окрашивания для проточной цитометрии, в конечном итоге определив оптимальную концентрацию 1:10 в паре с PE-Goat Anti-Mouse IgG3 в качестве вторичного антитела в разведении 1:250. Результаты эксперимента показали, что экспрессия ИФН-γ в группе стимуляции составила 2%-3%. Относительно низкая доля клеток, продуцирующих ИФН-γ, может быть связана с тем, что Т-клетки стимулировались только один раз. Одного раунда антигенной стимуляции может быть недостаточно для увеличения популяции антиген-специфических Т-клеток до определяемого уровня. Повторные раунды антигенной стимуляции могут обогатить антиген-специфичные Т-клетки и усилить их активацию, тем самым увеличивая долю ИФН-γ-положительных клеток. Кроме того, после всего лишь одной стимуляции популяция реагирующих Т-клеток, вероятно, все еще остается поликлональной. Путем повторной стимуляции и отбора может быть получена более клонально обогащенная популяция Т-клеток, которая, как правило, демонстрирует более высокие уровни продукции ИФН-γ ^26,27.

В заключение следует отметить, что в настоящем протоколе описан метод индуцирования пролиферации утиных антиген-специфических Т-клеток in vitro и установлен протокол внутриклеточного окрашивания для обнаружения ИФН-γ уток. Этот подход расширяет наше понимание иммунных реакций утиных Т-клеток, предлагает надежный инструмент для оценки реакций Т-клеток и способствует продвижению исследований в области вирусной иммунологии птиц.

Авторам нечего раскрывать.

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (32473060 и 32461120064) (MD и ML); Проект фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований в Гуанчжоу (2025A04J5445) (до MD); Молодые ученые Программы ученых реки Янцзы (2024, Манман Дай); и молодой стипендиат реки Пил из «Специального плана поддержки провинции Гуандун» (2024, Манман Дай). Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.