In vitro Coltura per cellule T di anatra specifiche per H5N1 e rilevamento delle risposte immunitarie utilizzando il metodo di colorazione delle citochine intracellulari

Il protocollo descrive un metodo per la coltura di cellule T aviarie in vitro isolando le cellule T di memoria da anatre infette, consentendo la generazione di cellule T specifiche di anatra altamente purificate. Inoltre, è stato stabilito un metodo di colorazione intracellulare delle citochine (ICS) per misurare con precisione la secrezione di IFN-γ nelle cellule T di anatra.

La coltura in vitro di cellule T è un metodo fondamentale per studiare le risposte immunitarie, le infezioni virali e le potenziali strategie terapeutiche. Tuttavia, fino ad oggi non sono stati riportati protocolli stabiliti per la coltura di cellule T aviarie in vitro . In questo studio, presentiamo per la prima volta un protocollo, utilizzando come modello il virus H5N1 dell'influenza aviaria ad alta patogenicità (HPAIV). Qui, le anatre di 4 settimane sono state infettate dal virus e i linfociti T di memoria sono stati isolati 28 giorni dopo l'infezione per coltivare linfociti T di anatra specifici per H5N1, consentendo lo studio della risposta immunitaria specifica al virus H5N1. Le fasi chiave del protocollo includono l'isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di memoria da anatre infette, l'attivazione di cellule presentanti l'antigene (APC) con una molteplicità ottimale di infezione (MOI = 5) per 6 ore e la preparazione di terreni di coltura di cellule T integrati con IL-2 ricombinante e altri additivi specifici. La proliferazione delle cellule T, la secrezione di citochine e l'attività citotossica sono state attentamente monitorate durante tutto il processo. Inoltre, abbiamo stabilito un protocollo di colorazione intracellulare delle citochine per quantificare la secrezione di IFN-γ nelle cellule T di anatra. Ciò ha comportato la generazione di una linea cellulare di ibridoma che esprime anticorpi IgG3κ specifici per l'IFN-γ di anatra, seguita da una purificazione degli anticorpi di successo. L'anticorpo purificato è stato diluito 1:10 e applicato in citometria a flusso per misurare con precisione la secrezione di IFN-γ. Questo metodo offre uno strumento affidabile per valutare le risposte delle cellule T di anatra e getta le basi per future indagini sull'immunologia virale aviaria.

Il processo di attivazione, proliferazione, differenziazione e conversione delle cellule T in cellule T di memoria è fondamentale per le risposte immunitarie antigene-specifiche¹. Inizialmente, le cellule T vengono attivate quando i loro recettori delle cellule T (TCR) riconoscono i peptidi antigenici presentati sulla superficie delle cellule presentanti l'antigene (APC) dalle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) ^2,3. Questo processo di attivazione richiede non solo il legame del TCR alle molecole MHC, ma anche il coordinamento dei segnali co-stimolatori, che sono cruciali per attivare completamente le funzioni delle cellule T⁴. Una volta attivate, le cellule T entrano rapidamente nella fase di proliferazione, generando numerosi cloni che condividono la stessa specificità antigenica della cellula T originale. Durante questa fase di proliferazione, le cellule T si differenziano ulteriormente in base alla loro funzione, principalmente in cellule T CD8⁺ e cellule T CD4^{+ 5}. Queste cellule differenziate mediano rispettivamente l'uccisione citotossica e assistono le risposte immunitarie. Dopo l'infezione iniziale, una parte delle cellule T attivate si trasforma in cellule T di memoria a lunga vita⁶. Queste cellule T di memoria possono persistere nel sistema immunitario per periodi prolungati, rispondendo rapidamente allo stesso agente patogeno in caso di riesposizione. Di conseguenza, generano una risposta immunitaria più forte ed efficiente, fornendo una protezione immunitaria a lungo termine per l'ospite⁷. L'intero processo è fondamentale per la progettazione di vaccini a cellule T, in quanto aiuta a migliorare l'efficacia e la durata del vaccino⁸.

In questo contesto, la coltivazione in vitro di cellule T antigene-specifiche diventa essenziale. Questo protocollo è stato sviluppato sulla base di metodi consolidati per la coltura in vitro di cellule T umane, con gli adattamenti necessari per il sistema immunitario aviario⁹. Facendo crescere queste cellule al di fuori del corpo, i ricercatori possono studiare la risposta delle cellule T in diversi stati immunitari, come l'attivazione, la proliferazione, la differenziazione e la formazione della memoria¹⁰. Questo approccio in vitro è prezioso per comprendere i ruoli che le cellule T svolgono nelle risposte immunitarie. Inoltre, in condizioni di coltura in vitro, la secrezione di citochine (come l'IFN-γ) da parte delle cellule T può essere monitorata^11,12. Questo monitoraggio è fondamentale per valutare la qualità, l'intensità e la persistenza delle risposte immunitarie, nonché per studiare le interazioni tra le cellule T e altre cellule immunitarie. Inoltre, l'espansione in vitro delle cellule T antigene-specifiche consente l'arricchimento su larga scala, aumenta la sensibilità di rilevamento e migliora la valutazione dei livelli di risposta delle cellule T¹³. Pertanto, la coltura in vitro di cellule T antigene-specifiche funge da potente strumento per comprendere meglio il ruolo delle cellule T di pollame nelle risposte immunitarie, aumentando la sensibilità di rilevamento e migliorando la valutazione dei livelli di risposta delle cellule T. Sebbene metodi simili in vitro siano stati ben consolidati nei sistemi dei mammiferi, l'applicazione di tali tecniche nelle specie avicole rimane limitata. Ciò è particolarmente rilevante nell'immunologia del pollame, dove gli strumenti per analizzare le risposte delle cellule T sono sottosviluppati. Le anatre, in particolare, fungono da serbatoi naturali per diversi virus dell'influenza aviaria, ma si sa poco sulla loro immunità antigene-specifica delle cellule T. Pertanto, lo sviluppo di un protocollo standardizzato di coltura di cellule T in vitro su misura per i sistemi aviari è essenziale per far progredire sia la ricerca di base che l'immunologia applicata nel pollame.

Una citochina chiave coinvolta in questi processi è l'IFN-γ, un interferone di tipo II prodotto principalmente dalle cellule T CD8⁺, dalle cellule T CD4⁺ di tipo 1 e dalle cellule NK¹⁴. L'IFN-γ svolge un ruolo cruciale nell'inibire la replicazione virale e nella regolazione delle risposte immunitarie¹⁵. Il livello di espressione dell'IFN-γ riflette lo stato immunitario e funge da marcatore per l'attivazione delle cellule T, consentendo ai ricercatori di valutare i livelli di risposta delle cellule T attraverso la sua espressione^16,17. Un metodo comune per rilevare l'espressione delle citochine nelle cellule immunitarie è la colorazione intracellulare con citochine (ICS)^18,19. Tuttavia, a causa delle limitazioni nei materiali e nelle tecniche sperimentali, la ricerca sulle anatre è rimasta indietro rispetto a quella sui mammiferi⁵. Attualmente, molti ricercatori si affidano alla qPCR per misurare i livelli di espressione dell'IFN-γ, sebbene questo metodo abbia alcune limitazioni¹¹. Nel nostro laboratorio, abbiamo sviluppato con successo un anticorpo per l'IFN-γ d'anatra compatibile con la citometria a flusso. Sulla base di questo successo, in questo studio, abbiamo stabilito un metodo ICS per rilevare l'espressione della proteina IFN-γ nelle cellule T di anatra, fornendo uno strumento affidabile per ulteriori studi sulle risposte delle cellule T di anatra.

Tutti gli esperimenti con tutti i virus dell'influenza aviaria A (H5N1) disponibili sono stati condotti in un laboratorio di biosicurezza animale di livello 3 e in una struttura per animali secondo i protocolli della South China Agricultural University (CNAS BL0011). Tutti i progetti di ricerca sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (codice identificativo 2021f154, 29 luglio 2021) della South China Agriculture University. Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo i regolamenti e le linee guida stabilite da questo comitato e gli standard internazionali per il benessere degli animali. Gli animali utilizzati in questo studio erano anatre domestiche di 4 settimane (Anas platyrhynchos domestica), comprendenti sia maschi che femmine, con peso corporeo compreso tra 500 e 600 g.

1. Isolamento delle PBMC di anatra e preparazione di una sospensione a cellula singola

1. Raccogliere 2 mL di sangue eparinizzato dalla vena giugulare di ogni anatra e trasferirli in provette contenenti EDTA per prevenire la coagulazione di ogni singola anatra
2. Diluire il sangue utilizzando il diluente campione fornito dal kit di isolamento dei linfociti o PBS. Mescolare delicatamente pipettando con una pipetta Pasteur. Il rapporto di diluizione abituale è 1:1 per il sangue rispetto al diluente.
3. Trasferire un volume uguale di soluzione di separazione dei linfociti in una provetta da centrifuga come il sangue diluito. Sovrapporre con cura la sospensione di sangue sopra la soluzione di separazione dei linfociti. Centrifugare la miscela a 400 x g, 25 °C per 15 min, impostando l'accelerazione di discesa su 1.
   NOTA: La quantità di soluzione per la separazione dei linfociti non deve essere inferiore a 4 ml. I componenti del kit di soluzione per la separazione dei linfociti sono riportati nella Tabella dei materiali.
4. Dopo la centrifugazione, osservare i quattro strati distinti nella provetta da centrifuga dall'alto verso il basso. Lo strato superiore è il diluente del campione, seguito dallo strato anulare di linfociti bianchi lattiginosi, quindi la soluzione di separazione e lo strato inferiore è costituito da globuli rossi.
5. Utilizzare con cautela una pipetta per raccogliere il secondo strato, lo strato anulare di linfociti bianchi lattiginosi, e trasferirlo in una nuova provetta da centrifuga. Aggiungere 10 mL di soluzione detergente da miscelare con le cellule.
6. Centrifugare il campione a 440 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante, quindi risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno RPMI 1640 per il conteggio delle cellule.
7. Facoltativo) Per purificare ulteriormente il campione, dopo la centrifugazione a 440 x g per 5 minuti, utilizzare un tampone di lisi dei globuli rossi per rimuovere eventuali cellule ematiche miste rimanenti.

2. Coltura in vitro di cellule T H5N1 AIV-specifiche

1. Acquista anatre domestiche sane di 2 settimane (Sheldrake) da un allevamento di anatre e ospitale in isolatori a pressione negativa. Confermare che le anatre siano negative per AIV utilizzando i saggi di inibizione dell'emoagglutinazione (HI) prima dell'esperimento. Infettare le anatre di 4 settimane con H5N1 AIV 1 x 10⁶, con una dose infettiva dell'uovo del 50% [EID50]/0,2 mL per via intranasale.
2. Isolare le PBMC di memoria da anatre infette da H5N1 28 giorni dopo l'infezione, seguendo il metodo descritto nella fase 1. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Diluire la sospensione cellulare in rapporto 1:1 con blu di tripano allo 0,08% e contare manualmente le cellule vitali (non colorate) al microscopio ottico.
   NOTA: Come supportato dal nostro studio²⁰ precedentemente pubblicato, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) isolate a 28 giorni dopo l'infezione sono considerate arricchite in cellule T di memoria. In questa fase, la fase effettrice si è attenuata e le popolazioni di cellule di memoria sono predominanti.
3. Impostare la concentrazione su 3 x 10⁶ cellule/mL, assicurandosi che 1 mL di terreno venga aggiunto a ciascun pozzetto della piastra a 48 pozzetti.
4. Co-infettare le PBMC isolate con il virus dell'influenza aviaria H5N1 (AIV) per fungere da APC. La dose virale è MOI = 5. Co-coltura delle PBMC con il virus per 1 ora a 37 °C. Agitare delicatamente con le mani ogni 15 minuti.
5. Dopo 1 ora di infezione, lavare le cellule 2 volte con PBS per rimuovere le particelle virali non legate. Risospendere le PBMC lavate in 1 mL di terreno di coltura per cellule T e incubare ulteriormente le cellule sospese a 37 °C per 5 ore.
6. Centrifugare le celle a 440 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, risospendere le cellule presentanti l'antigene (APC) incubate in 100 μL di terreno di coltura di cellule T e aggiungerle alle cellule effettrici. Il rapporto tra le cellule presentanti l'antigene e le cellule effettrici dovrebbe essere di 1:5.
7. Incubare le cellule in un'atmosfera di CO₂ al 5% a 37 °C per 14 giorni. Ogni 2 giorni, sostituire metà del surnatante della coltura cellulare con un terreno di coltura T fresco mediante pipettaggio accurato per garantire una distribuzione uniforme. Scartare metà del terreno contenente le cellule, quindi aggiungere un volume uguale di nuovo terreno.
8. Il giorno 7, osserva le cellule al microscopio ottico a 100x.
9. Utilizzare PBMC di memoria trattati con PBS come gruppo di controllo non stimolato.

3. Carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere (CFSE) per monitorare la proliferazione delle cellule T

1. Regolare la densità cellulare a 0,5-1 x 10⁷ cellule/mL e risospendere le cellule con 5 mL di PBS dopo la centrifugazione a 440 x g per 5 minuti.
2. Diluire 10 mM di stock a 1 μM di CFSE con 5 mL di PBS pre-raffreddato; operare al buio.
3. Inclinare le due provette da centrifuga a 45°, aggiungere la diluizione CFSE alla sospensione cellulare con una pipetta Pasteur, mescolare bene e porre a bagnomaria a 37 °C per 15 minuti al buio.
4. Lavare le celle diluendole in 10 volumi di PBS preraffreddato contenente il 5% di FBS, sedimentare mediante centrifugazione a 440 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Ripetere il lavaggio 2 volte.
5. Stimolare le cellule marcate con CFSE in vitro come da passaggio 2. Al termine del saggio di proliferazione, prelevare le cellule e analizzarle mediante citometria a flusso.

4. Analisi citofluorimetrica per la proliferazione delle cellule T CD8⁺ e CD4⁺

1. Dopo 7 giorni di coltura, raccogliere tutte le cellule da ciascun pozzetto e dividerle in due provette di flusso per l'analisi.
2. Trasferire le cellule in una nuova provetta da centrifuga, centrifugare a 440 x g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
3. Aggiungere 100 μL di cocktail di anticorpi (topo anti-anatra CD8, 1:50 o topo anti-anatra CD4, 1:50) e incubare le cellule per 30 minuti al buio a 4 °C.
4. Trasferire le cellule in una nuova provetta da centrifuga, centrifugare a 440 x g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
5. Aggiungere 100 μl di cocktail di anticorpi (FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgG2b, 1:50) e incubare le cellule per 30 minuti al buio a 4 °C.
6. Lavare le cellule una volta con 1 mL di PBS centrifugando a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Analizza i dati utilizzando il software FlowJo. La strategia di gating è mostrata nella Figura 1 supplementare.

5. Risposta delle cellule T mediante saggi di espressione genica mediante qPCR

1. Contare le cellule al termine della coltura con cellule T, raccoglierle in provette da centrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 400 x g per 5 minuti. Eliminare il surnatante con cura.
2. Estrazione dell'RNA
   NOTA: L'estrazione può essere eseguita in una cappa aspirante o in un banco ultra-pulito per prevenire la contaminazione dell'RNA.
   1. Lisi le cellule utilizzando il tampone di lisi fornito nel kit secondo le istruzioni del produttore. Trasferire il campione lisato alle colonne filtranti gDNA (pre-posizionate in provette di raccolta), centrifugare a 13.400 x g per 30 s, scartare le colonne e raccogliere il filtrato. Aggiungere 0,5 volume di etanolo assoluto al filtrato. Mescolare accuratamente.
      NOTA: Una soluzione torbida o un precipitato dopo l'aggiunta di etanolo è normale. Agitare e procedere al passaggio successivo.
   2. Trasferire la miscela in colonne di RNA, centrifugare a 13.400 x g per 30 s. Scartare il filtrato, aggiungere 700 μl di tampone RW1 e centrifugare nuovamente.
   3. Scartare il filtrato, aggiungere 700 μl di tampone RW2 (con etanolo assoluto) e centrifugare. Scartare il filtrato, aggiungere 500 μl di tampone RW2 (con etanolo assoluto) e centrifugare per 2 minuti. Rimuovere con cautela la colonna dal tubo per evitare la contaminazione del filtrato. Assicurarsi che tutte le soluzioni di risciacquo siano state rimosse per evitare interferenze nelle reazioni a valle.
   4. Trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta priva di RNasi, aggiungere 50-200 μL di ddH₂O privo di RNasi, lasciarla riposare a temperatura ambiente per 1 minuto, quindi centrifugare a 13.400 x g per 1 minuto per eluire l'RNA. Misura la purezza e la concentrazione dell'RNA.
      NOTA: Preriscaldare il ddH senza RNasi₂Ø a 65 °C per una maggiore resa ed eseguire una seconda eluizione se necessario.
3. Sintetizzare il cDNA seguendo le istruzioni del kit. Sintetizzare il filamento di cDNA secondo le istruzioni del produttore, aggiungendo 5 volte la quantità di trascrittasi inversa. Trascrivere al contrario a 37 °C per 15 minuti, quindi a 85 °C per 5 secondi e raffreddare a 4 °C.
4. Impostare la reazione PCR secondo il protocollo del produttore.
   1. In una provetta qPCR, combinare 10 μl di miscela enzimatica di reazione PCR 2x, 0,4 μl di primer 1, 0,4 μl di primer 2, 1 μl di stampo di cDNA e 8,2 μl di ddH₂O per ottenere una miscela da 20 μl.
   2. Eseguire la PCR nello strumento di PCR quantitativa in tempo reale con il seguente programma:
      Fase 1: 95 °C per 30 s, Rep x 1
      Stadio 2: 95 °C per 3 s, 60 °C per 30 s, Rep x 35
      Stadio 3: 95 °C per 15 s, 60 °C per 60 s, 95 °C per 15 s, Rep x 1

6. Colorazione intracellulare delle citochine (ICS)

NOTA: Questo protocollo è stato sviluppato per valutare la risposta effettrice delle cellule T CD8⁺ specifiche per H5N1 rilevando la secrezione intracellulare di IFN-γ nelle anatre.

1. Coltura di cellule T specifiche per H5N1 in vitro seguendo la procedura descritta nella fase 2. Raccogliere tutte le cellule (da ogni pozzetto) dopo 7 giorni dall'inizio della coltura.
2. Incubare le cellule presentanti l'antigene (APC) come descritto nel passaggio 2. Aggiungere le APC incubate e la Brefeldina A (1:1.000) alle cellule effettrici e co-incubare per 6 ore in un incubatore a 39 °C.
3. Trasferire le cellule in una nuova provetta da centrifuga, centrifugare a 440 x g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
4. Aggiungere 100 μL di cocktail di anticorpi (topo anti-anatra CD8, 1:50) alle cellule e incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.
5. Lavare le cellule centrifugando a 400 x g per 5 minuti a 4 °C e risospenderle in 1 mL di PBS. Aggiungere un cocktail di anticorpi (FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgG2b, 1:50) e incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.
6. Lavare nuovamente le celle centrifugando a 400 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante, risospendere le cellule in 100 μL di tampone di fissazione e incubare per 20-25 minuti al buio a 4 °C.
7. Lavare nuovamente le celle centrifugando a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Aggiungere 1 mL di tampone di permeabilizzazione 1x e lavare le cellule 2 volte mediante centrifugazione a 440 x g per 5 minuti a 4 °C.
8. Scartare il surnatante, risospendere le cellule in 100 μL di tampone di permeabilizzazione e aggiungere l'anticorpo (Mouse Anti-Duck IFN-γ, 1:10) alle cellule. Dopo la fissazione e la permeabilizzazione della membrana, incubare la miscela cellula-anticorpo per 30 minuti al buio, agitando di tanto in tanto durante l'incubazione a 4 °C.
   NOTA: La soluzione di permeabilizzazione/lavaggio è una soluzione madre 10x e deve essere diluita con PBS prima dell'uso.
9. Lavare nuovamente le cellule con 1 mL di PBS centrifugando a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Aggiungere 100 μL di cocktail di anticorpi (IgG3 di capra coniugata con PE, 1:250) e incubare per 30 minuti al buio a 4°C.
10. Analizza i dati utilizzando il software FlowJo. La strategia di gating è illustrata nella Figura 1.

Questo protocollo è stato sviluppato sulla base di uno studio precedente sul rilevamento delle risposte effettrici delle cellule T antigene-specifiche nelle anatre²⁰. La prima fase dell'esperimento prevede la coltura in vitro di cellule T virus-specifiche, che fungono da base per i successivi studi sulla risposta effettrice. Inizialmente, le APC sono state incubate e co-coltivate con cellule effettrici. Le osservazioni morfologiche hanno rivelato che dopo la proliferazione, le cellule mostravano una crescita a grappolo (Figura 2A). L'etichettatura CFSE ha ulteriormente confermato il successo della proliferazione mostrando picchi multipli di divisione cellulare (Figura 2B). Infine, abbiamo utilizzato i marcatori cellulari CD8/CD4 specifici per l'anatra per valutare la proporzione e il numero assoluto di cellule²⁰, confermando il successo della coltura in vitro di cellule T antigene-specifiche (Figura 2C).

Il giorno 7 della coltura, abbiamo raccolto le cellule e valutato l'espressione dei geni immuno-correlati. Abbiamo scoperto che le cellule T proliferanti esprimevano prevalentemente geni associati a citotossici come il granzima A e l'IFN-γ^11,20 (Figura 3), suggerendo che contribuiscono principalmente alle risposte citotossiche. Per studiare ulteriormente questa risposta effettrice, abbiamo stabilito un protocollo di colorazione specifico per l'anatra per rilevare quantitativamente la secrezione di IFN-γ da parte delle cellule T dell'anatra. La citometria a flusso è stata utilizzata per fissare, permeabilizzare e marcare le cellule T CD8 della popolazione proliferata con un anticorpo anti-IFN-γ. I risultati hanno mostrato una significativa sovraregolazione della percentuale di cellule IFN-γ⁺ in entrambe le popolazioni CD8^high+T e CD8^low+T dopo la stimolazione dell'antigene (Figura 4), indicando una robusta risposta effettrice nelle cellule T CD8⁺ generate dalla proliferazione.

Figura 1: Strategia di gating delle cellule T CD4⁺/CD8⁺. (A) Gating e analisi della percentuale e del fenotipo delle cellule T CD4⁺ tra le cellule stimolate con H5N1 e quelle non stimolate dopo 14 giorni di coltura. (B) Gating e analisi della percentuale e del fenotipo delle cellule T CD8⁺ tra cellule stimolate e non stimolate con H5N1 dopo 14 giorni di coltura. Questa cifra è stata modificata da²⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Coltura in vitro di cellule T di anatra H5N1 AIV-specifiche. (A) Analisi morfologica di PBMC di memoria con o senza stimolazione da parte di H5N1 AIV. Due esperimenti indipendenti sono stati condotti utilizzando due diversi donatori di PBMC con memoria di anatra. (B) La proliferazione di PBMC di memoria marcate con CFSE è stata valutata mediante diluizione di CFSE in cellule stimolate da H5N1 di anatre infettate da H5N1 dopo 2 settimane di coltura. Il campione rosso rappresenta le PBMC di memoria marcate con CFSE senza stimolazione, mentre i campioni gialli, verdi e neri rappresentano le PBMC di memoria marcate con CFSE stimolate con H5N1 dopo 7, 8 e 14 giorni di coltura, rispettivamente. (C) La percentuale di cellule T CD4⁺ e CD8⁺ è stata analizzata tra cellule stimolate con H5N1 e non stimolate dopo 14 giorni di coltura. La significatività statistica è stata determinata utilizzando un test t non appaiato. (D) Il numero di cellule T CD4⁺ e CD8⁺ è stato confrontato tra cellule stimolate con H5N1 e non stimolate dopo 14 giorni di coltura. I dati sulle percentuali e sui numeri delle cellule T sono stati ottenuti da due esperimenti indipendenti con due repliche ciascuno. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un test t non accoppiato ns p > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01. Questa cifra è stata modificata da²⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Rilevamento della risposta delle cellule T di anatra H5N1 AIV-specifiche mediante qRT-PCR. I dati sono stati raccolti da tre repliche rispettivamente nel gruppo stimolato con H5N1 e nel gruppo non stimolato. I risultati sono stati presentati come medie ± SEM e il test t accoppiato è stato utilizzato per il confronto statistico. *p < 0,05, **p < 0,01. Questa cifra è stata modificata da²⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi in citometria a flusso dell'espressione di IFN-γ in cellule T CD8⁺ da PBMC di anatra stimolate. (A) Strategia di gating ICS per il gruppo stimolato e il gruppo di controllo. (B) Analisi statistica dell'espressione dell'IFN-γ in cellule CD8^low+ e CD8^high+ da PBMC di anatra dopo stimolazione. La differenza nell'espressione dell'IFN-γ tra i gruppi è stata valutata mediante t-test e i confronti sono stati considerati significativi a p≤ 0,05. Questa cifra è stata modificata da²⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Strategia di gating utilizzata per le cellule T CD4⁺ e CD8⁺ . Clicca qui per scaricare questo file.

Questo protocollo fornisce un metodo efficiente per la coltura in vitro di cellule T antigene-specifiche di anatra e stabilisce anche un protocollo di colorazione intracellulare delle citochine per le anatre, che può essere utilizzato per valutare le risposte effettrici delle cellule T. Attualmente, non ci sono rapporti pubblicati sui protocolli di coltura in vitro per le cellule T di anatra. Abbiamo fatto riferimento principalmente ai protocolli per le cellule T umane antigene-specifiche, ma ci siamo impegnati a ottimizzare le condizioni di incubazione per le APC. Stiamo valutando un'ulteriore ottimizzazione del nostro protocollo di differenziazione.

Ci sono due passaggi critici in questo protocollo che sono essenziali per il suo successo. In primo luogo, la coltura in vitro di cellule T di anatra richiede un'attenta ottimizzazione delle condizioni di stimolazione, tra cui la dose dell'antigene, l'attivazione dell'APC e la durata della coltura, per garantire una sufficiente espansione delle cellule T e la conservazione funzionale. Qualsiasi deviazione di questi parametri può portare a un'attivazione non ottimale o alla morte cellulare. In secondo luogo, il saggio ICS è una tecnica chiave per valutare funzionalmente l'espressione dell'IFN-γ. Il successo dell'ICS richiede un controllo preciso del tempo di stimolazione, delle fasi di fissazione/permeabilizzazione e della specificità degli anticorpi. Entrambe le fasi sono altamente sensibili e devono essere eseguite con attenzione per ottenere un rilevamento affidabile e riproducibile delle risposte delle cellule T antigene-specifiche.

Qui, abbiamo utilizzato la citometria a flusso per rilevare la proliferazione cellulare e la qPCR per esaminare la produzione di citochine distintive. Soprattutto, abbiamo espresso e purificato con successo una linea cellulare di ibridoma che produce anticorpi anti-γ IFN-anatra di topo, che sono stati utilizzati per rilevare l'espressione di IFN-γ, valutando così il livello di risposta effettrice delle cellule T. Con alcune piccole modifiche, questo approccio potrebbe essere adattato anche per i saggi di proliferazione cellulare in altre specie, come i polli.

Abbiamo utilizzato un kit di isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) per isolare le PBMC di anatra perché il kit è efficace e fa risparmiare tempo. Altri metodi di separazione, come il metodo di separazione Precoll, possono anche^raggiungere l'obiettivo di isolare le PBMC di anatra attraverso diversi passaggi. Tuttavia, rispetto al kit, questi metodi richiedono più tempo.

Durante l'esecuzione di questo protocollo possono sorgere alcuni problemi. In primo luogo, la proliferazione delle cellule T in seguito alla stimolazione virale è principalmente una risposta delle cellule T di memoria 22,23,24. Per garantire una corretta proliferazione delle cellule T, si consiglia di utilizzare anatre che sono 4-10 settimane dopo l'infezione. Attualmente, sono disponibili vari metodi per isolare le PBMC di anatra e l'efficienza dell'isolamento delle PBMC può variare a seconda del mezzo di separazione utilizzato. Si consiglia di utilizzare un mezzo di separazione ampiamente certificato e di estrarre il maggior numero possibile di linfociti²⁵.

In secondo luogo, la citometria a flusso ha rilevato che la proporzione di cellule T CD8⁺ e CD4⁺ nella proliferazione era inferiore al 15%, il che potrebbe essere dovuto al fatto che le cellule T coltivate in questo protocollo provengono principalmente da PBMC, in cui la proporzione di cellule T CD8⁺ e cellule T CD4⁺ è intrinsecamente bassa. Esperimenti futuri con il tessuto della milza potrebbero produrre risultati più significativi.

In terzo luogo, durante il processo di coltura, molti cluster di cellule T potrebbero non formarsi e alcune cellule potrebbero morire durante la differenziazione delle cellule T. Questo fenomeno è più pronunciato nel gruppo di controllo non stimolato. Questo problema può essere dovuto al fatto che, durante la coltura delle cellule T, il gruppo non stimolato non riceve segnali di attivazione e co-stimolazione, portando direttamente alla morte cellulare programmata.

In quarto luogo, abbiamo costruito una linea cellulare di ibridoma e abbiamo espresso e purificato con successo una grande quantità di anticorpi anti-γ IFN- di topo. Utilizzando questi anticorpi, abbiamo sviluppato un protocollo di colorazione intracellulare delle citochine per rilevare l'IFN-γ d'anatra. Successivamente, abbiamo testato la sensibilità degli anticorpi utilizzando ELISA e ottimizzato la concentrazione di colorazione per la citometria a flusso, determinando infine che la concentrazione ottimale era 1:10, abbinata a PE-Goat Anti-Mouse IgG3 come anticorpo secondario a una diluizione di 1:250. I risultati sperimentali hanno mostrato che l'espressione di IFN-γ nel gruppo stimolato era del 2%-3%. La percentuale relativamente bassa di cellule produttrici di IFN-γ può essere attribuita al fatto che le cellule T sono state stimolate solo una volta. Un singolo ciclo di stimolazione antigenica potrebbe non essere sufficiente per espandere la popolazione di cellule T antigene-specifiche a un livello rilevabile. Cicli ripetuti di stimolazione dell'antigene possono arricchire le cellule T antigene-specifiche e migliorarne l'attivazione, aumentando così la percentuale di cellule γ IFN-positive. Inoltre, dopo una sola stimolazione, la popolazione di cellule T che rispondono è probabilmente ancora policlonale. Attraverso la stimolazione e la selezione ripetute, è possibile ottenere una popolazione di cellule T più arricchita clonalmente, che tende a mostrare livelli più elevati di produzione di IFN-γ^26,27.

In conclusione, l'attuale protocollo descrive un metodo per indurre la proliferazione di cellule T antigene-specifiche di anatra in vitro e stabilisce un protocollo di colorazione intracellulare per rilevare l'IFN-γ di anatra. Questo approccio migliora la nostra comprensione delle risposte immunitarie delle cellule T d'anatra, offre uno strumento affidabile per valutare le risposte delle cellule T e contribuisce a far progredire la ricerca nell'immunologia virale aviaria.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32473060 e 32461120064) (a MD e ML); Progetto di ricerca di base e applicata di Guangzhou (2025A04J5445) (a MD); il programma Young Scholars of the Yangtze River Scholar Professor (2024, Manman Dai); e il Young Peal River Scholar del "Guangdong Special Support Plan" (2024, Manman Dai). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.