Siyanobakteriyel Hücrelerden Proteinlerin Yüksek Otofloresan ile Phycoerythrin ve Phycourobilin ile İmmünositokimyasal Görselleştirilmesi

Bu protokol, fikoeritrin içeren siyanobakteri, Crocosphaera watsonii için hücresel düzeyde hücreler içindeki belirli bir proteinin görselleştirilmesini ve niceliklendirilmesini ana hatlarıyla belirtir.

Sunulan, oligotrofik okyanuslarda çok önemli bir birincil üretici ve nitrojen fiksatörü olan deniz siyanobakterisi Crocosphaera watsonii için hücrelerdeki belirli bir proteini hücresel düzeyde görselleştirmek ve ölçmek için bir protokoldür. Deniz ototrofik N₂ fiksatörleri (diazotroflar) için zorluklardan biri, probdan türetilen floresan sinyallerini otofloresanstan ayırt etmektir. C. watsonii , klorofil, fikoeritrin ve phycourobilin içeren siyanobakterileri temsil etmek üzere seçildi. Protokol, C. watsonii'deki proteinlerin tek hücre düzeyinde basit ve yarı kantitatif olarak görüntülenmesine izin vererek, hedef siyanobakterilerin metabolik aktivitelerini değerlendirmek için farklı çevresel koşullar altında protein üretiminin araştırılmasını sağlar. Ayrıca, fiksasyon ve geçirgenleştirme yöntemleri, hedef proteinlerden gelen floresan sinyallerini otofloresanstan, özellikle fikoeritrin ve fikurobilinden ayırt etmek için geliştirmek üzere optimize edilmiştir. Gelişmiş sinyal, konfokal veya geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir. Ek olarak, floresan yoğunluğu Fiji yazılımı kullanılarak yarı niceliksel olarak ölçüldü. Bu tek hücreli analiz iş akışı, spesifik protein içeriğinin hücreden hücreye varyasyonlarının değerlendirilmesine olanak tanır. Protokol, yalnızca standart ekipman gerektirdiğinden ve ayrıca diğer fikoeritrin içeren siyanobakteriyel hücrelere kolayca uyarlanabildiğinden herhangi bir yaşam bilimleri laboratuvarında gerçekleştirilebilir.

Siyanobakteriler de dahil olmak üzere mikroorganizmalar içindeki metabolik aktivitelerde hücreden hücreye fizyolojik varyasyon (genellikle "heterojenlik" olarak adlandırılır), klon kültürleri 1,2,3,4 üzerinde yapılan çalışmalarla belgelenmiştir. Bu heterojenlik, hücre bölünmesi⁵, karbon asimilasyonu ^6,7,8 ve nitrojen asimilasyonu ^9,10 gibi çeşitli metabolik aktiviteleri kapsar. Örneğin, son araştırmalar, kolonyal siyanobakteriler C. watsonii ve C. subtropica'daki (Cyanothece)_N2 fiksasyon aktivitesinin, hücre alt popülasyonlarında bulunurken, topluluk içindeki diğerlerinde bulunmayan, tek hücre düzeyinde değişkenlik gösterdiğini göstermiştir. Özellikle, nitrojen alımı veya_N2 fiksasyon aktiviteleri de in situ 11,12,13 hücreleri arasında değişkenlik gösterir. Bu bulgular, izotop oranı kütle spektrometreleri (NanoSIMS)^14,15 ile yapılan kararlı ¹⁵N izotop analizleriyle doğrulanmıştır. Bununla birlikte, NanoSIMS'in bireysel hücre düzeyinde izotopik bileşimi analiz etmek için yeni bir yol sunmasına rağmen, teknik karmaşıklığı ve maliyeti nedeniyle kullanımı kısıtlı kalmaktadır.

Metabolik aktivitelerde hücre içi heterojenliği gözlemlemek için alternatif bir yaklaşım, immün algılamadır. Daha önceki raporlar, tek tek hücrelerde nitrojenazın immüno-tespitini göstermiştir, ancak bu, fotosentetik pigmentleri ^16,17,18 tarafından yayılan otofloresan nedeniyle zorluklar doğurmaktadır. Deniz siyanobakterileri, özellikle büyük okyanus diazotrofları C. watsonii ve Trichodesmium gibi okyanus sularına adapte olanlar, daha kısa dalga boylarında otofloresan yayan önemli miktarda fikobilin içerir: fikoeritrin ve phycourobilin¹⁹. Bu otofloresansı atlatmak için, siyanobakteri çalışmaları ^16,20,21 için UV uyarımlı mavi yayan florokromlar tercih edilmiştir. Bununla birlikte, yalnızca birincil antikorlarla tedavi edilen hücreler, UV uyarımı^20,21 altında güçlü mavi ila mavimsi-sarı otofloresan yaydığından, bu strateji tutarlı bir şekilde başarı sağlamamıştır. Gözlemden önce hücreleri mavi veya UV ışığına maruz bırakarak ve yarı iletken nanokristaller kullanarak bu sorunu hafifletmek için çaba sarf edilmiştir²². Bu çalışma, düşük hücresel içerikli proteinleri görselleştirmek için tiramid sinyal amplifikasyon sistemini (TSA) kullanarak protein floresan sinyallerini geliştiren farklı bir strateji kullanmaktadır.

Katalizli raportör biriktirme (CARD) olarak da bilinen TSA, immünositokimyada düşük bolluktaki hedeflerin saptanmasını sağlayan oldukça hassas bir enzimatik yöntemdir. Bu teknik, yerinde ^23,24 hedef proteinlerin yakınında etiketli tiramidi kovalent olarak biriktirmek için peroksidazın katalitik aktivitesinden yararlanır. Hidrojen peroksit varlığında peroksidaz, tiramidin oksidatif yoğunlaşmasını reaktif tiramid radikallerine katalize eder ve bu daha sonra tirozin, fenilalanin ve triptofan²⁵ gibi elektron açısından zengin kısımlara bağlanır. Bu, standart yöntemlere kıyasla sinyalleri 10 ila 200 kata kadar artırır ve sinyali standart kromojenik veya floresan tekniklerle algılanabilir hale getirir. Sonuç olarak, bu teknik, heterojen popülasyonlarda ve nadir hücre alt kümelerinde fenotipik belirteçlerin yanı sıra çoklu proteinlerin hızlı ve eşzamanlı değerlendirmesini kolaylaştırır. Özellikle, şu an itibariyle, siyanobakteriler için immünoetiketleme ve TSA sistemlerinin birleştirilmesi, Cylindrospermopsis raciborskii^26'da saksitoksini görselleştiren tek bir çalışma ile sınırlı kalmıştır.

Burada özetlenen yöntem, tek hücre düzeyinde değişen çevresel koşullar altında protein üretiminin araştırılmasına izin vererek, hedef siyanobakterilerdeki metabolik aktivitelerin değerlendirilmesini sağlar. Tam hücre immünofloresan protein tespitinin mevcudiyeti, C. watsonii'deki proteinlerin tek hücre düzeyinde hızlı ve yarı kantitatif görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca, bu yöntem, phycourobilin ve phycoerythrin içeren diğer siyanobakteri hücreleri ile kullanım için kolayca uyarlanabilir.

1. Siyanobakteri yetiştiriciliği

1. Crocosphaera watsonii PS0609 hücrelerini Erlenmeyer şişelerinde veya fotobiyoreaktörlerde YBCII ortamı^27'de yetiştirin. Kültür yoğunluğunu belirlemek için, tercih edilen bir yöntem (örn. mikroskopi, akış sitometrisi, hücre sayacı, vb.) kullanarak hücre yoğunluğunu ölçün.
2. Hücre yoğunluklarını ~ 1 × 10^{4 ila} ~ 5 × 10⁶ hücre ^mL-1 arasında tutun.

2. Reaktiflerin hazırlanması

1. %100 metanolü -20 °C'de tutun.
2. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS): 1.36 g KH₂PO₄, 1.42 g Na₂HPO₄, 8.0 g NaCl ve 0.224 g KCl'yi 0.8 L damıtılmış suda çözün, 1 L'ye doldurun, pH'ı 7.4'e ayarlayın ve otoklavlayın (bkz.
3. PBS'de %1 paraformaldehit (PFA)
   1. Havalandırmalı bir davlumbazda bir karıştırma plakası üzerindeki bir cam behere 50 mL PBS ekleyin, 60 ° C'ye ısıtın ve karıştırıcı ile karıştırın.
   2. Isıtılmış PBS çözeltisine 0.5 g paraformaldehit tozu ekleyin. Çözelti şeffaf hale gelene kadar bir pipetten 1 N NaOH damlatarak pH'ı kademeli olarak yükseltin.Paraformaldehit tamamen çözüldükten sonra, sıcaklığı düşürün ve çözeltiyi filtrelemeye devam edin.
   3. PBS ile çözeltinin hacmini 40 mL'ye ayarlayın. Az miktarda seyreltik HCl ile pH'ı yaklaşık 6.9'a ayarlayın. Çözeltiyi -20 °C'de muhafaza edin.
4. PBG bloke edici çözelti (% 0.2 jelatin +% 0.5 sığır serum albümini; BSA, Malzeme Tablosuna bakınız)
   1. 0.2 g jelatin ve 0.5 g BSA'yı 200 mL'lik bir cam beherde 100 mL PBS'de çözün. Karışımı 60 °C'ye ısıtın ve karıştırın. Daha sonra 15 mL'lik bir tüpe koyun ve -20 °C'de saklayın.
5. PBS'de %0.2 Triton X-100: 10 mL PBS'ye 20 μL Triton X-100 ekleyin. 15 mL'lik bir tüpte hazırlayın ve -20 °C'de muhafaza edin.
6. 0,5 M EDTA: 1,46 g EDTA'yı 10 mL damıtılmış su (DW) içinde çözün ve pH'ı 8,0'a ayarlayın (EDTA pH < 8,0'da çözünmez). 15 mL'lik bir tüpte hazırlayın ve -20 °C'de muhafaza edin.
7. 1 M Tris HCl: 1.58 g Tris HCl'yi 10 mL DW'ye çözün ve pH'ı 8.0'a ayarlayın. 15 mL'lik bir tüpte hazırlayın ve -20 °C'de muhafaza edin.
8. 50 mM Tris HCl: 0.079 g Tris HCl'yi 10 mL DW'ye çözün ve pH'ı 7.0'a ayarlayın. 15 mL'lik bir tüpte hazırlayın ve -20 °C'de muhafaza edin.
9. 10 mg / mL lizozim ekleyin: 100 mg lizozim, 1 mL 0.5 M EDTA (pH 8) ve 1 mL 1 M Tris HCl (pH 8) ekleyin. 15 mL'lik bir tüpe 10 mL'ye kadar DW ekleyin. Kullanım gününde taze olarak hazırlayın.
10. 10.000 birim / mL akromopeptidaz: 0.011 g 900 birim / mg akropeptidazı ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 mL DW'ye çözün, iyice karıştırın ve -20 ° C'de koruyun.
11. 60 birim / mL akromopeptidaz çalışma çözeltisi: 0.5 mL 50 mM Tris HCl'ye 3 μL 10.000 birim / mL akromopeptidaz ekleyin. Kullanım gününde taze olarak hazırlayın.
12. 100x tiramid stok çözeltisi hazırlayın: Tiramid reaktifini 150 μL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün. 2-8 °C'de 6 aya kadar saklayın.
13. 1x Reaksiyon tamponu: 1 mL DW'ye 1 damla 20x Reaksiyon tamponu ekleyin. Bu, Tris tamponu, pH 7.4 ile değiştirilebilir.
14. Reaksiyon durdurma reaktif çözeltileri
    1. Reaksiyon durdurma reaktifi stok çözeltisi: Tiramid sinyal amplifikasyon kitinde bulunan bir şişe Reaksiyon durdurma reaktifine 1.45 mL %95 etanol ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). -20 °C'de 6 ay saklayın
    2. Reaksiyonu durduran reaktif çalışma çözeltisi: reaksiyonu durduran reaktif stok çözeltisini (1:11) PBS'de seyreltin. Kullanım gününde taze olarak hazırlayın.
15. 100x H₂O₂ çözeltisi: 1 mL DW'ye 1 damla (yaklaşık 50 μL) H₂O₂ ekleyin. Kullanım gününde taze olarak hazırlayın.
16. Tiramid çalışma çözeltisi (510 μL'lik nihai hacim için): Belirtilen sırayla 1,5 mL'lik tüpe 5 μL 100x tiramid stok çözeltisi, 5 μL 100x_H2O2çözeltisi ve 500 μL 1x Reaksiyon tamponu ekleyin ve pipetleyerek nazikçe iyice karıştırın. Kullanım gününde taze olarak hazırlayın.

3. Hasat hücreleri

1. 10 mL C. watsonii kültürünü 15 mL'lik bir tüpe hasat edin, hücreleri 8 dakika boyunca 4 ° C'de 5.500 × g'da santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın. Numuneleri prosedür arasında buz üzerinde tutun.
2. Peleti kalan süpernatan ile yeniden süspanse edin, yeniden süspanse edilmiş alt numuneyi 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve yıkamaya 1 mL PBS ekleyin. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın (5.500 × g, 4 °C, 5 dakika) ve süpernatanı atın.

4. Hücrelerin sabitlenmesi ve korunması

1. 1 mL% 1 PFA çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
2. Hücreleri 5.500 × g, 4 ° C, 5 dakikada santrifüjleyin, süpernatanı pipetle çıkarın ve atanan kimyasal atık kutusuna atın, 1 mL PBS ekleyin ve yeniden süspanse edin.
3. Hücreleri santrifüjleyin (5.500 × g, 4 °C, 5 dakika), süpernatanı pipetle çıkarın ve atın. 1 mL %100 metanol ekleyin (-20 °C'de tutulmuş) ve bir girdap karıştırıcı kullanarak yeniden süspanse edin. Alt numuneleri 15 dakika ila gece boyunca -20 °C'de tutun.

5. Geçirgenlik ve engelleme

1. Hücreleri santrifüjleyin (5.500 × g, 4 °C, 5 dakika), süpernatanı (metanol) pipetle çıkarın ve atanan kimyasal atık kutusuna atın, 1 mL PBS ekleyin ve yeniden süspanse edin.
2. Hücreleri santrifüjleyin (5.500 × g, 4 °C, 5 dakika), süpernatanı pipetle çıkarın ve atın, 1 mL% 0.2 Triton X-100 ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
3. Hücreleri santrifüjleyin (5.500 × g, 4 °C, 5 dakika), Triton X-100-süpernatanı pipetle çıkarın ve atın, 1 mL PBS ekleyin ve tekrar süspanse edin.
4. Hücreleri santrifüjleyin (5.500 × g, 4 °C, 5 dakika), süpernatanı bir pipet kullanarak çıkarın, 0.5 mL lizozim (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 0.5 mL PBG (adım 2.4) ekleyin ve 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
5. Hücreleri santrifüjleyin (5.500 × g, 4 ° C, 5 dakika), süpernatanı bir pipet kullanarak dikkatlice çıkarın ve atanmış bir atık kutusuna atın, 0.5 mL 60 birim akropeptidaz (adım 2.10) ve 0.5 mL PBG ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
6. Hücreleri santrifüjleyin (5.500 × g, 4 °C, 5 dakika), bir pipet kullanarak akromopeptidaz süpernatantını çıkarın, atanan atık kutusuna atın ve gerekli miktarda PBS ekleyin.
   NOT: Gerekli miktara, gözlemlenecek alt numune sayısına göre karar verilmelidir (bir alt numune, ~2 cm çapındaki daire için 90 μL'dir). Negatif kontrol(ler)i hazırladığınızdan emin olun; 1^st veya 2^nd antikoru olmadan ve 1^st antikoru olmadan.

6. Görüntüleme için numunelerin hazırlanması

1. Örnekleri bir cam slayt üzerine yerleştirin ve 1. antikor^28'i ekleyin.
   1. Sıvı itici bir kayar işaretleyici kalemle polilizin kaplı bir sürgülü cam üzerine yaklaşık ~2 cm çapında iki daire çizin (Malzeme Tablosuna bakın). Dairelere 90 μL alt numune uygulayın. Uygulanan alt numuneyi kimyasal bir başlıkta kurutun. Yaklaşık 30-60 dk sürer.
   2. Alt numuneyi yeniden sulandırın ve 90 μL PBS ile yıkayın, 2 dakika inkübe edin ve PBS'yi atın. Adımları 2 kez tekrarlayın.
   3. 1^{. antikoru 28} (1 mg mL-1) PBG bloke edici solüsyonda 200 kez seyreltin. Numune sayısına bağlı olarak çözelti miktarını ayarlayın.
      1. Negatif kontrol hariç her alt numuneye 90 μL primer (1^st) antikor²⁸ uygulayın. Damıtılmış suyla ıslak kağıt mendili bir hazneye koyun, bir kapakla kapatın ve aşılama bandı ile sarın. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
2. 2^{. antikoru} uygulayın.
   1. Cam sürgünün kağıt mendil üzerinde uzun tarafı üzerinde durmasına izin vererek 1^{. antikorun} fazlalığını çıkarın, hücreleri yukarı getirmek için çevirin ve bir pipet kullanarak her daireye% 0.2 Triton X-100 ekleyin ve hücreleri durulamak için 2 dakika inkübe edin. 5 kez tekrarlayın.
   2. Poli-at turp peroksidaz (HRP) konjuge ikincil (2^nd) antikoru (keçi, anti-tavşan IgG) nazikçe uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS ile 10 dakika boyunca nazikçe durulayın; 3 kez tekrarlayın.
3. Tiramid sinyal amplifikasyonu
   1. Numunelere 90 μL tiramid çalışma solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Cam sürgünün bir kağıt mendil üzerinde uzun kenarda durmasına izin vererek çözeltiyi atın. 90 μL reaksiyon durdurma reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. Çözümü atın.
      NOT: Kuluçka süresi, her hedef protein veya her mikroskop için test edilmelidir. Kuluçka süresi kısaltılabilir veya sinyalin aşırı doygunluğunu önlemek için konfokal bir mikroskop kullanarak protein tahsisini gözlemlemek için adım atlanabilir.
4. Hücreleri her 30 dakikada bir PBS ile (5 kez) durulayın. Hücreleri DW ile durulayın. Suyu hızlı bir şekilde çıkarın. Bir damla montaj ortamı ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve kapak camını yerleştirin.
5. Fazla montaj ortamını çıkarmak için kapak camına hafifçe bastırın ve yaklaşık 30 dakika kurumasını bekleyin. Şeffaf oje ile kapatın ve karanlıkta saklayın.

7. Floresan mikroskobu kullanılarak floresan sinyalinin tespiti

1. Floresan mikroskobunu, bilgisayarı ve UV ışık kaynağını açın. Mikroskoba bağlı kamera için yazılımı açın (bkz. Malzeme Tablosu). Canlı görüntüleri izlemek için ayarlayın. Odadaki ışığı kapatın.
   1. Hücreleri içeren cam slaytı numune aşamasına yerleştirin. En küçük büyütme oranına sahip lensi kullanın ve odakta ince ayar yapmak için objektif ve kondansatör lensi ayarlayın. Lensi tek tek daha büyük büyütme oranlarına değiştirin.
   2. Kapak camının üzerine daldırma yağı sürün ve lensi yağa daldırma 100x lens ile değiştirin. Işık kaynağından gelen ışık kaynağını kapatın, Tyramide-350 analizi için DAPI filtre setini seçin ve uyarma UV ışık deklanşörünü açın.
   3. 3-4 pozlama süresini test edin ve aşırı doygunluk olmadan en iyi pozlama süresine karar verin. Fikoeritrin gözlemi için FITC filtre setini seçin, prosedürü tekrarlayın ve en iyi maruz kalma süresine karar verin. Prosedürü hızlandırmak ve fototoksisite nedeniyle sinyal bozulmasını azaltmak için kamerada artırılmış bir kazanç veya gruplama modu kullanmayı düşünün. Görüntü alımı için kazanç ve gruplama modunu eski haline getirin.
2. Görüş alanını seçin, parlak bir alan görüntüsü, tiramid görüntüsü ve her görüntü için seçilen pozlama süresiyle fikoeritrin görüntüsü için bir anlık görüntü alın.

8. Konfokal mikroskop altında algılama

1. Konfokal mikroskobu ve bilgisayarı açın ve mikroskopi yazılımını başlatın. Lazeri 60 dakika ısıtın. Odadaki ışığı kapatın. Hücreleri içeren cam slaytı, bir objektif lens üzerine daldırma yağı kullanarak numune aşamasına yerleştirin.
2. 405 nm lazeri seçin ve uzun ışın ayırıcıları (MBS) 405 olarak ayarlayın. Lazer gücünü %0,5'e ayarlayın. 0,03 μm piksel boyutu elde etmek için ölçüm parametrelerini ayarlayın, 10 yakınlaştırın (görüntü boyutu 512 x 512 piksel). Piksel bekleme süresini 0,02 ms olarak ayarlayın, bu da toplam tarama süresini 5,06 s olarak verir.
3. GaAsP spektral dedektöründe dedektör aralığını 410 nm ila 695 nm arasında ayarlayın ve 9 nm'lik bir spektral çözünürlük sağlayın. Optimum kazancı ayarlayın (800-900). Lambda taramasını başlatın.
   NOT: Her mikroskop için optimum kazanç optimize edilmelidir.

9. Fiji kullanarak sinyalin yoğunluğunu ölçün

1. DAPI filtresi ile çekilen görüntüyü floresan mikroskobu altında açın. Parlak alan görüntüsündeki hücreleri seçin ve ilgilenilen bölgeyi (ROI) tanımlayın. Tüm hücreler için YG'yi tanımladıktan sonra, YG'yi kaydedin.
2. Parlak alan görüntüsünü kapatın ve floresan görüntüyü açın. Tyramide-350 sinyalini çıkarmak için RGB görüntüsünü kırmızı, mavi ve yeşil olarak ayırın.
3. Parlak alan görüntüsü tarafından hazırlanan ROI'yi mavi görüntüye uygulayın ve sinyalin yoğunluğunu^{ölçün 29}. Sonuçları kaydedin.

Floresan sinyali, 1^{. antikorun} kullanılmadığı negatif kontrolde hücre dışı maddelerden gözlendi (Şekil 1A-C). Rubisco proteininin (RbcL) büyük alt birimine konjuge edilen tiramid takviyeli reaktifin floresan sinyali, UV uyarımlı bir DAPI filtresi kullanılarak bir floresan mikroskobu altında C. watsonii'de başarıyla tespit edildi (Şekil 1D-F...

Siyanobakteriler için TSA sistemi, spesifik rRNA'yı hedefleyen TSA-floresan in situ hibridizasyonda (TSA-FISH, CARD-FISH) yaygın kullanım bulmuştur. Bununla birlikte, proteinler için uygulaması sınırlı kalmaktadır²⁶. Bu çalışmada,_{N2-sabitleyici} siyanobakteri C. watsonii'nin tüm hücre immüno-tespitini sağlamak için, önceki bir referans^20'ye dayalı modifikasyonları içeren bir TSA prosedürü...

Bu çalışmayla ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını onaylıyoruz.

Konfokal mikroskobik analiz konusundaki yardımları için Dr. Radek Kana ve Barbora Šedivá'ya ve immünodetection ve floresan mikroskobu analizi konusundaki tavsiyeleri için Dr. Roman Sobotka ve Dr. Kateřina Bišová'ya teşekkür ederiz. Bu araştırma, Çek Araştırma Vakfı GAČR (proje 20-17627S to OP ve TM), JSPS ve Çek Bilimler Akademisi (JPJSBP 120222502) arasındaki Mobility plus projesi ve JSPS KAKENHI (proje 23H02301) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.