Иммуноцитохимическая визуализация белков из клеток цианобактерий с высокой аутофлуоресценцией фикоэритрина и фикурубилина

Этот протокол описывает визуализацию и количественную оценку определенного белка в клетках на клеточном уровне для цианобактерии, содержащей фикоэритрин, Crocosphaera watsonii.

Представлен протокол визуализации и количественного определения специфического белка в клетках на клеточном уровне для морской цианобактерии Crocosphaera watsonii, важнейшей первичной продуценты и фиксатора азота в олиготрофных океанах. Одной из проблем для морских автотрофных фиксаторов N₂ (диазотрофов) является различение сигналов флуоресценции, полученных от зондов, от автофлуоресценции. C. watsonii был выбран для представления хлорофилл-, фикоэритрин- и фикуробилин-содержащих цианобактерий. Протокол позволяет проводить простую и полуколичественную визуализацию белков C. watsonii на уровне одной клетки, что позволяет исследовать производство белка в различных условиях окружающей среды для оценки метаболической активности целевых цианобактерий. Кроме того, методы фиксации и пермеабилизации оптимизированы для усиления сигналов флуоресценции от белков-мишеней, чтобы отличить их от автофлуоресценции, особенно от фикоэритрина и фикурубилина. Усиленный сигнал может быть визуализирован с помощью конфокальной или широкопольной флуоресцентной микроскопии. Кроме того, интенсивность флуоресценции была полуколичественно определена с помощью программного обеспечения Фиджи. Этот рабочий процесс анализа отдельных клеток позволяет оценить межклеточные вариации содержания определенного белка. Протокол может быть выполнен в любой медико-биологической лаборатории, так как для него требуется только стандартное оборудование, а также он может быть легко адаптирован к другим фикоэритрин-содержащим клеткам цианобактерий.

Физиологические вариации от клетки к клетке (обычно называемые «гетерогенностью») метаболической активности микроорганизмов, включая цианобактерии, были задокументированы в исследованиях клонированных культур 1,2,3,4. Эта гетерогенность охватывает различные метаболические активности, такие как деление клеток⁵, ассимиляция углерода ^6,7,8 и усвоение азота ^9,10. Например, недавние исследования показали, что активность фиксации_N2 у колониальных цианобактерий C. watsonii и C. subtropica (Cyanothece) проявляет изменчивость на уровне отдельных клеток, присутствуя в субпопуляциях клеток и отсутствуя в других в сообществе. Примечательно, что поглощение азота или активность фиксации_N2 также демонстрируют вариабельность среди клеток in situ 11,12,13. Эти результаты были подтверждены анализами стабильных ^{изотопов 15}N, проведенными с помощью масс-спектрометров изотопных отношений (NanoSIMS)^14,15. Однако, несмотря на то, что NanoSIMS предлагает новый способ анализа изотопного состава на уровне отдельных клеток, его использование остается ограниченным из-за его технической сложности и стоимости.

Альтернативным подходом к наблюдению внутриклеточной гетерогенности метаболической активности является иммунодетекция. Более ранние отчеты продемонстрировали иммунообнаружение нитрогеназы в отдельных клетках, но это создает проблемы из-за автофлуоресценции, испускаемой их фотосинтетическими пигментами 16,17,18. Морские цианобактерии, особенно приспособленные к океаническим водам, такие как основные океанические диазотрофы C. watsonii и Trichodesmium, содержат значительное количество фикобилинов, которые излучают автофлуоресценцию в более коротких волнах: фикоэритрин и фикуробилин¹⁹. Чтобы обойти эту автофлуоресценцию, для исследований цианобактерий предпочтение отдавалось флюорохромам, излучающим синий цвет, с возбуждением ультрафиолетом 16,20,21. Тем не менее, эта стратегия не всегда приносила успех, так как клетки, обработанные исключительно первичными антителами, излучали сильную синюю или голубовато-желтую автофлуоресценцию под воздействием ультрафиолета^20,21. Были предприняты усилия по смягчению этой проблемы путем воздействия на клетки синего или ультрафиолетового света перед наблюдением и использования полупроводниковых^{нанокристаллов22}. В настоящем исследовании используется другая стратегия, которая усиливает сигналы флуоресценции белков с использованием системы усиления сигнала тирамида (TSA) для визуализации белков с низким содержанием клеток.

TSA, также известный как катализированное репортерное осаждение (CARD), является высокочувствительным ферментативным методом, позволяющим обнаруживать мишени с низким содержанием в иммуноцитохимии. Этот метод использует каталитическую активность пероксидазы для ковалентного осаждения меченого тирамида в непосредственной близости от целевых белков in situ ^23,24. В присутствии перекиси водорода пероксидаза катализирует окислительную конденсацию тирамида в реакционноспособные радикалы тирамида, которые затем связываются с богатыми электронами фрагментами, такими как тирозин, фенилаланин и триптофан²⁵. Это усиливает сигнал до 10-200 раз по сравнению со стандартными методами, что делает сигнал обнаруживаемым с помощью стандартных хромогенных или флуоресцентных методов. Следовательно, этот метод способствует быстрой и одновременной оценке нескольких белков наряду с фенотипическими маркерами в гетерогенных популяциях и редких подмножествах клеток. Примечательно, что на данный момент объединение систем иммуномаркировки и TSA для цианобактерий ограничено одним исследованием, в котором визуализировался сакситоксин у Cylindrospermopsis raciborskii²⁶.

Описанный здесь метод позволяет исследовать продукцию белка в различных условиях окружающей среды на уровне отдельных клеток, что позволяет оценить метаболическую активность в целевых цианобактериях. Доступность цельноклеточного иммунофлуоресцентного обнаружения белка позволяет быстро и полуколичественно визуализировать белки C. watsonii на уровне отдельных клеток. Более того, этот метод может быть легко адаптирован для использования с другими клетками цианобактерий, содержащими фикурубилин и фикоэритрин.

1. Культивирование цианобактерий

1. Культивируйте клетки Crocosphaera watsonii PS0609 в колбах Эрленмейера или фотобиореакторах в среде YBCII²⁷. Чтобы определить плотность культуры, измерьте плотность клеток с помощью выбранного метода (например, микроскопия, проточная цитометрия, счетчик клеток и т. д.).
2. Поддерживайте плотность клеток в диапазоне от ~1 × 10⁴ до ~5 × 10⁶ клеток ^мл-1.

2. Приготовление реагентов

1. Хранить 100% метанол при температуре -20 °C.
2. Фосфатно-солевой буфер (PBS): Растворите 1,36 г KH₂PO₄, 1,42 г Na₂HPO₄, 8,0 г NaCl и 0,224 г KCl в 0,8 л дистиллированной воды, заполните до 1 л, отрегулируйте pH на уровне 7,4 и автоклавируйте (см. Таблицу материалов).
3. 1% параформальдегида (PFA) в PBS
   1. Добавьте 50 мл PBS в стеклянный стакан на перемешивающей плите в вентилируемой вытяжке, нагрейте его до 60 °C и перемешайте с помощью мешалки.
   2. В подогретый раствор PBS введите 0,5 г порошка параформальдегида. Постепенно повышайте pH, подавая 1 N NaOH из пипетки до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.После того как параформальдегид полностью растворится, понизьте температуру и приступайте к фильтрации раствора.
   3. Отрегулируйте объем раствора до 40 мл с помощью PBS. Отрегулируйте pH с помощью небольшого количества разбавленного HCl примерно до 6,9. Хранить раствор при температуре -20 °C.
4. Блокирующий раствор ПБГ (0,2% желатин + 0,5% бычий сывороточный альбумин; BSA, см. Таблицу материалов)
   1. Растворите 0,2 г желатина и 0,5 г BSA в 100 мл PBS в стеклянной мензуре объемом 200 мл. Нагрейте смесь до 60 °C и перемешайте. Затем переложите его в пробирку объемом 15 мл и храните при температуре -20 °C.
5. 0,2% Triton X-100 в PBS: добавьте 20 мкл Triton X-100 в 10 мл PBS. Приготовьте его в пробирке объемом 15 мл и сохраните при температуре -20 °C.
6. 0,5 М ЭДТА: Растворите 1,46 г ЭДТА в 10 мл дистиллированной воды (DW) и отрегулируйте pH до 8,0 (ЭДТА не растворится при pH < 8,0). Приготовьте его в пробирке объемом 15 мл и сохраните при температуре -20 °C.
7. 1 M Tris HCl: Растворите 1,58 г Tris HCl в 10 мл DW и отрегулируйте pH до 8,0. Приготовьте его в пробирке объемом 15 мл и сохраните при температуре -20 °C.
8. 50 мМ Tris HCl: Растворите 0,079 г Tris HCl в 10 мл DW и отрегулируйте pH до 7,0. Приготовьте его в пробирке объемом 15 мл и сохраните при температуре -20 °C.
9. Добавьте 10 мг/мл лизоцима: добавьте 100 мг лизоцима, 1 мл 0,5 M EDTA (pH 8) и 1 мл 1 M Tris HCl (pH 8). Добавьте DW до 10 мл в пробирку объемом 15 мл. Приготовьте его свежим в день использования.
10. 10 000 ЕД/мл ахромопептидазы: Растворите 0,011 г 900 ЕД/мг ахромопептидазы (см. Таблицу материалов) до 1 мл DW, хорошо перемешайте и сохраните при -20 °C.
11. Рабочий раствор ахромопептидазы 60 ЕД/мл: Добавьте 3 мкл 10 000 ЕД/мл ахромопептидазы в 0,5 мл 50 мМ Tris HCl. Приготовьте его свежим в день использования.
12. Приготовьте 100-кратный стоковый раствор тирамида: растворите реагент тирамида в 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Хранить при температуре 2-8 °C до 6 месяцев.
13. 1x Реакционный буфер: Добавьте 1 каплю 20x Реакционного буфера в 1 мл DW. Его можно заменить на буфер Tris, pH 7,4.
14. Реагентные растворы для остановки реакции
    1. Исходный раствор реагента Reaction stop: Добавьте 1,45 мл 95% этанола в один флакон реагента Reaction stop, содержащегося в наборе для усиления сигнала тирамида (см. Таблицу материалов). Хранить при температуре -20 °C в течение 6 месяцев
    2. Рабочий раствор реагента остановки реакции: развести стоковый раствор реагента (1:11) в PBS. Приготовьте его свежим в день использования.
15. 100x H₂O₂ раствор: Добавьте 1 каплю (около 50 мкл) H₂O₂ в 1 мл DW. Приготовьте его свежим в день использования.
16. Рабочий раствор тирамида (для конечного объема 510 мкл): Добавьте 5 мкл 100-кратного стокового раствора тирамида, 5 μЛ 100-кратного раствора H₂O₂ и 500 μЛ 1x Реакционного буфера в 1,5 мл пробирки в указанном порядке и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования. Приготовьте его свежим в день использования.

3. Сборочные клетки

1. Соберите 10 мл культуры C. watsonii в пробирку объемом 15 мл, соберите клетки центрифугированием при 5500 × г при 4 °C в течение 8 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Держите образцы на льду между процедурами.
2. Повторно суспендируйте гранулу с оставшимся надосадочным веществом, переложите ресуспендированный подобразец в пробирку объемом 1,5 мл и добавьте в промывку 1 мл PBS. Соберите клетки центрифугированием (5 500 × г, 4 °C, 5 мин) и выбросьте надосадочную жидкость.

4. Фиксация и консервация клеток

1. Добавьте 1 мл 1% раствора PFA и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
2. Центрифугируйте клетки при 5 500 × г, 4 °C, 5 минут, удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и выбросьте ее в предназначенный контейнер для химических отходов, добавьте 1 мл PBS и снова суспендируйте его.
3. Центрифугируйте клетки (5 500 × г, 4 °C, 5 мин), удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и выбросьте ее. Добавьте 1 мл 100% метанола (при температуре -20 °C) и повторно суспендируйте с помощью вихревого смесителя. Подобразцы выдерживают при температуре -20 °C от 15 минут до ночи.

5. Пермеабилизация и блокировка

1. Центрифугируйте клетки (5 500 × г, 4 °C, 5 мин), удалите надосадочную жидкость (метанол) с помощью пипетки и выбросьте ее в предназначенный для этого контейнер для химических отходов, добавьте 1 мл PBS и снова суспендируйте.
2. Центрифугируйте клетки (5 500 × г, 4 °C, 5 мин), удалите надосадочную жидкость пипеткой и выбросьте ее, добавьте 1 мл 0,2% Triton X-100 и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
3. Центрифугируйте клетки (5 500 × г, 4 °C, 5 мин), удалите надосадочную жидкость Triton X-100 пипеткой и выбросьте ее, добавьте 1 мл PBS и снова суспендируйте.
4. Центрифугируйте клетки (5 500 × г, 4 °C, 5 мин), удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки, добавьте 0,5 мл лизоцима (см. Таблицу материалов) и 0,5 мл PBG (шаг 2,4) и инкубируйте в течение 3 ч при 37 °C.
5. Центрифугируйте клетки (5 500 × г, 4 °C, 5 мин), осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и выбросьте ее в предназначенный для этого мусорный бак, добавьте 0,5 мл 60 единиц ахромопептидазы (шаг 2,10) и 0,5 мл PBG и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.
6. Центрифугируйте клетки (5 500 × г, 4 °C, 5 мин), удалите надосадочную жидкость из ахромопептидазы с помощью пипетки, выбросьте ее в предназначенный для этого мусорный бак и добавьте необходимое количество PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимое количество должно определяться количеством подобразцов, которые необходимо исследовать (один подобразец составляет 90 мкл для круга диаметром ~2 см). Убедитесь, что вы подготовили отрицательный контроль; без^1-го и^2-го антитела, а также без^1-го антитела.

6. Подготовка образцов к визуализации

1. Поместите образцы на предметное стекло и добавьте 1-е антитело²⁸.
   1. Нарисуйте два круга диаметром около ~2 см на стекле с полилизиновым покрытием с помощью жидкоотталкивающего маркера для слайдов (см. Таблицу материалов). Нанесите на круги 90 мкл подобразцов. Высушите нанесенный подобразец в химическом колпаке. Время в пути около 30-60 минут.
   2. Регидратируйте подобразец и промойте его 90 мкл PBS, инкубируйте в течение 2 минут и выбросьте PBS. Повторите эти действия 2 раза.
   3. Разведите^1-е антитело²⁸ (1 мг ^мл-1) в 200 раз в блокирующем растворе ПБГ. Регулируйте количество раствора в зависимости от количества образцов.
      1. Нанесите 90 мкл первичного (1^ст) антитела²⁸ на каждый подобразец, кроме отрицательного контроля. Положите в камеру отстоянную влажную от воды папиросную бумагу, закройте ее крышкой, и обмотайте прививочной лентой. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C.
2. Применяют^2-е антитело.
   1. Удалите избыток^1-го антитела, позволив предметному стеклу постоять своей длинной стороной на папиросной бумаге, переверните его, чтобы поднять клетки вверх, и добавьте 0,2% Triton X-100 в каждый круг с помощью пипетки и инкубируйте 2 мин для промывания клеток. Повторите 5 раз.
   2. Аккуратно нанесите конъюгированное вторичное (^2-е) антитело к пероксидазе поли-хренской редьки (HRP) (козье, антикроличье IgG) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 60 минут при комнатной температуре. Аккуратно промойте клетки PBS в течение 10 минут; Повторите 3 раза.
3. Усиление тирамидного сигнала
   1. Добавьте 90 μл рабочего раствора тирамида в образцы и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Выбросьте раствор, позволив предметному стеклу встать на длинную сторону папиросной бумаги. Добавьте 90 μл реагента, остановившего реакцию, и инкубируйте в течение 3 минут при комнатной температуре. Выбросьте раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации следует проверять для каждого целевого белка или для каждого микроскопа. Время инкубации может быть сокращено или опущено, чтобы наблюдать за распределением белка с помощью конфокального микроскопа, чтобы избежать перенасыщения сигнала.
4. Промывайте клетки PBS (5 раз) каждые 30 минут. Промойте клетки DW. Быстро удалите воду. Добавьте одну каплю монтажного носителя (см. Таблицу материалов) и установите покровное стекло.
5. Осторожно нажмите на покровное стекло, чтобы удалить излишки монтажного материала, и дайте ему высохнуть около 30 минут. Заклейте его прозрачным лаком для ногтей и храните в темноте.

7. Детектирование флуоресцентного сигнала с помощью флуоресцентного микроскопа

1. Питание от флуоресцентного микроскопа, компьютера и источника ультрафиолетового излучения. Откройте программное обеспечение для камеры, подключенной к микроскопу (см. Таблицу материалов). Настроен на мониторинг изображения в реальном времени. Выключите свет в комнате.
   1. Вставьте предметное стекло с клетками в предметный столик для образца. Используйте объектив с наименьшим увеличением и отрегулируйте объектив и конденсорную линзу для точной настройки фокусировки. Меняйте объектив на большее увеличение одно за другим.
   2. Нанесите погружное масло на верхнюю часть покровного стекла и замените линзу на масляную иммерсионную линзу 100x. Закройте источник света от источника света, выберите набор фильтров DAPI для анализа тирамида-350 и откройте возбуждающую УФ-световую заслонку.
   3. Протестируйте 3-4 времени экспозиции и определите наилучшее время экспозиции без перенасыщения. Выберите набор фильтров FITC для наблюдения за фикоэритрином, повторите процедуру и определите наилучшее время воздействия. Рассмотрите возможность использования режима повышенного усиления или биннинга на камере, чтобы ускорить процедуру и смягчить ухудшение сигнала из-за фототоксичности. Установите режим усиления и биннинга обратно для получения изображения.
2. Выберите поле зрения, сделайте снимок для изображения яркого поля, изображения тирамида и изображения фикоэритрина с выбранным временем экспозиции для каждого изображения.

8. Детектирование под конфокальным микроскопом

1. Включите конфокальный микроскоп и компьютер и запустите программное обеспечение для микроскопии. Нагревайте лазер в течение 60 минут. Выключите свет в комнате. Поместите предметное стекло с клетками на предметный столик с помощью иммерсионного масла на линзу объектива.
2. Выберите лазер с длиной волны 405 нм и установите главные светоделители (MBS) 405. Установите мощность лазера на 0,5%. Задайте параметры измерения для получения размера пикселя 0,03 мкм, зум 10 (размер изображения 512 х 512 пикселей). Установите время задержки пикселей равным 0,02 мс, что дает общее время сканирования как 5,06 с.
3. Установите диапазон детектора от 410 нм до 695 нм на спектральном детекторе GaAsP, обеспечив спектральное разрешение 9 нм. Установите оптимальное усиление (800-900). Запустите лямбда-сканирование.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное усиление должно быть оптимизировано для каждого микроскопа.

9. Количественно оцените интенсивность сигнала с помощью Фиджи

1. Откройте изображение, полученное с помощью фильтра DAPI, под флуоресцентным микроскопом. Выделите ячейки на изображении яркого поля и определите область интереса (ROI). После определения ROI для всех ячеек сохраните ROI.
2. Закройте изображение светлого поля и откройте флуоресцентное изображение. Разделите RGB-изображение на красный, синий и зеленый, чтобы извлечь сигнал Tyramide-350.
3. Примените ROI, подготовленное по яркому полю, к синему изображению и измерьте интенсивность сигнала²⁹. Сохраните результаты.

Флуоресцентный сигнал наблюдался от внеклеточных веществ в отрицательном контроле, где^1-е антитело не использовалось (рисунок 1А-С). Флуоресцентный сигнал реагента, усиленного тирамидами, конъюгированного с большой субъединиц...

Для цианобактерий система TSA нашла широкое применение в TSA-флуоресцентной гибридизации in situ (TSA-FISH, CARD-FISH), нацеливаясь на специфические рРНК. Тем не менее, его применение для белков остается ограниченным²⁶. В данном исследовании была применена процедур...

Мы подтверждаем отсутствие конфликта интересов, связанного с этим исследованием.

Мы благодарим доктора Радека Кану и Барбору Шедиву за помощь в проведении конфокального микроскопического анализа, а также доктора Романа Соботку и доктора Катержину Бишову за советы по иммунодетекции и анализу флуоресцентной микроскопии. Это исследование было проведено при финансовой поддержке Чешского исследовательского фонда GAČR (проект 20-17627S to OP и TM), проекта Mobility plus между JSPS и Чешской академией наук (JPJSBP 120222502) и JSPS KAKENHI (проект 23H02301).