Immunzytochemische Visualisierung von Proteinen aus cyanobakteriellen Zellen mit hoher Autofluoreszenz von Phycoerythrin und Phycourobilin

Dieses Protokoll beschreibt die Visualisierung und Quantifizierung eines bestimmten Proteins innerhalb von Zellen auf zellulärer Ebene für das Phycoerythrin-haltige Cyanobakterium, Crocosphaera watsonii.

Vorgestellt wird ein Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung eines spezifischen Proteins in Zellen auf zellulärer Ebene für das marine Cyanobakterium Crocosphaera watsonii, einen wichtigen Primärproduzenten und Stickstofffixierer in oligotrophen Ozeanen. Eine der Herausforderungen für marine autotrophe N 2-Fixierer (Diazotrophe) besteht darin, von Sonden abgeleitete Fluoreszenzsignale von Autofluoreszenzsignalen zu unterscheiden. C. watsonii wurde ausgewählt, um Chlorophyll-, Phycoerythrin- und Phycourobilin-haltige Cyanobakterien zu repräsentieren. Das Protokoll ermöglicht eine einfache und semiquantitative Visualisierung von Proteinen in C. watsonii auf Einzelzellebene und ermöglicht so die Untersuchung der Proteinproduktion unter verschiedenen Umweltbedingungen, um die metabolischen Aktivitäten der Ziel-Cyanobakterien zu bewerten. Darüber hinaus sind die Fixierungs- und Permeabilisierungsmethoden optimiert, um die Fluoreszenzsignale von Zielproteinen zu verstärken und sie von der Autofluoreszenz, insbesondere von Phycoerythrin und Phycourobilin, zu unterscheiden. Das verstärkte Signal kann mittels konfokaler oder Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Zusätzlich wurde die Fluoreszenzintensität mit Hilfe von Fidschi-Software semi-quantifiziert. Dieser Arbeitsablauf für die Einzelzellanalyse ermöglicht die Bewertung von Zell-zu-Zell-Variationen des spezifischen Proteingehalts. Das Protokoll kann in jedem Life-Science-Labor durchgeführt werden, da es nur eine Standardausrüstung erfordert und auch leicht an andere Phycoerythrin-haltige Cyanobakterienzellen angepasst werden kann.

Die physiologische Variation der Stoffwechselaktivitäten innerhalb von Mikroorganismen, einschließlich Cyanobakterien, von Zelle zu Zelle (allgemein als "Heterogenität" bezeichnet) wurde durch Studien an Klonkulturen dokumentiert 1,2,3,4. Diese Heterogenität umfasst verschiedene Stoffwechselaktivitäten wie Zellteilung⁵, Kohlenstoffassimilation ^6,7,8 und Stickstoffassimilation ^9,10. Zum Beispiel haben neuere Untersuchungen gezeigt, dass die_{N2-Fixierungsaktivität} in den kolonialen Cyanobakterien C. watsonii und C. subtropica (Cyanothece) eine Variabilität auf Einzelzellebene aufweist, die in Subpopulationen von Zellen vorhanden ist, während sie in anderen innerhalb der Gemeinschaft nicht vorhanden ist. Bemerkenswert ist, dass die Stickstoffaufnahme oder die N 2-Fixierungsaktivitäten auch eine Variabilität zwischen den Zellen in situ^{aufweisen 11,12,13}. Diese Ergebnisse wurden durch stabile 15-N-Isotopenanalysen untermauert, die mit Isotopenverhältnis-Massenspektrometern (NanoSIMS) durchgeführt ^wurden14,15. Obwohl NanoSIMS einen neuartigen Weg zur Analyse der Isotopenzusammensetzung auf der Ebene einzelner Zellen bietet, bleibt seine Verwendung aufgrund seiner technischen Komplexität und Kosten eingeschränkt.

Ein alternativer Ansatz zur Beobachtung der intrazellulären Heterogenität in metabolischen Aktivitäten ist die Immundetektion. Frühere Berichte haben die Immundetektion von Nitrogenase in einzelnen Zellen gezeigt, aber dies stellt aufgrund der Autofluoreszenz, die von ihren photosynthetischen Pigmenten emittiert wird, eine Herausforderung dar 16,17,18. Marine Cyanobakterien, insbesondere solche, die an ozeanische Gewässer angepasst sind, wie die großen ozeanischen Diazotrophen C. watsonii und Trichodesmium, enthalten erhebliche Mengen an Phycobiline, die Autofluoreszenz in kürzeren Wellenlängen emittieren: Phycoerythrin und Phycourobilin¹⁹. Um diese Autofluoreszenz zu umgehen, wurden bläulich emittierende Fluorochrome mit UV-Anregung für Cyanobakterien-Studien bevorzugt 16,20,21. Diese Strategie war jedoch nicht durchweg erfolgreich, da Zellen, die ausschließlich mit Primärantikörpern behandelt wurden, unter UV-Anregung eine starke blaue bis bläulich-gelbe Autofluoreszenz emittierten^20,21. Es wurden Anstrengungen unternommen, um dieses Problem zu entschärfen, indem die Zellen vor der Beobachtung blauem oder UV-Licht ausgesetzt wurden und halbleitende Nanokristalle^{verwendet wurden 22}. Die vorliegende Studie verwendet eine andere Strategie, die Proteinfluoreszenzsignale unter Verwendung des Tyramid-Signalamplifikationssystems (TSA) verstärkt, um Proteine mit niedrigem zellulären Gehalt zu visualisieren.

TSA, auch bekannt als katalysierte Reporterabscheidung (CARD), ist eine hochempfindliche enzymatische Methode, die den Nachweis von Zielen mit geringer Abundanz in der Immunzytochemie ermöglicht. Diese Technik nutzt die katalytische Aktivität der Peroxidase, um markiertes Tyramid in situ kovalent in der Nähe von Zielproteinen abzulagern ^23,24. In Gegenwart von Wasserstoffperoxid katalysiert die Peroxidase die oxidative Kondensation von Tyramid in reaktive Tyramidradikale, die dann an elektronenreiche Einheiten wie Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan^{binden 25}. Dadurch werden die Signale im Vergleich zu Standardmethoden um das 10- bis 200-fache verstärkt, so dass das Signal mit standardmäßigen chromogenen oder fluoreszierenden Techniken nachweisbar ist. Folglich ermöglicht diese Technik die schnelle und gleichzeitige Bewertung mehrerer Proteine neben phänotypischen Markern in heterogenen Populationen und seltenen Zelluntergruppen. Bemerkenswert ist, dass sich die Verschmelzung von Immunmarkierung und TSA-Systemen für Cyanobakterien bisher auf eine einzige Studie beschränkt, die Saxitoxin in Cylindrospermopsis raciborskii^{sichtbar machte 26}.

Das hierin skizzierte Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Proteinproduktion unter unterschiedlichen Umgebungsbedingungen auf Einzelzellebene, was die Bewertung der metabolischen Aktivitäten in Ziel-Cyanobakterien ermöglicht. Die Verfügbarkeit der Detektion von Ganzzell-Immunfluoreszenzproteinen ermöglicht eine schnelle und semiquantitative Visualisierung von Proteinen in C. watsonii auf Einzelzellebene. Darüber hinaus kann diese Methode leicht für die Anwendung mit anderen Cyanobakterienzellen angepasst werden, die Phycourobilin und Phycoerythrin enthalten.

1. Kultivierung von Cyanobakterien

1. Kultivieren Sie Crocosphaera watsonii PS0609-Zellen in Erlenmeyerkolben oder Photobioreaktoren in YBCII Medium²⁷. Um die Kulturdichte zu bestimmen, messen Sie die Zelldichte mit einer Methode Ihrer Wahl (z. B. Mikroskopie, Durchflusszytometrie, Zellzähler usw.).
2. Halten Sie die Zelldichten zwischen ~1 × 10⁴ bis ~5 × 10⁶ Zellen ^ml-1.

2. Vorbereitung der Reagenzien

1. Halten Sie 100% Methanol bei -20 °C.
2. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): 1,36 g KH₂PO₄, 1,42 g Na₂HPO₄, 8,0 g NaCl und 0,224 g KCl in 0,8 l destilliertem Wasser lösen, auf 1 l füllen, den pH-Wert auf 7,4 einstellen und autoklavieren (siehe Materialtabelle).
3. 1 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS
   1. 50 ml PBS in ein Becherglas auf einer Rührplatte in einer belüfteten Haube geben, auf 60 °C erhitzen und mit einem Rührwerk mischen.
   2. Geben Sie 0,5 g Paraformaldehydpulver in die erwärmte PBS-Lösung. Erhöhen Sie den pH-Wert allmählich, indem Sie 1 N NaOH aus einer Pipette tröpfchen, bis die Lösung transparent wird.Nachdem sich das Paraformaldehyd vollständig aufgelöst hat, senken Sie die Temperatur und fahren Sie mit dem Filtern der Lösung fort.
   3. Passen Sie das Volumen der Lösung mit PBS auf 40 mL an. Stellen Sie den pH-Wert mit kleinen Mengen verdünntem HCl auf ca. 6,9 ein. Die Lösung bei -20 °C aufbewahren.
4. PBG-Blockierungslösung (0,2 % Gelatine + 0,5 % Rinderserumalbumin; BSA, siehe Werkstofftabelle)
   1. 0,2 g Gelatine und 0,5 g BSA in 100 ml PBS in einem 200 ml Glasbecherglas auflösen. Die Mischung auf 60 °C erhitzen und umrühren. Aliquotieren Sie es dann in ein 15-ml-Röhrchen und lagern Sie es bei -20 °C.
5. 0,2 % Triton X-100 in PBS: Fügen Sie 20 μl Triton X-100 in 10 ml PBS hinzu. Bereiten Sie es in einem 15-ml-Röhrchen zu und bewahren Sie es bei -20 °C auf.
6. 0,5 M EDTA: 1,46 g EDTA in 10 ml destilliertem Wasser (DW) auflösen und den pH-Wert auf 8,0 einstellen (EDTA löst sich bei einem pH-Wert von < 8,0 nicht auf). Bereiten Sie es in einem 15-ml-Röhrchen zu und bewahren Sie es bei -20 °C auf.
7. 1 M Tris HCl: 1,58 g Tris HCl in 10 ml DW auflösen und den pH-Wert auf 8,0 einstellen. Bereiten Sie es in einem 15-ml-Röhrchen zu und bewahren Sie es bei -20 °C auf.
8. 50 mM Tris HCl: Löse 0,079 g Tris HCl in 10 mL DW auf und stelle den pH-Wert auf 7,0 ein. Bereiten Sie es in einem 15-ml-Röhrchen zu und bewahren Sie es bei -20 °C auf.
9. Fügen Sie 10 mg/ml Lysozym hinzu: Fügen Sie 100 mg Lysozym, 1 ml 0,5 M EDTA (pH 8) und 1 ml 1 M Tris HCl (pH 8) hinzu. Geben Sie DW bis zu 10 mL in ein 15 mL Röhrchen. Bereiten Sie es am Tag der Anwendung frisch zu.
10. 10.000 Einheiten/ml Achromopeptidase: 0,011 g 900 Einheiten/mg Achromopeptidase (siehe Materialtabelle) in 1 ml DW auflösen, gut mischen und bei -20 °C aufbewahren.
11. 60 Einheiten/ml Achromopeptidase Arbeitslösung: Fügen Sie 3 μl von 10.000 Einheiten/ml Achromopeptidase in 0,5 ml von 50 mM Tris HCl hinzu und bereiten Sie es am Tag der Anwendung frisch zu.
12. 100x Tyramid-Stammlösung herstellen: Das Tyramidreagenz in 150 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen. Bei 2-8 °C bis zu 6 Monate lagern.
13. 1x Reaktionspuffer: Geben Sie 1 Tropfen 20x Reaktionspuffer auf 1 mL DW. Dieser kann durch Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 ersetzt werden.
14. Reaktionsstopp-Reagenzien Lösungen
    1. Reaktionsstopp-Reagenz-Stammlösung: Geben Sie 1,45 ml 95%iges Ethanol in eine Durchstechflasche mit Reaktionsstopp-Reagenz, das im Tyramid-Signalamplifikationskit enthalten ist (siehe Materialtabelle). Bei -20 °C 6 Monate lagern
    2. Reaktionsstopp-Arbeitslösung des Reagenzes: Verdünnen Sie die Reaktionsstopp-Reagenz-Stammlösung (1:11) in PBS. Bereiten Sie es am Tag der Anwendung frisch zu.
15. 100x H₂O₂ Lösung: Fügen Sie 1 Tropfen (ca. 50 μL) H₂O₂ zu 1 mL DW hinzu. Bereiten Sie es am Tag der Anwendung frisch zu.
16. Tyramid-Arbeitslösung (für ein Endvolumen von 510 μl): Geben Sie 5 μl 100x Tyramid-Stammlösung, 5 μl 100x H₂O₂ Lösung und 500 μl 1x Reaktionspuffer in das 1,5 ml-Röhrchen in der angegebenen Reihenfolge und mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren gut durch. Bereiten Sie es am Tag der Anwendung frisch zu.

3. Ernte von Zellen

1. 10 ml C . watsonii-Kultur werden in ein 15-ml-Röhrchen geerntet, die Zellen durch Zentrifugation bei 5.500 × g bei 4 °C für 8 min entnommen und der Überstand verworfen. Bewahren Sie die Proben zwischen dem Eingriff auf Eis auf.
2. Das Pellet wird mit dem restlichen Überstand resuspendiert, die resuspendierte Teilprobe in ein 1,5-ml-Röhrchen überführt und 1 ml PBS in die Wäsche gegeben. Die Zellen werden durch Zentrifugation (5.500 × g, 4 °C, 5 min) entnommen und der Überstand entsorgt.

4. Fixierung und Konservierung von Zellen

1. 1 ml 1%ige PFA-Lösung zugeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 5.500 × g, 4 °C, 5 min, entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und werfen Sie ihn in den dafür vorgesehenen Chemikalienabfallbehälter, fügen Sie 1 ml PBS hinzu und resuspendieren Sie ihn.
3. Die Zellen zentrifugieren (5.500 × g, 4 °C, 5 min), den Überstand mit der Pipette entfernen und entsorgen. 1 ml 100 % Methanol (bei -20 °C gehalten) zugeben und mit einem Vortex-Mischer resuspendieren. Halten Sie die Teilproben 15 Minuten bis über Nacht bei -20 °C.

5. Permeabilisierung und Blockierung

1. Zentrifugieren Sie die Zellen (5.500 × g, 4 °C, 5 min), entfernen Sie den Überstand (Methanol) mit einer Pipette und werfen Sie ihn in den dafür vorgesehenen Chemiemüllbehälter, fügen Sie 1 mL PBS hinzu und resuspendieren Sie es.
2. Die Zellen zentrifugieren (5.500 × g, 4 °C, 5 min), den Überstand mit der Pipette entfernen und entsorgen, 1 mL 0,2 % Triton X-100 hinzufügen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen (5.500 × g, 4 °C, 5 min), entfernen Sie den Triton X-100-Überstand per Pipette und entsorgen Sie ihn, fügen Sie 1 mL PBS hinzu und resuspendieren Sie ihn.
4. Die Zellen zentrifugieren (5.500 × g, 4 °C, 5 min), den Überstand mit einer Pipette entfernen, 0,5 mL Lysozym (siehe Materialtabelle) und 0,5 mL PBG (Schritt 2.4) zugeben und 3 h bei 37 °C inkubieren.
5. Die Zellen zentrifugieren (5.500 × g, 4 °C, 5 min), den Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernen und in einen dafür vorgesehenen Abfallbehälter werfen, 0,5 mL 60 Einheiten Achromopeptidase (Schritt 2.10) und 0,5 mL PBG zugeben und 30 min bei 37 °C inkubieren.
6. Zentrifugieren Sie die Zellen (5.500 × g, 4 °C, 5 min), entfernen Sie den Achromopeptidase-Überstand mit einer Pipette, werfen Sie ihn in den dafür vorgesehenen Mülleimer und fügen Sie die erforderliche Menge PBS hinzu.
   HINWEIS: Die erforderliche Menge sollte durch die Anzahl der zu beobachtenden Teilproben bestimmt werden (eine Teilprobe ist 90 μl für einen Kreis mit ~2 cm Durchmesser). Sicherstellung, dass Negativkontrollen(n) vorbereitet werden; ohne 1^{. oder 2.} Antikörper und ohne 1^{. Antikörper.}

6. Vorbereitung der Proben für die Bildgebung

1. Geben Sie die Proben auf einen Objektträger und fügen Sie den 1. Antikörper²⁸ hinzu.
   1. Zeichnen Sie mit einem flüssigkeitsabweisenden Diamarker zwei Kreise mit einem Durchmesser von ca. ~2 cm auf ein Poly-Lysin-beschichtetes Diaglas (siehe Materialtabelle). Geben Sie 90 μl Teilproben in die Kreise. Trocknen Sie die aufgetragene Teilprobe in einer chemischen Haube. Die Fahrt dauert ca. 30-60 min.
   2. Rehydrieren Sie die Teilprobe und waschen Sie sie mit 90 μl PBS, inkubieren Sie 2 Minuten lang und verwerfen Sie das PBS. Wiederholen Sie die Schritte 2 Mal.
   3. Verdünnen Sie den 1^. Antikörper²⁸ (1 mg ^ml-1) 200-mal in PBG-Blockierungslösung. Passen Sie die Menge der Lösung in Abhängigkeit von der Anzahl der Proben an.
      1. 90 μl Primärantikörper (1^st)²⁸ auf jede Teilprobe mit Ausnahme der Negativkontrolle auftragen. Legen Sie destilliertes, wassernasses Seidenpapier in eine Kammer, verschließen Sie es mit einer Abdeckung und wickeln Sie es mit Transplantationsband ein. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
2. Tragen Sie den 2^. Antikörper auf.
   1. Entfernen Sie den Überschuss an 1^{. Antikörper,} indem Sie den Objektträger auf seiner langen Seite auf Seidenpapier stehen lassen, drehen Sie ihn, um die Zellen nach oben zu bringen, und fügen Sie mit einer Pipette 0,2% Triton X-100 in jeden Kreis hinzu und inkubieren Sie 2 Minuten, um die Zellen zu spülen. 5 Mal wiederholen.
   2. Tragen Sie vorsichtig den konjugierten Sekundärantikörper (2^nd) gegen Poly-Meerrettichperoxidase (HRP) (Ziege, Anti-Kaninchen-IgG) auf (siehe Materialtabelle) auf und inkubieren Sie ihn 60 Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Zellen vorsichtig 10 Minuten lang mit PBS; 3 Mal wiederholen.
3. Verstärkung des Tyramid-Signals
   1. 90 μl Tyramid-Arbeitslösung auf die Proben geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entsorge die Lösung, indem du den Objektträger an der langen Seite auf einem Seidenpapier stehen lässt. 90 μl Reaktionsstopp-Reagenz zugeben und 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Verwerfe die Lösung.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit sollte für jedes Zielprotein oder für jedes Mikroskop getestet werden. Die Inkubationszeit kann verkürzt werden, oder der Schritt kann weggelassen werden, um die Proteinverteilung mit einem konfokalen Mikroskop zu beobachten, um eine Übersättigung des Signals zu vermeiden.
4. Spülen Sie die Zellen alle 30 Minuten (5 Mal) mit PBS. Spülen Sie die Zellen mit DW. Entfernen Sie das Wasser zügig. Fügen Sie einen Tropfen Eindeckmedium hinzu (siehe Materialtabelle) und platzieren Sie das Deckglas.
5. Drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas, um das überschüssige Einbettmedium zu entfernen, und lassen Sie es ca. 30 min trocknen. Versiegeln Sie es mit transparentem Nagellack und lagern Sie es im Dunkeln.

7. Detektion des Fluoreszenzsignals mit einem Fluoreszenzmikroskop

1. Schalten Sie das Fluoreszenzmikroskop, den Computer und die UV-Lichtquelle ein. Öffnen Sie die Software für die Kamera, die mit dem Mikroskop verbunden ist (siehe Materialtabelle). So einstellen, dass Live-Bilder überwacht werden. Schalten Sie das Licht im Raum aus.
   1. Setzen Sie den Objektträger mit den Zellen auf den Probentisch ein. Verwenden Sie das Objektiv mit der kleinsten Vergrößerung und stellen Sie das Objektiv und die Kondensorlinse ein, um den Fokus fein abzustimmen. Wechseln Sie das Objektiv nacheinander auf größere Vergrößerungen.
   2. Tragen Sie Immersionsöl auf das Deckglas auf und tauschen Sie die Linse gegen die Ölimmersionslinse 100x aus. Decken Sie die Lichtquelle von der Lichtquelle ab, wählen Sie das DAPI-Filterset für die Tyramid-350-Analyse aus und öffnen Sie den Anregungs-UV-Lichtshutter.
   3. Testen Sie 3-4 Belichtungszeiten und entscheiden Sie sich für die beste Belichtungszeit ohne Übersättigung. Wählen Sie das FITC-Filterset für die Phycoerythrin-Beobachtung aus, wiederholen Sie den Vorgang und entscheiden Sie sich für die beste Belichtungszeit. Erwägen Sie die Verwendung eines erhöhten Verstärkungs- oder Binning-Modus an der Kamera, um das Verfahren zu beschleunigen und die Signalverschlechterung aufgrund von Phototoxizität zu verringern. Stellen Sie den Verstärkungs- und Binning-Modus für die Bildaufnahme zurück.
2. Wählen Sie das Sichtfeld aus, machen Sie einen Schnappschuss für ein Hellfeldbild, ein Tyramidbild und ein Phycoerythrin-Bild mit der für jedes Bild ausgewählten Belichtungszeit.

8. Detektion unter einem konfokalen Mikroskop

1. Schalten Sie das Konfokalmikroskop und den Computer ein und starten Sie die Mikroskopiesoftware. Erhitzen Sie den Laser für 60 Minuten. Schalten Sie das Licht im Raum aus. Platzieren Sie den Objektträger mit den Zellen auf dem Probentisch mit Immersionsöl auf einer Objektivlinse.
2. Wählen Sie den 405-nm-Laser aus und stellen Sie die Hauptstrahlteiler (MBS) auf 405 ein. Stellen Sie die Laserleistung auf 0,5 % ein. Stellen Sie die Messparameter so ein, dass Sie eine Pixelgröße von 0,03 μm erhalten, zoomen Sie 10 (Bildgröße 512 x 512 Pixel). Legen Sie die Pixelverweilzeit auf 0,02 ms fest, was eine Gesamtscanzeit von 5,06 s ergibt.
3. Stellen Sie den Detektorbereich von 410 nm bis 695 nm auf dem GaAsP-Spektraldetektor ein, um eine spektrale Auflösung von 9 nm zu erreichen. Stellen Sie die optimale Verstärkung (800-900) ein. Starten Sie den Lambda-Scan.
   HINWEIS: Die optimale Verstärkung sollte für jedes Mikroskop optimiert werden.

9. Quantifizieren Sie die Intensität des Signals mit Fidschi

1. Öffnen Sie das mit dem DAPI-Filter aufgenommene Bild unter dem Fluoreszenzmikroskop. Wählen Sie Zellen im Hellfeldbild aus und definieren Sie den Interessenbereich (ROI). Nachdem Sie den ROI für alle Zellen definiert haben, speichern Sie den ROI.
2. Schließen Sie das Hellfeldbild und öffnen Sie das Fluoreszenzbild. Trennen Sie das RGB-Bild in Rot, Blau und Grün, um das Tyramid-350-Signal zu extrahieren.
3. Wenden Sie den durch ein Hellfeldbild vorbereiteten ROI auf ein blaues Bild an und messen Sie die Intensität des Signals²⁹. Speichern Sie die Ergebnisse.

Das Fluoreszenzsignal wurde von extrazellulären Substanzen in der Negativkontrolle beobachtet, bei der der 1^. Antikörper nicht verwendet wurde (Abbildung 1A-C). Das Fluoreszenzsignal des Tyramid-verstärkten Reagenzes, das an die große Untereinheit des Rubisco-Proteins (RbcL) konjugiert ist, wurde in C. watsonii erfolgreich unter einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines DAPI-Filters mi...

Bei Cyanobakterien hat das TSA-System eine breite Anwendung in der TSA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (TSA-FISH, CARD-FISH) gefunden, die auf spezifische rRNA abzielt. Die Anwendung für Proteine ist jedoch nach wie vor begrenzt²⁶. In dieser Studie wurde ein TSA-Verfahren angewendet, um den Ganzzell-Immunnachweis des N_{2-fixierenden} Cyanobakteriums C. watsonii zu ermöglichen, wobei Modifikationen auf der Grundlage einer früheren R...

Wir bestätigen, dass es keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Studie gibt.

Wir danken Dr. Radek Kana und Barbora Šedivá für die Unterstützung bei der konfokalen mikroskopischen Analyse und Dr. Roman Sobotka und Dr. Kateřina Bišová für die Beratung bei der Immundetektion und Fluoreszenzmikroskopie. Diese Forschung wurde finanziell unterstützt von der Tschechischen Forschungsstiftung GAČR (Projekt 20-17627S zu OP und TM), dem Mobility plus-Projekt zwischen JSPS und der Tschechischen Akademie der Wissenschaften (JPJSBP 120222502) und JSPS KAKENHI (Projekt 23H02301).