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Method Article
이 프로토콜은 피코에리트린을 함유한 시아노박테리아(cyanobacterium, Crocosphaera watsonii)에 대한 세포 수준에서 세포 내 특정 단백질의 시각화 및 정량화를 설명합니다.
제시된 프로토콜은 올리고영양 해양에서 중요한 1차 생산자이자 질소 정착사인 해양 시아노박테리움 Crocosphaera watsonii에 대한 세포 수준에서 세포의 특정 단백질을 시각화하고 정량화하기 위한 프로토콜입니다. 해양 독립영양 N2 fixer(diazotrophs)의 과제 중 하나는 프로브에서 파생된 형광 신호와 자가형광을 구별하는 것입니다. C. watsonii 는 엽록소, 피코에리트린 및 피쿠로빌린 함유 시아노박테리아를 대표하기 위해 선택되었습니다. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 C. watsonii 의 단백질을 단순하고 반정량적으로 시각화할 수 있도록 하여 다양한 환경 조건에서 단백질 생산을 조사하여 표적 시아노박테리아의 대사 활성을 평가할 수 있습니다. 또한, 고정 및 투과화 방법은 표적 단백질의 형광 신호를 향상시켜 자가형광, 특히 phycoerythrin 및 phycourobilin과 구별하도록 최적화되어 있습니다. 향상된 신호는 컨포칼 또는 광시야 형광 현미경을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 또한 형광 강도는 피지 소프트웨어를 사용하여 반정량화되었습니다. 이 단일 세포 분석 워크플로우를 통해 특정 단백질 함량의 세포 간 변이를 평가할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표준 장비만 필요하고 다른 피코에리트린을 함유한 시아노박테리아 세포에도 쉽게 적용할 수 있기 때문에 모든 생명 과학 실험실에서 수행할 수 있습니다.
시아노박테리아를 포함한 미생물 내 대사 활동에서 세포에서 세포로의 생리학적 변화(일반적으로 "이질성"이라고 함)는 클론 배양에 대한 연구를 통해 문서화되었습니다 1,2,3,4. 이 이질성은 세포 분열5, 탄소 동화 6,7,8 및 질소 동화 9,10과 같은 다양한 대사 활동을 포함합니다. 예를 들어, 최근 조사에 따르면 군집 시아노박테리아 C. watsonii 및 C. subtropica(Cyanothece)의 N2 고정 활성은 단일 세포 수준의 변동성을 나타내며, 군집 내의 다른 세포에는 없는 반면 세포의 하위 집단에는 존재합니다. 특히, 질소 흡수 또는N2 고정 활성은 또한 현장 세포 간의 가변성을 나타냅니다 11 , 12 , 13 . 이러한 발견은 동위 원소 비율 질량 분석기 (NanoSIMS) 14 , 15 로 수행 된 안정적인 15N 동위 원소 분석에 의해 입증되었습니다. 그러나 NanoSIMS가 개별 세포 수준에서 동위원소 조성을 분석하기 위한 새로운 방법을 제공함에도 불구하고 기술적 복잡성과 비용으로 인해 사용이 제한되어 있습니다.
대사 활동에서 세포 내 이질성을 관찰하는 또 다른 접근법은 면역 검출을 사용하는 것입니다. 이전 보고서에서는 개별 세포에서 질소 효소의 면역 검출을 입증했지만 이는 광합성 색소 16,17,18에 의해 방출되는 자가형광으로 인해 문제를 제기합니다. 해양 시아노박테리아, 특히 주요 해양 디아조트로피 C. watsonii 및 Trichodesmium과 같은 해수에 적응한 박테리아는 짧은 파장에서 자가형광을 방출하는 피코빌린(phycobilin)과 같은 피코빌린(phycobilin)을 상당량 함유하고 있습니다19. 이러한 자가형광을 우회하기 위해 UV 여기(excitation)를 이용한 청색 방출 형광 색소가 시아노박테리아 연구에 선호되어 왔습니다 16,20,21. 그러나 이 전략은 일차 항체로만 처리된 세포가 UV 여기20,21 하에서 강한 청색에서 청황색 자가형광을 방출했기 때문에 일관되게 성공을 거두지 못했습니다. 관찰 전에 세포를 청색 또는 자외선에 노출시키고 반도체 나노 결정을 사용하여이 문제를 완화하기위한 노력이 이루어졌습니다22. 본 연구는 티라미드 신호 증폭 시스템(TSA)을 사용하여 단백질 형광 신호를 강화하여 세포 함량이 낮은 단백질을 시각화하는 다른 전략을 사용합니다.
CARD(Catalyzed Reporter Deposition)라고도 하는 TSA는 면역세포화학에서 저농도 표적을 검출할 수 있는 고감도 효소 방법입니다. 이 기술은 과산화효소의 촉매 활성을 활용하여 표지된 티라마이드를 제자리에서 표적 단백질에 근접하게 공유 증착합니다 23,24. 과산화수소가 존재할 때, 과산화효소는 티라미드의 산화적 응축을 반응성 티라미드 라디칼로 촉매 작용을 하고, 이는 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판과 같은 전자가 풍부한 부분에 결합합니다25. 이를 통해 표준 방법에 비해 신호를 최대 10배에서 200배까지 강화하여 표준 발색 또는 형광 기술을 통해 신호를 검출할 수 있습니다. 결과적으로, 이 기술은 이질적인 집단 및 희귀 세포 subset에서 표현형 마커와 함께 여러 단백질의 신속한 동시 평가를 용이하게 합니다. 특히, 현재로서는 시아노박테리아에 대한 면역 표지와 TSA 시스템의 통합은 Cylindrospermopsis raciborskii26에서 삭시톡신을 시각화한 단일 연구로 제한되어 있습니다.
본원에 설명된 방법은 단일 세포 수준에서 다양한 환경 조건 하에서 단백질 생산을 조사할 수 있게 하여 표적 시아노박테리아의 대사 활성을 평가할 수 있습니다. 전체 세포 면역 형광 단백질 검출의 가용성은 단일 세포 수준에서 C. watsonii 의 단백질을 빠르고 반정량적으로 시각화할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 피쿠로빌린(phycourobilin) 및 피코에리트린(phycoerythrin)을 함유하는 다른 시아노박테리아 세포와 함께 사용하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.
1. 시아노박테리아 배양
2. 시약의 준비
3. 세포 수확
4. 세포의 정착 그리고 보전
5. 투과화 및 차단
6. 이미징을 위한 샘플 준비
7. 형광 현미경을 이용한 형광 신호 검출
8. 컨포칼 현미경에서 검출
9. 피지를 사용하여 신호의 강도를 정량화하십시오.
형광 신호는 1st항체가 사용되지 않은 음성 대조군의 세포외 물질에서 관찰되었습니다(그림 1A-C). 루비스코 단백질(RbcL)의 큰 소단위체에 접합된 티라미드 부스트 시약의 형광 신호는 UV 여기(excitation)가 있는 DAPI 필터를 사용하여 형광 현미경으로 C. watsonii에서 성공적으로 검출되었습니다(그림 ...
시아노박테리아의 경우, TSA 시스템은 특정 rRNA를 표적으로 하는 TSA-형광 in situ hybridization(TSA-FISH, CARD-FISH)에 널리 사용되고 있습니다. 그러나 단백질에 대한 응용은 여전히 제한적이다26. 본 연구에서는 N2-고정 시아노박테리움 C. 왓소니(cyanobacterium C. watsonii)의 전세포 면역검출을 가능하게 하기 위해 TSA 절차를 적용했으며, 이는 이전 ...
이 연구와 관련된 이해 상충이 없음을 확인합니다.
컨포칼 현미경 분석에 도움을 주신 Radek Kana 박사와 Barbora Šedivá 박사님, 면역검출 및 형광 현미경 분석에 대한 조언을 주신 Roman Sobotka 박사와 Kateřina Bišová 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 체코 연구 재단 GAČR(프로젝트 20-17627S에서 OP 및 TM까지), JSPS와 체코 과학 아카데미 간의 Mobility plus 프로젝트(JPJSBP 120222502) 및 JSPS KAKENHI(프로젝트 23H02301)의 재정 지원을 받았습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Achromopeptidase | FUJIFILM | 014-09661 | |
Alexa Fluor350 | Thermo Scientific | B40952 | Tyramide-350 |
Alexa Fluor405 | Thermo Scientific | B48254 | Tyramide-405 |
Alexa Fluor488 Tyramide SuperBoost Kit | Thermo Scientific | B40922 | Goat anti-rabbit IgG |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
Centrifuge tubes (15 mL) | VWR | 525-1085 | For harvesting cells |
Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | Equipped with Airyscan |
Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | DAPI filter: Ex.360-370 nm, Em. 420-460 nm |
Gelatine | Merk | 4070 | |
High precision microscope cover glasses for confocal microscope | Deckgläser | No. 1.5H | |
Liquid Blocker Regular/Mini | Daido Sangyo Co., Ltd. | Part 6505 | For keeping the cells on the slide glass |
Lysozyme | ITW Reagents | A4972 | |
Methanol | Carl Roth | 67-56-1 | |
Monopotassium Phosphate | Penta | 12290 | |
Monunting medium | Sigma-Aldrich | 345789-20ML | FluorSave Reagent |
Mounting medium | Vectashild | H-1300 | |
Objective lens used in the confocal microscope | Zeiss | Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Poly-lysine coated slide glass | Sigma-Aldrich | P0425-72EA | |
Potassium chloride | Lach-Ner | ||
Safe lock tube (1.5 mL) | Eppendorf | 0030 120.086 | For treating cells and storing chemicals |
Sodium chloride | Penta | 16610 | |
Sodium hydrogen phosphate | Penta | 15130 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 |
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