Phycoerythrin 및 Phycourobilin의 높은 자가형광을 가진 시아노박테리아 세포의 단백질에 대한 면역세포화학적 시각화

이 프로토콜은 피코에리트린을 함유한 시아노박테리아(cyanobacterium, Crocosphaera watsonii)에 대한 세포 수준에서 세포 내 특정 단백질의 시각화 및 정량화를 설명합니다.

제시된 프로토콜은 올리고영양 해양에서 중요한 1차 생산자이자 질소 정착사인 해양 시아노박테리움 Crocosphaera watsonii에 대한 세포 수준에서 세포의 특정 단백질을 시각화하고 정량화하기 위한 프로토콜입니다. 해양 독립영양 N₂ fixer(diazotrophs)의 과제 중 하나는 프로브에서 파생된 형광 신호와 자가형광을 구별하는 것입니다. C. watsonii 는 엽록소, 피코에리트린 및 피쿠로빌린 함유 시아노박테리아를 대표하기 위해 선택되었습니다. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 C. watsonii 의 단백질을 단순하고 반정량적으로 시각화할 수 있도록 하여 다양한 환경 조건에서 단백질 생산을 조사하여 표적 시아노박테리아의 대사 활성을 평가할 수 있습니다. 또한, 고정 및 투과화 방법은 표적 단백질의 형광 신호를 향상시켜 자가형광, 특히 phycoerythrin 및 phycourobilin과 구별하도록 최적화되어 있습니다. 향상된 신호는 컨포칼 또는 광시야 형광 현미경을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 또한 형광 강도는 피지 소프트웨어를 사용하여 반정량화되었습니다. 이 단일 세포 분석 워크플로우를 통해 특정 단백질 함량의 세포 간 변이를 평가할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표준 장비만 필요하고 다른 피코에리트린을 함유한 시아노박테리아 세포에도 쉽게 적용할 수 있기 때문에 모든 생명 과학 실험실에서 수행할 수 있습니다.

시아노박테리아를 포함한 미생물 내 대사 활동에서 세포에서 세포로의 생리학적 변화(일반적으로 "이질성"이라고 함)는 클론 배양에 대한 연구를 통해 문서화되었습니다 1,2,3,4. 이 이질성은 세포 분열⁵, 탄소 동화 ^6,7,8 및 질소 동화 ^9,10과 같은 다양한 대사 활동을 포함합니다. 예를 들어, 최근 조사에 따르면 군집 시아노박테리아 C. watsonii 및 C. subtropica(Cyanothece)의 N₂ 고정 활성은 단일 세포 수준의 변동성을 나타내며, 군집 내의 다른 세포에는 없는 반면 세포의 하위 집단에는 존재합니다. 특히, 질소 흡수 또는_N2 고정 활성은 또한 현장 세포 간의 가변성을 나타냅니다 ^{11 , 12 , 13} . 이러한 발견은 동위 원소 비율 질량 분석기 (NanoSIMS) ^{14 , 15} 로 수행 된 안정적인 ¹⁵N 동위 원소 분석에 의해 입증되었습니다. 그러나 NanoSIMS가 개별 세포 수준에서 동위원소 조성을 분석하기 위한 새로운 방법을 제공함에도 불구하고 기술적 복잡성과 비용으로 인해 사용이 제한되어 있습니다.

대사 활동에서 세포 내 이질성을 관찰하는 또 다른 접근법은 면역 검출을 사용하는 것입니다. 이전 보고서에서는 개별 세포에서 질소 효소의 면역 검출을 입증했지만 이는 광합성 색소 ^16,17,18에 의해 방출되는 자가형광으로 인해 문제를 제기합니다. 해양 시아노박테리아, 특히 주요 해양 디아조트로피 C. watsonii 및 Trichodesmium과 같은 해수에 적응한 박테리아는 짧은 파장에서 자가형광을 방출하는 피코빌린(phycobilin)과 같은 피코빌린(phycobilin)을 상당량 함유하고 있습니다¹⁹. 이러한 자가형광을 우회하기 위해 UV 여기(excitation)를 이용한 청색 방출 형광 색소가 시아노박테리아 연구에 선호되어 왔습니다 16,20,21. 그러나 이 전략은 일차 항체로만 처리된 세포가 UV 여기^20,21 하에서 강한 청색에서 청황색 자가형광을 방출했기 때문에 일관되게 성공을 거두지 못했습니다. 관찰 전에 세포를 청색 또는 자외선에 노출시키고 반도체 나노 결정을 사용하여이 문제를 완화하기위한 노력이 이루어졌습니다²². 본 연구는 티라미드 신호 증폭 시스템(TSA)을 사용하여 단백질 형광 신호를 강화하여 세포 함량이 낮은 단백질을 시각화하는 다른 전략을 사용합니다.

CARD(Catalyzed Reporter Deposition)라고도 하는 TSA는 면역세포화학에서 저농도 표적을 검출할 수 있는 고감도 효소 방법입니다. 이 기술은 과산화효소의 촉매 활성을 활용하여 표지된 티라마이드를 제자리에서 표적 단백질에 근접하게 공유 증착합니다 ^23,24. 과산화수소가 존재할 때, 과산화효소는 티라미드의 산화적 응축을 반응성 티라미드 라디칼로 촉매 작용을 하고, 이는 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판과 같은 전자가 풍부한 부분에 결합합니다²⁵. 이를 통해 표준 방법에 비해 신호를 최대 10배에서 200배까지 강화하여 표준 발색 또는 형광 기술을 통해 신호를 검출할 수 있습니다. 결과적으로, 이 기술은 이질적인 집단 및 희귀 세포 subset에서 표현형 마커와 함께 여러 단백질의 신속한 동시 평가를 용이하게 합니다. 특히, 현재로서는 시아노박테리아에 대한 면역 표지와 TSA 시스템의 통합은 Cylindrospermopsis raciborskii²⁶에서 삭시톡신을 시각화한 단일 연구로 제한되어 있습니다.

본원에 설명된 방법은 단일 세포 수준에서 다양한 환경 조건 하에서 단백질 생산을 조사할 수 있게 하여 표적 시아노박테리아의 대사 활성을 평가할 수 있습니다. 전체 세포 면역 형광 단백질 검출의 가용성은 단일 세포 수준에서 C. watsonii 의 단백질을 빠르고 반정량적으로 시각화할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 피쿠로빌린(phycourobilin) 및 피코에리트린(phycoerythrin)을 함유하는 다른 시아노박테리아 세포와 함께 사용하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.

1. 시아노박테리아 배양

1. 삼각 플라스크 또는 광생물반응기에서 Crocosphaera watsonii PS0609 세포를 YBCII 배지에서 배양합니다²⁷. 배양 밀도를 측정하려면 선택한 방법(예: 현미경 검사, 유세포 분석, 세포 계수기 등)을 사용하여 세포 밀도를 측정합니다.
2. 세포 밀도를 ~1 × 10⁴ 에서 ~5 × 10⁶ 세포 ^mL-1 사이로 유지합니다.

2. 시약의 준비

1. -20 °C에서 100% 메탄올을 유지하십시오.
2. 인산염 완충 식염수(PBS): 1.36g의 KH₂PO₄, 1.42g의 Na₂HPO₄, 8.0g의 NaCl 및 0.224g의 KCl을 0.8L의 증류수에 용해하고 1L까지 채우고 pH를 7.4로 조정하고 오토클레이브합니다( 재료 표 참조).
3. PBS의 1% 파라포름알데히드(PFA)
   1. 통풍 후드의 교반 플레이트에 있는 유리 비커에 PBS 50mL를 넣고 60°C로 가열한 후 교반기로 혼합합니다.
   2. 가난된 PBS 용액에 파라포름알데히드 분말 0.5g을 넣습니다. 용액이 투명해질 때까지 피펫에서 1N NaOH를 적립하여 pH를 점차적으로 높입니다.파라포름알데히드가 완전히 용해된 후 온도를 낮추고 용액을 여과합니다.
   3. PBS를 사용하여 용액의 부피를 40mL로 조정합니다. 소량의 묽은 HCl로 pH를 약 6.9로 조정합니다. 용액을 -20 °C에서 보존하십시오.
4. PBG 차단 용액 (0.2 % 젤라틴 + 0.5 % 소 혈청 알부민; BSA, 재료 표 참조)
   1. 200mL 유리 비커에 0.2g의 젤라틴과 0.5g의 BSA를 100mL의 PBS에 녹입니다. 혼합물을 60°C로 가열하고 저어줍니다. 그런 다음 15mL 튜브에 분취하여 -20°C에서 보관합니다.
5. PBS 내 0.2% Triton X-100: 20μL의 Triton X-100을 10mL의 PBS에 첨가합니다. 15mL 튜브에 넣고 -20°C에서 보관합니다.
6. 0.5 M EDTA : 1.46 g의 EDTA를 10 mL의 증류수 (DW)에 용해시키고 pH를 8.0으로 조정합니다 (EDTA는 pH < 8.0에 용해되지 않음). 15mL 튜브에 넣고 -20°C에서 보관합니다.
7. 1M Tris HCl: Tris HCl 1.58g을 DW 10mL에 용해하고 pH를 8.0으로 조정합니다. 15mL 튜브에 넣고 -20°C에서 보관합니다.
8. 50mM Tris HCl: 0.079g의 Tris HCl을 10mL의 DW에 용해하고 pH를 7.0으로 조정합니다. 15mL 튜브에 넣고 -20°C에서 보관합니다.
9. 10mg/mL 라이소자임 추가: 라이소자임 100mg, 0.5M EDTA 1mL(pH 8) 및 1M Tris HCl(pH 8) 1mL를 추가합니다. 15mL 튜브에 최대 10mL의 DW를 추가합니다. 사용 당일에 신선하게 준비하십시오.
10. 10,000 units/mL 아크로모펩티다아제: 900 units/mg 아크로모펩티다아제 0.011g을 DW 1mL에 용해시키고 잘 혼합한 후 -20°C에서 보존합니다.
11. 60 units/mL 아크로모펩티다제 작업 용액: 50 mM Tris HCl 0.5 mL에 10,000 units/mL 아크로모펩티다아제 3 μL를 추가합니다. 사용 당일에 새로 준비하십시오.
12. 100x 티라마이드 원액 준비: 티라마이드 시약을 150μL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시킵니다. 2-8 °C에서 최대 6 개월 동안 보관하십시오.
13. 1x 반응 완충액: 20x 반응 완충액 1방울을 DW 1mL에 추가합니다. 이것은 Tris 버퍼, pH 7.4로 교체 할 수 있습니다.
14. 반응 중지 시약 용액
    1. 반응 중지 시약 스톡 용액: 티라미드 신호 증폭 키트에 포함된 반응 중지 시약 1개 바이알에 95% 에탄올 1.45mL를 추가합니다( 재료 표 참조). -20 °C에서 6 개월 동안 보관하십시오.
    2. 반응 중지 시약 작업 용액: 반응 중지 시약 스톡 용액(1:11)을 PBS로 희석합니다. 사용 당일에 신선하게 준비하십시오.
15. 100x H₂O₂ 용액 : 1 mL의 DW에 H₂O₂ 1 방울 (약 50 μL)을 첨가합니다. 사용 당일에 신선하게 준비하십시오.
16. 티라미드 작업 용액(최종 부피 510μL): 100x 티라미드 원액 5μL, 100x H₂O₂ 용액 5μL, 1x 반응 완충액 500μL를 1.5mL 튜브에 언급된 순서로 첨가하고 피펫팅으로 부드럽게 잘 혼합합니다. 사용 당일에 신선하게 준비하십시오.

3. 세포 수확

1. C. watsonii 배양액 10mL를 15mL 튜브에 넣고 5,500 × g에서 4°C에서 8분 동안 원심분리하여 세포를 채취한 후 상등액을 버립니다. 절차 사이에 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
2. 펠릿을 잔류 상층액으로 재현탁시키고, 재현탁된 하위 시료를 1.5mL 튜브로 옮기고, 1mL의 PBS를 세척액에 첨가합니다. 원심분리(5,500 × g, 4 °C, 5분)로 세포를 채취하고 상층액을 버립니다.

4. 세포의 정착 그리고 보전

1. 1% PFA 용액 1mL를 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
2. 5,500 × g, 4 °C, 5 분에서 세포를 원심 분리하고, 피펫으로 상층액을 제거하고 할당 된 화학 폐기물 통에 버리고 PBS 1mL를 첨가 한 후 재현탁합니다.
3. 세포를 원심분리(5,500 × g, 4°C, 5분)하고 피펫으로 상층액을 제거한 후 폐기합니다. 1mL의 100% 메탄올(-20°C에서 유지)을 추가하고 와류 믹서를 사용하여 재현탁합니다. 서브 샘플을 -20 °C에서 15분에서 하룻밤 동안 유지하십시오.

5. 투과화 및 차단

1. 세포를 원심분리(5,500 × g, 4 °C, 5분)하고 피펫으로 상등액(메탄올)을 제거한 후 지정된 화학 폐기물통에 버리고 PBS 1mL를 첨가한 후 재현탁합니다.
2. 세포를 원심분리(5,500 × g, 4 °C, 5분)하고 피펫으로 상층액을 제거한 후 버리고 0.2% Triton X-100 1mL를 첨가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
3. 세포를 원심분리(5,500 × g, 4 °C, 5분)하고 Triton X-100-supertatent를 피펫으로 제거한 후 버리고 PBS 1mL를 첨가하고 재현탁합니다.
4. 세포를 원심분리(5,500 × g, 4 °C, 5 분)하고 피펫을 사용하여 상등액을 제거한 다음 0.5 mL의 라이소자임( 재료 표 참조)과 0.5 mL의 PBG(단계 2.4)를 첨가하고 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다.
5. 세포를 원심분리(5,500 × g, 4 °C, 5분)하고 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거한 후 지정된 쓰레기통에 버리고 60 단위 아크로모펩티다아제 0.5mL(단계 2.10)와 PBG 0.5mL를 첨가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
6. 세포를 원심분리(5,500 × g, 4 °C, 5분)하고 피펫을 사용하여 아크로모펩티다아제 상등액을 제거한 후 지정된 쓰레기통에 버리고 필요한 양의 PBS를 첨가합니다.
   참고: 필요한 양은 관찰할 하위 샘플의 수에 따라 결정해야 합니다(하나의 하위 샘플은 ~2cm 직경 원의 경우 90μL임). 음성 대조군을 준비하십시오. 1st^또는 2nd^항체가 없고 1st^항체가 없습니다.

6. 이미징을 위한 샘플 준비

1. 유리 슬라이드에 샘플을 놓고 1차 항체²⁸을 추가합니다.
   1. 발수 슬라이드 마커 펜으로 폴리리신으로 코팅된 슬라이드 유리에 약 ~2cm 직경의 원을 두 개 그립니다( 재료 표 참조). 90μL의 하위 샘플을 원에 적용합니다. 적용된 하위 샘플을 화학 후드에서 건조시킵니다. 약 30-60 분이 소요됩니다.
   2. 서브샘플을 재수화하고 90μL의 PBS로 세척한 후 2분 동안 배양한 후 PBS를 폐기합니다. 단계를 2회 반복합니다.
   3. 1st 항체²⁸ (1 mg ^mL-1)을 PBG 차단 용액에 200 회 희석한다. 샘플의 수에 따라 용액의 양을 조정하십시오.
      1. 음성 대조군을 제외한 각 하위 샘플에 90μL의 1차(1^차) 항체²⁸ 을 적용합니다. 증류수에 적신 티슈 페이퍼를 챔버에 넣고 커버로 닫고 그라프팅 테이프로 감쌉니다. 4 °C에서 밤새 배양하십시오.
2. 2^차 항체를 적용합니다.
   1. 유리 슬라이드를 티슈 페이퍼의 긴 면에 세워 초과량의 1st^항체를 제거하고 세포를 불러오도록 돌린 다음 피펫을 사용하여 각 원에 0.2% Triton X-100을 추가하고 세포를 헹구기 위해 2분 동안 배양합니다. 5회 반복합니다.
   2. 폴리-호스 무 과산화효소(HRP) 접합 2차(2^차) 항체(염소, 항토끼 IgG)( 재료 표 참조)를 부드럽게 적용하고 실온에서 60분 동안 배양합니다. 10분 동안 PBS로 세포를 부드럽게 헹굽니다. 3회 반복합니다.
3. 티라미드 신호 증폭
   1. 샘플에 90μL의 티라마이드 작업 용액을 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 유리 슬라이드가 티슈 페이퍼의 긴 쪽에 서도록 하여 용액을 폐기합니다. 90μL의 반응 정지 시약을 추가하고 실온에서 3분 동안 배양합니다. 용액을 버리십시오.
      참고: 배양 시간은 각 표적 단백질 또는 각 현미경에 대해 테스트해야 합니다. 배양 시간을 단축하거나 신호의 과포화를 방지하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하여 단백질 할당을 관찰하기 위해 단계를 생략할 수 있습니다.
4. 30분마다 PBS로 세포를 헹굽니다(5회). DW로 세포를 헹굽니다. 물을 세게 제거하십시오. 장착 매체 한 방울( 재료 표 참조)을 추가하고 커버 유리를 놓습니다.
5. 커버 유리를 부드럽게 눌러 여분의 장착 매체를 제거하고 약 30분 동안 건조시킵니다. 투명 매니큐어로 밀봉하고 어두운 곳에 보관하십시오.

7. 형광 현미경을 이용한 형광 신호 검출

1. 형광 현미경, 컴퓨터 및 UV 광원의 전원을 켭니다. 현미경에 연결된 카메라의 소프트웨어를 엽니다( 재료 표 참조). 라이브 이미지를 모니터링하도록 설정합니다. 방의 조명을 끕니다.
   1. 세포가 포함된 유리 슬라이드를 표본 스테이지에 삽입합니다. 배율이 가장 작은 렌즈를 사용하고 대물렌즈와 집광식 렌즈를 조정하여 초점을 미세 조정하십시오. 렌즈를 더 큰 배율로 하나씩 변경합니다.
   2. 커버 유리 위에 이머젼 오일을 바르고 렌즈를 오일 이멀젼 100x 렌즈로 변경합니다. 광원에서 광원을 가리고 Tyramide-350 분석을 위한 DAPI 필터 세트를 선택한 다음 여기 UV 라이트 셔터를 엽니다.
   3. 3-4번의 노출 시간을 테스트하고 과포화 없이 최상의 노출 시간을 결정합니다. phycoerythrin 관찰을 위한 FITC 필터 세트를 선택하고 절차를 반복한 다음 최적의 노출 시간을 결정합니다. 절차의 속도를 높이고 광독성으로 인한 신호 저하를 완화하기 위해 카메라에서 증가된 게인 또는 비닝 모드를 활용하는 것을 고려해 보십시오. 이미지 획득을 위해 게인 및 비닝 모드를 다시 설정합니다.
2. 시야각을 선택하고 각 이미지에 대해 선택한 노출 시간으로 명시야 이미지, 티라미드 이미지 및 phycoerythrin 이미지에 대한 스냅샷을 찍습니다.

8. 컨포칼 현미경에서 검출

1. 컨포칼 현미경과 컴퓨터의 전원을 켜고 현미경 소프트웨어를 시작합니다. 레이저를 60분 동안 가열합니다. 방의 조명을 끕니다. 세포가 들어있는 유리 슬라이드를 표본 스테이지에 놓고 대물 렌즈에 이멀젼 오일을 사용합니다.
2. 405nm 레이저를 선택하고 메인 빔 스플리터(MBS) 405를 설정합니다. 레이저 출력을 0.5%로 설정합니다. 측정 매개변수를 설정하여 픽셀 크기 0.03μm, 확대/축소 10(이미지 크기 512 x 512 픽셀)을 얻습니다. 픽셀 체류 시간을 0.02ms로 설정하면 총 스캔 시간이 5.06초가 됩니다.
3. GaAsP 스펙트럼 검출기에서 검출기 범위를 410nm에서 695nm로 설정하여 9nm의 스펙트럼 분해능을 활성화합니다. 최적의 게인(800-900)을 설정합니다. 람다 스캔을 시작합니다.
   알림: 최적의 게인은 각 현미경에 대해 최적화되어야 합니다.

9. 피지를 사용하여 신호의 강도를 정량화하십시오.

1. DAPI 필터로 캡처한 이미지를 형광 현미경 아래에서 엽니다. 명시야 이미지에서 셀을 선택하고 관심 영역(ROI)을 정의합니다. 모든 셀에 대한 ROI를 정의한 후 ROI를 저장합니다.
2. 명시야 이미지를 닫고 형광 이미지를 엽니다. RGB 영상을 빨간색, 파란색, 녹색으로 분리하여 Tyramide-350 신호를 추출합니다.
3. 명시야 영상으로 준비한 ROI를 청색 영상에 적용하고 신호²⁹의 강도를 측정합니다. 결과를 저장합니다.

형광 신호는 1st^항체가 사용되지 않은 음성 대조군의 세포외 물질에서 관찰되었습니다(그림 1A-C). 루비스코 단백질(RbcL)의 큰 소단위체에 접합된 티라미드 부스트 시약의 형광 신호는 UV 여기(excitation)가 있는 DAPI 필터를 사용하여 형광 현미경으로 C. watsonii에서 성공적으로 검출되었습니다(그림 ...

시아노박테리아의 경우, TSA 시스템은 특정 rRNA를 표적으로 하는 TSA-형광 in situ hybridization(TSA-FISH, CARD-FISH)에 널리 사용되고 있습니다. 그러나 단백질에 대한 응용은 여전히 제한적이다²⁶. 본 연구에서는 N₂-고정 시아노박테리움 C. 왓소니(cyanobacterium C. watsonii)의 전세포 면역검출을 가능하게 하기 위해 TSA 절차를 적용했으며, 이는 이전 ...

이 연구와 관련된 이해 상충이 없음을 확인합니다.

컨포칼 현미경 분석에 도움을 주신 Radek Kana 박사와 Barbora Šedivá 박사님, 면역검출 및 형광 현미경 분석에 대한 조언을 주신 Roman Sobotka 박사와 Kateřina Bišová 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 체코 연구 재단 GAČR(프로젝트 20-17627S에서 OP 및 TM까지), JSPS와 체코 과학 아카데미 간의 Mobility plus 프로젝트(JPJSBP 120222502) 및 JSPS KAKENHI(프로젝트 23H02301)의 재정 지원을 받았습니다.