Visualizzazione immunocitochimica di proteine da cellule cianobatteriche con elevata autofluorescenza di ficoeritrina e ficourobina

Questo protocollo delinea la visualizzazione e la quantificazione di una particolare proteina all'interno delle cellule a livello cellulare per il cianobatterio contenente ficoeritrina, Crocosphaera watsonii.

Viene presentato un protocollo per la visualizzazione e la quantificazione di una proteina specifica nelle cellule a livello cellulare per il cianobatterio marino Crocosphaera watsonii, un produttore primario cruciale e fissatore di azoto negli oceani oligotrofici. Una delle sfide per i fissatori di N₂ autotrofi marini (diazotrofi) è distinguere i segnali di fluorescenza derivati dalla sonda dall'autofluorescenza. C. watsonii è stato selezionato per rappresentare cianobatteri contenenti clorofilla, ficoeritrina e ficourobilina. Il protocollo consente una visualizzazione semplice e semi-quantitativa delle proteine in C. watsonii a livello di singola cellula, consentendo lo studio della produzione di proteine in diverse condizioni ambientali per valutare le attività metaboliche dei cianobatteri bersaglio. Inoltre, i metodi di fissazione e permeabilizzazione sono ottimizzati per migliorare i segnali di fluorescenza dalle proteine bersaglio per distinguerle dall'autofluorescenza, in particolare dalla ficoeritrina e dalla ficouriobilina. Il segnale potenziato può essere visualizzato utilizzando la microscopia a fluorescenza confocale o a campo largo. Inoltre, l'intensità della fluorescenza è stata semi-quantificata utilizzando il software Fiji. Questo flusso di lavoro di analisi di singole cellule consente la valutazione delle variazioni da cellula a cellula del contenuto proteico specifico. Il protocollo può essere eseguito in qualsiasi laboratorio di scienze della vita in quanto richiede solo attrezzature standard e può anche essere facilmente adattato ad altre cellule cianobatteriche contenenti ficoeritrina.

La variazione fisiologica da cellula a cellula (comunemente indicata come "eterogeneità") nelle attività metaboliche all'interno dei microrganismi, compresi i cianobatteri, è stata documentata attraverso studi su colture di cloni 1,2,3,4. Questa eterogeneità comprende diverse attività metaboliche come la divisione cellulare⁵, l'assimilazione del carbonio ^6,7,8 e l'assimilazione dell'azoto ^9,10. Ad esempio, recenti indagini hanno indicato che l'attività di fissazione dell'N₂ nei cianobatteri coloniali C. watsonii e C. subtropica (Cyanothece) mostra variabilità a livello di singola cellula, essendo presente in sottopopolazioni di cellule mentre è assente in altre all'interno della comunità. In particolare, anche l'assorbimento di azoto o le attività di fissazione dell'N₂ mostrano variabilità tra le cellule in situ 11,12,13. Questi risultati sono stati confermati da analisi degli isotopi stabili ¹⁵N condotte con spettrometri di massa isotopici (NanoSIMS)^14,15. Tuttavia, nonostante NanoSIMS offra una nuova strada per analizzare la composizione isotopica a livello di singola cellula, il suo uso rimane limitato a causa della sua complessità tecnica e del suo costo.

Un approccio alternativo per osservare l'eterogeneità intracellulare nelle attività metaboliche è l'immunorilevazione. Rapporti precedenti hanno dimostrato l'immunorilevazione della nitrogenasi nelle singole cellule, ma ciò pone sfide a causa dell'autofluorescenza emessa dai loro pigmenti fotosintetici 16,17,18. I cianobatteri marini, in particolare quelli adattati alle acque oceaniche come i principali diazotrofi oceanici C. watsonii e Trichodesmium, contengono notevoli quantità di ficobiline che emettono autofluorescenza a lunghezze d'onda più corte: ficoeritrina e ficourobilina¹⁹. Per aggirare questa autofluorescenza, i fluorocromi che emettono blu con eccitazione UV sono stati favoriti per gli studi sui cianobatteri 16,20,21. Tuttavia, questa strategia non ha avuto successo in modo coerente, poiché le cellule trattate esclusivamente con anticorpi primari emettevano una forte autofluorescenza da blu a giallo-bluastro sotto eccitazione UV^20,21. Sono stati compiuti sforzi per mitigare questo problema sottoponendo le cellule all'esposizione alla luce blu o UV prima dell'osservazione e impiegando nanocristalli semiconduttori²². Il presente studio impiega una strategia diversa che migliora i segnali di fluorescenza delle proteine utilizzando il sistema di amplificazione del segnale della tiramide (TSA) per visualizzare le proteine a basso contenuto cellulare.

La TSA, nota anche come deposizione reporter catalizzata (CARD), è un metodo enzimatico altamente sensibile che consente la rilevazione di bersagli a bassa abbondanza in immunocitochimica. Questa tecnica sfrutta l'attività catalitica della perossidasi per depositare in modo covalente la tiramide marcata in prossimità delle proteine bersaglio in situ^23,24. In presenza di perossido di idrogeno, la perossidasi catalizza la condensazione ossidativa della tiramide in radicali tiramidici reattivi, che poi si legano a frazioni ricche di elettroni come la tirosina, la fenilalanina e il triptofano²⁵. Ciò migliora i segnali fino a 10-200 volte rispetto ai metodi standard, rendendo il segnale rilevabile tramite tecniche cromogeniche o fluorescenti standard. Di conseguenza, questa tecnica facilita la valutazione rapida e simultanea di più proteine insieme a marcatori fenotipici in popolazioni eterogenee e sottogruppi di cellule rare. In particolare, a partire da ora, l'amalgama dei sistemi di immunomarcatura e TSA per i cianobatteri è stata limitata a un singolo studio che ha visualizzato la saxitossina in Cylindrospermopsis raciborskii²⁶.

Il metodo qui descritto consente di studiare la produzione di proteine in condizioni ambientali variabili a livello di singola cellula, consentendo la valutazione delle attività metaboliche nei cianobatteri bersaglio. La disponibilità della rilevazione delle proteine in immunofluorescenza a cellula intera consente una visualizzazione rapida e semiquantitativa delle proteine in C. watsonii a livello di singola cellula. Inoltre, questo metodo può essere facilmente adattato per l'uso con altre cellule cianobatteriche contenenti ficourobilina e ficoeritrina.

1. Coltivazione di cianobatteri

1. Coltivare le cellule di Crocosphaera watsonii PS0609 in fiasche di Erlenmeyer o fotobioreattori in terreno YBCII²⁷. Per determinare la densità di coltura, misurare la densità cellulare utilizzando un metodo a scelta (ad es. microscopia, citometria a flusso, contatore di cellule, ecc.).
2. Mantenere le densità delle celle tra ~1 × 10⁴ a ~5 × 10⁶ celle ^mL-1.

2. Preparazione dei reagenti

1. Mantenere il metanolo al 100% a -20 °C.
2. Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): sciogliere 1,36 g di KH₂PO₄, 1,42 g di Na₂HPO₄, 8,0 g di NaCl e 0,224 g di KCl in 0,8 L di acqua distillata, riempire fino a 1 L, regolare il pH a 7,4 e sterilizzare in autoclave (vedi Tabella dei materiali).
3. 1% di paraformaldeide (PFA) nel PBS
   1. Aggiungere 50 ml di PBS in un becher di vetro su una piastra di agitazione in una cappa ventilata, riscaldarlo a 60 °C e mescolare con l'agitatore.
   2. Introdurre 0,5 g di polvere di paraformaldeide nella soluzione di PBS riscaldata. Aumentare gradualmente il pH somministrando 1 N di NaOH da una pipetta fino a quando la soluzione diventa trasparente.Dopo che la paraformaldeide si è completamente sciolta, abbassare la temperatura e procedere al filtraggio della soluzione.
   3. Regolare il volume della soluzione a 40 ml con PBS. Regolare il pH con piccole quantità di HCl diluito a circa 6,9. Conservare la soluzione a -20 °C.
4. Soluzione bloccante PBG (0,2% di gelatina + 0,5% di albumina sierica bovina; BSA, vedi Tabella dei materiali)
   1. Sciogliere 0,2 g di gelatina e 0,5 g di BSA in 100 mL di PBS in un becher di vetro da 200 mL. Scaldare il composto a 60 °C e mescolare. Quindi, aliquotarlo in una provetta da 15 ml e conservarlo a -20 °C.
5. 0,2% Triton X-100 in PBS: aggiungere 20 μL di Triton X-100 in 10 mL di PBS. Prepararlo in una provetta da 15 ml e conservarlo a -20 °C.
6. 0,5 M EDTA: Sciogliere 1,46 g di EDTA in 10 mL di acqua distillata (DW) e regolare il pH a 8,0 (l'EDTA non si dissolverà a pH < 8,0). Prepararlo in una provetta da 15 ml e conservarlo a -20 °C.
7. 1 M Tris HCl: Sciogliere 1,58 g di Tris HCl in 10 mL di DW e regolare il pH a 8,0. Prepararlo in una provetta da 15 ml e conservarlo a -20 °C.
8. 50 mM Tris HCl: Sciogliere 0,079 g di Tris HCl in 10 mL di DW e regolare il pH a 7,0. Prepararlo in una provetta da 15 ml e conservarlo a -20 °C.
9. Aggiungere 10 mg/mL di lisozima: Aggiungere 100 mg di lisozima, 1 mL di EDTA 0,5 M (pH 8) e 1 mL di Tris HCl 1 M (pH 8). Aggiungere DW fino a 10 mL in una provetta da 15 mL. Preparalo fresco il giorno dell'uso.
10. 10.000 unità/mL di cromopeptidasi: Sciogliere 0,011 g di 900 unità/mg di acromopeptidasi (vedere la Tabella dei materiali) in 1 mL di DW, mescolare bene e conservare a -20 °C.
11. 60 unità/mL di soluzione di lavoro per cromopeptidasi: aggiungere 3 μL di 10.000 unità/mL di acromopeptidasi in 0,5 mL di 50 mM Tris HCl. Prepararlo fresco il giorno dell'uso.
12. Preparare 100x soluzione madre di tiramidide: sciogliere il reagente tiramide in 150 μl di dimetilsolfossido (DMSO). Conservare a 2-8 °C per un massimo di 6 mesi.
13. 1x Tampone di reazione: Aggiungere 1 goccia di 20x Tampone di reazione a 1 mL di DW. Questo può essere sostituito con un tampone Tris, pH 7,4.
14. Soluzioni di reagenti per l'arresto della reazione
    1. Soluzione madre del reagente di arresto della reazione: aggiungere 1,45 mL di etanolo al 95% a una fiala di reagente di arresto della reazione contenuta nel kit di amplificazione del segnale della tiramide (vedere la Tabella dei materiali). Conservare a -20 °C per 6 mesi
    2. Soluzione di lavoro del reagente di arresto della reazione: diluire la soluzione madre del reagente di arresto della reazione (1:11) in PBS. Preparalo fresco il giorno dell'uso.
15. Soluzione 100x H₂O₂ : aggiungere 1 goccia (circa 50 μL) di H₂O₂ a 1 mL di DW. Preparalo fresco il giorno dell'uso.
16. Soluzione di lavoro di tiramide (per un volume finale di 510 μL): aggiungere 5 μL di soluzione madre di tiramide 100x, 5 μL di soluzione 100x H₂O₂ e 500 μL di tampone di reazione 1x in una provetta da 1,5 mL nell'ordine indicato e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Preparalo fresco il giorno dell'uso.

3. Raccolta delle cellule

1. Raccogliere 10 mL di coltura di C. watsonii in una provetta da 15 mL, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 5.500 × g a 4 °C per 8 minuti e scartare il surnatante. Mantenere i campioni in ghiaccio tra una procedura e l'altra.
2. Risospendere il pellet con il surnatante rimanente, trasferire il sottocampione risospeso in una provetta da 1,5 mL e aggiungere 1 mL di PBS al lavaggio. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione (5.500 × g, 4 °C, 5 min) e scartare il surnatante.

4. Fissazione e conservazione delle cellule

1. Aggiungere 1 mL di soluzione di PFA all'1% e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
2. Centrifugare le cellule a 5.500 × g, 4 °C, 5 min, rimuovere il surnatante con la pipetta e gettarlo nel contenitore dei rifiuti chimici assegnato, aggiungere 1 mL di PBS e risospenderlo.
3. Centrifugare le cellule (5.500 × g, 4 °C, 5 min), rimuovere il surnatante con la pipetta ed eliminarlo. Aggiungere 1 mL di metanolo al 100% (mantenuto a -20 °C) e risospendere utilizzando un miscelatore a vortice. Mantenere i sottocampioni a -20 °C per 15 minuti o tutta la notte.

5. Permeabilizzazione e blocco

1. Centrifugare le cellule (5.500 × g, 4 °C, 5 min), rimuovere il surnatante (metanolo) con una pipetta e gettarlo nel contenitore dei rifiuti chimici assegnato, aggiungere 1 mL di PBS e risospenderlo.
2. Centrifugare le cellule (5.500 × g, 4 °C, 5 min), rimuovere il surnatante con la pipetta ed eliminarlo, aggiungere 1 mL di Triton X-100 allo 0,2% e incubare per 15 min a temperatura ambiente.
3. Centrifugare le cellule (5.500 × g, 4 °C, 5 min), rimuovere il surnatante Triton X-100 con una pipetta e gettarlo, aggiungere 1 mL di PBS e rimetterlo in sospensione.
4. Centrifugare le cellule (5.500 × g, 4 °C, 5 min), rimuovere il surnatante con una pipetta, aggiungere 0,5 mL di lisozima (vedere Tabella dei materiali) e 0,5 mL di PBG (fase 2.4) e incubare per 3 ore a 37 °C.
5. Centrifugare le cellule (5.500 × g, 4 °C, 5 min), rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una pipetta e gettarlo in un contenitore per rifiuti assegnato, aggiungere 0,5 mL di 60 unità di cromopeptidasi (passaggio 2.10) e 0,5 mL di PBG e incubare per 30 min a 37 °C.
6. Centrifugare le cellule (5.500 × g, 4 °C, 5 min), rimuovere il surnatante dell'acromopeptidasi utilizzando una pipetta, gettarlo nel cestino dei rifiuti assegnato e aggiungere la quantità necessaria di PBS.
   NOTA: La quantità necessaria deve essere decisa dal numero di sottocampioni da osservare (un sottocampione è 90 μl per un cerchio di ~2 cm di diametro). Assicurarsi di preparare i controlli negativi; senza 1^° né 2^° anticorpo e senza 1^° anticorpo.

6. Preparazione dei campioni per l'imaging

1. Posizionare i campioni su un vetrino e aggiungere il 1° anticorpo²⁸.
   1. Disegna due cerchi di circa ~2 cm di diametro su un vetrino per diapositive rivestito di polilisina con un pennarello per diapositive idrorepellente (vedi Tabella dei materiali). Applicare 90 μl di sottocampioni nei cerchi. Asciugare il sottocampione applicato in una cappa chimica. Ci vogliono circa 30-60 minuti.
   2. Reidratare il sottocampione e lavarlo con 90 μL di PBS, incubare per 2 minuti ed eliminare il PBS. Ripeti i passaggi 2 volte.
   3. Diluire il 1^{° anticorpo 28} (1 mg mL-1) 200 volte in soluzione bloccante PBG. Regolare la quantità di soluzione in base al numero di campioni.
      1. Applicare 90 μl di anticorpo primario (1^st)²⁸ su ciascun sottocampione, ad eccezione del controllo negativo. Metti la carta velina bagnata con acqua distillata in una camera, chiudila con un coperchio e avvolgila con del nastro adesivo. Incubare per una notte a 4 °C.
2. Applicare il 2^{° anticorpo} .
   1. Rimuovere l'eccesso di 1^° anticorpo lasciando che il vetrino si trovi sul lato lungo su carta velina, ruotarlo per sollevare le cellule e aggiungere lo 0,2% di Triton X-100 in ciascun cerchio utilizzando una pipetta e incubare 2 minuti per sciacquare le cellule. Ripeti 5 volte.
   2. Applicare delicatamente l'anticorpo secondario (2^°) coniugato con poli-rafano perossidasi (HRP) (capra, IgG anti-coniglio) (vedere la Tabella dei materiali) e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare delicatamente le cellule con PBS per 10 min; Ripeti 3 volte.
3. Amplificazione del segnale in tiramide
   1. Aggiungere 90 μl di soluzione di lavoro di tiramide sui campioni e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare la soluzione lasciando che il vetrino si trovi sul lato lungo su una carta velina. Aggiungere 90 μl di reagente di arresto della reazione e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente. Scartare la soluzione.
      NOTA: Il tempo di incubazione deve essere testato per ogni proteina bersaglio o per ogni microscopio. Il tempo di incubazione può essere abbreviato o il passaggio può essere omesso per osservare l'allocazione delle proteine utilizzando un microscopio confocale per evitare la sovrasaturazione del segnale.
4. Sciacquare le celle con PBS (5 volte) ogni 30 minuti. Sciacquare le celle con DW. Togliete l'acqua velocemente. Aggiungere una goccia di supporto di montaggio (vedere la Tabella dei materiali) e posizionare il vetro di copertura.
5. Premere delicatamente il vetro di copertura per rimuovere il mezzo di montaggio in eccesso e lasciarlo asciugare per circa 30 minuti. Sigillalo con smalto trasparente e conservalo al buio.

7. Rilevamento del segnale di fluorescenza mediante un microscopio a fluorescenza

1. Accendi il microscopio a fluorescenza, il computer e la sorgente di luce UV. Aprire il software della fotocamera collegata al microscopio (vedere la tabella dei materiali). Impostare per monitorare le immagini dal vivo. Spegni la luce nella stanza.
   1. Inserire il vetrino contenente le celle sul tavolino del campione. Utilizzare l'obiettivo con l'ingrandimento più piccolo e regolare l'obiettivo e la lente del condensatore per regolare con precisione la messa a fuoco. Cambia l'obiettivo con ingrandimenti maggiori uno per uno.
   2. Mettere l'olio da immersione sopra il vetro di copertura e sostituire l'obiettivo con l'obiettivo da immersione in olio 100x. Coprire la sorgente luminosa dalla sorgente luminosa, selezionare il filtro DAPI impostato per l'analisi della Tyramide-350 e aprire l'otturatore della luce UV di eccitazione.
   3. Prova 3-4 tempi di esposizione e decidi il miglior tempo di esposizione senza sovrasaturazione. Selezionare il set di filtri FITC per l'osservazione della ficoeritrina, ripetere la procedura e decidere il miglior tempo di esposizione. Prendi in considerazione l'utilizzo di un guadagno aumentato o di una modalità di binning sulla fotocamera per accelerare la procedura e mitigare la degradazione del segnale dovuta alla fototossicità. Impostare nuovamente il guadagno e la modalità di binning per l'acquisizione dell'immagine.
2. Seleziona il campo visivo, scatta un'istantanea per un'immagine in campo chiaro, un'immagine della tiramide e un'immagine della ficoretrina con il tempo di esposizione selezionato per ciascuna immagine.

8. Rilevamento al microscopio confocale

1. Accendere il microscopio confocale e il computer e avviare il software di microscopia. Riscaldare il laser per 60 minuti. Spegni la luce nella stanza. Posizionare il vetrino contenente le cellule sul tavolino del campione utilizzando olio da immersione su una lente dell'obiettivo.
2. Selezionare il laser a 405 nm e impostare i divisori di raggio principali (MBS) 405. Impostare la potenza del laser su 0,5%. Impostare i parametri di misurazione per ottenere una dimensione dei pixel di 0,03 μm, zoom 10 (dimensione dell'immagine 512 x 512 pixel). Imposta il tempo di permanenza dei pixel su 0,02 ms, che dà il tempo di scansione totale a 5,06 s.
3. Impostare l'intervallo del rivelatore da 410 nm a 695 nm sul rivelatore spettrale GaAsP consentendo una risoluzione spettrale di 9 nm. Impostare il guadagno ottimale (800-900). Avvia la scansione lambda.
   NOTA: Il guadagno ottimale deve essere ottimizzato per ogni microscopio.

9. Quantificare l'intensità del segnale utilizzando le Fiji

1. Aprire l'immagine acquisita con il filtro DAPI al microscopio a fluorescenza. Seleziona le celle nell'immagine in campo chiaro e definisci la regione di interesse (ROI). Dopo aver definito il ROI per tutte le celle, salvare il ROI.
2. Chiudere l'immagine in campo chiaro e aprire l'immagine a fluorescenza. Separa l'immagine RGB in rosso, blu e verde per estrarre il segnale Tyramide-350.
3. Applicare la ROI preparata dall'immagine in campo chiaro all'immagine blu e misurare l'intensità del segnale²⁹. Salva i risultati.

Il segnale di fluorescenza è stato osservato da sostanze extracellulari nel controllo negativo, dove il 1^{° anticorpo} non è stato utilizzato (Figura 1A-C). Il segnale di fluorescenza del reagente potenziato con tiroamide, coniugato alla grande subunità della proteina Rubisco (RbcL), è stato rilevato con successo in C. watsonii al microscopio a fluorescenza utilizzando un filtro DAPI con eccitazione UV...

Per i cianobatteri, il sistema TSA ha trovato ampio impiego nell'ibridazione in situ a fluorescenza TSA (TSA-FISH, CARD-FISH), mirando a specifici rRNA. Tuttavia, la sua applicazione per le proteine rimane limitata²⁶. In questo studio, è stata applicata una procedura TSA per consentire l'immunorilevazione a cellule intere del cianobatterio N_2-fissante C . watsonii, incorporando modifiche basate su un precedente riferimento

Confermiamo che non ci sono conflitti di interesse relativi a questo studio.

Ringraziamo il Dr. Radek Kana e Barbora Šedivá per l'assistenza nell'analisi al microscopio confocale e il Dr. Roman Sobotka e la Dr. Kateřina Bišová per i consigli nell'analisi di immunorilevamento e microscopia a fluorescenza. Questa ricerca è stata finanziata dalla Fondazione ceca per la ricerca GAČR (progetto 20-17627S per OP e TM), dal progetto Mobility plus tra JSPS e Accademia ceca delle scienze (JPJSBP 120222502) e JSPS KAKENHI (progetto 23H02301).