Visualização Imunocitoquímica de Proteínas de Células Cianobacterianas com Alta Autofluorescência de Ficoeritrina e Ficourobilina

Este protocolo descreve a visualização e quantificação de uma proteína específica dentro das células no nível celular para a cianobactéria contendo ficoeritrina, Crocosphaera watsonii.

Apresenta-se um protocolo para visualização e quantificação de uma proteína específica em células em nível celular para a cianobactéria marinha Crocosphaera watsonii, um produtor primário crucial e fixador de nitrogênio em oceanos oligotróficos. Um dos desafios para fixadores de N₂ autotróficos marinhos (diazotróficos) é distinguir os sinais de fluorescência derivados da sonda da autofluorescência. C. watsonii foi selecionada para representar cianobactérias contendo clorofila, ficoeritrina e ficourobilina. O protocolo permite a visualização simples e semiquantitativa de proteínas em C. watsonii em nível de célula única, permitindo a investigação da produção de proteínas sob diferentes condições ambientais para avaliar as atividades metabólicas das cianobactérias alvo. Além disso, os métodos de fixação e permeabilização são otimizados para aumentar os sinais de fluorescência das proteínas-alvo para distingui-los da autofluorescência, especialmente da ficoeritrina e da ficourobilina. O sinal aprimorado pode ser visualizado usando microscopia de fluorescência confocal ou de campo amplo. Além disso, a intensidade de fluorescência foi semiquantificada usando o software Fiji. Esse fluxo de trabalho de análise de célula única permite a avaliação de variações célula a célula do conteúdo específico de proteínas. O protocolo pode ser realizado em qualquer laboratório de ciências da vida, pois requer apenas equipamento padrão e também pode ser facilmente adaptado a outras células cianobacterianas contendo ficoeritrina.

A variação fisiológica de célula para célula (comumente referida como "heterogeneidade") nas atividades metabólicas dentro de microrganismos, incluindo cianobactérias, foi documentada por meio de estudos em culturas de clones 1,2,3,4. Essa heterogeneidade engloba diversas atividades metabólicas, como divisão celular⁵, assimilação de carbono ^6,7,8 e assimilação de nitrogênio ^9,10. Por exemplo, investigações recentes indicaram que a atividade de fixação de N₂ em cianobactérias coloniais C. watsonii e C. subtropica (Cyanothece) exibe variabilidade em nível de célula única, estando presente em subpopulações de células enquanto ausente em outras dentro da comunidade. Notavelmente, as atividades de absorção de nitrogênio ou fixação de N₂ também exibem variabilidade entre as células in situ^{11 , 12 , 13} . Esses achados foram comprovados por análises de isótopos estáveis ^{de 15}N conduzidas com espectrômetros de massa de razão isotópica (NanoSIMS) ^{14 , 15} . No entanto, apesar do NanoSIMS oferecer um novo caminho para analisar a composição isotópica no nível da célula individual, seu uso permanece restrito devido à sua complexidade técnica e custo.

Uma abordagem alternativa para observar a heterogeneidade intracelular nas atividades metabólicas é por meio da imunodetecção. Relatórios anteriores demonstraram a imunodetecção de nitrogenase em células individuais, mas isso apresenta desafios devido à autofluorescência emitida por seus pigmentos fotossintéticos 16,17,18. As cianobactérias marinhas, particularmente aquelas adaptadas às águas oceânicas, como os principais diazotróficos oceânicos C. watsonii e Trichodesmium, contêm quantidades substanciais de ficobilinas que emitem autofluorescência em comprimentos de onda mais curtos: ficoeritrina e ficourobilina¹⁹. Para contornar essa autofluorescência, fluorocromos emissores de azul com excitação UV têm sido favorecidos para estudos de cianobactérias 16,20,21. No entanto, essa estratégia não produziu sucesso de forma consistente, pois as células tratadas apenas com anticorpos primários emitiram autofluorescência azul forte a amarelo-azulado sob excitação UV ^20,21. Esforços têm sido feitos para mitigar esse problema, submetendo as células à exposição à luz azul ou UV antes da observação e empregando nanocristais semicondutores²². O presente estudo emprega uma estratégia diferente que aumenta os sinais de fluorescência de proteínas usando o sistema de amplificação de sinal de tiramida (TSA) para visualizar proteínas com baixo conteúdo celular.

A TSA, também conhecida como deposição de repórter catalisada (CARD), é um método enzimático altamente sensível que permite a detecção de alvos de baixa abundância em imunocitoquímica. Essa técnica aproveita a atividade catalítica da peroxidase para depositar covalentemente a tiramida marcada nas proximidades das proteínas-alvo in situ ^23,24. Na presença de peróxido de hidrogênio, a peroxidase catalisa a condensação oxidativa da tiramida em radicais tiramida reativos, que então se ligam a porções ricas em elétrons, como tirosina, fenilalanina e triptofano²⁵. Isso aumenta os sinais em até 10 a 200 vezes em comparação com os métodos padrão, tornando o sinal detectável por meio de técnicas cromogênicas ou fluorescentes padrão. Consequentemente, esta técnica facilita a avaliação rápida e simultânea de múltiplas proteínas juntamente com marcadores fenotípicos em populações heterogêneas e subconjuntos de células raras. Notavelmente, a partir de agora, o amálgama de sistemas de imunomarcação e TSA para cianobactérias foi limitado a um único estudo que visualizou a saxitoxina em Cylindrospermopsis raciborskii²⁶.

O método descrito aqui permite a investigação da produção de proteínas sob condições ambientais variáveis no nível de célula única, permitindo a avaliação das atividades metabólicas em cianobactérias alvo. A disponibilidade da detecção de proteína de imunofluorescência de células inteiras permite a visualização rápida e semiquantitativa de proteínas em C. watsonii no nível de célula única. Além disso, este método pode ser facilmente adaptado para uso com outras células cianobacterianas contendo ficourobilina e ficoeritrina.

1. Cultivo de cianobactérias

1. Cultivar células de Crocosphaera watsonii PS0609 em frascos Erlenmeyer ou fotobiorreatores em meio YBCII²⁷. Para determinar a densidade da cultura, meça a densidade celular usando um método de escolha (por exemplo, microscopia, citometria de fluxo, contador de células, etc.).
2. Mantenha as densidades celulares entre ~1 × 10⁴ a ~5 × 10⁶ células ^mL-1.

2. Preparação de reagentes

1. Mantenha 100% de metanol a -20 °C.
2. Solução salina tamponada com fosfato (PBS): Dissolva 1,36 g de KH₂PO₄, 1,42 g de Na₂HPO₄, 8,0 g de NaCl e 0,224 g de KCl em 0,8 L de água destilada, encha até 1 L, ajuste o pH em 7,4 e autoclave-o (consulte a Tabela de Materiais).
3. 1% de paraformaldeído (PFA) em PBS
   1. Adicione 50 ml de PBS a um copo de vidro numa placa de agitação num exaustor ventilado, aqueça a 60 °C e misture com agitador.
   2. Introduza 0,5 g de pó de paraformaldeído na solução de PBS aquecida. Eleve gradualmente o pH alimentando 1 N NaOH de uma pipeta até que a solução se torne transparente.Depois que o paraformaldeído estiver totalmente dissolvido, abaixe a temperatura e prossiga para filtrar a solução.
   3. Ajuste o volume da solução para 40 mL com PBS. Ajuste o pH com pequenas quantidades de HCl diluído para aproximadamente 6,9. Conservar a solução a -20 °C.
4. Solução bloqueadora de PBG (gelatina a 0,2% + albumina de soro bovino a 0,5%; BSA, consulte a Tabela de Materiais)
   1. Dissolva 0,2 g de gelatina e 0,5 g de BSA em 100 mL de PBS em um copo de vidro de 200 mL. Aquecer a mistura a 60 °C e mexer. Em seguida, alíquota em um tubo de 15 mL e armazene-o a -20 °C.
5. 0,2% Triton X-100 em PBS: Adicione 20 μL de Triton X-100 em 10 mL de PBS. Preparar num tubo de 15 ml e conservá-lo a -20 °C.
6. 0,5 M EDTA: Dissolva 1,46 g de EDTA em 10 mL de água destilada (DW) e ajuste o pH para 8,0 (o EDTA não se dissolve em pH < 8,0). Preparar num tubo de 15 ml e conservá-lo a -20 °C.
7. 1 M Tris HCl: Dissolva 1,58 g de Tris HCl em 10 mL de DW e ajuste o pH para 8,0. Preparar num tubo de 15 ml e conservá-lo a -20 °C.
8. 50 mM Tris HCl: Dissolva 0,079 g de Tris HCl em 10 mL de DW e ajuste o pH para 7,0. Preparar num tubo de 15 ml e conservá-lo a -20 °C.
9. Adicione 10 mg / mL de lisozima: Adicione 100 mg de lisozima, 1 mL de EDTA 0,5 M (pH 8) e 1 mL de Tris HCl 1 M (pH 8). Adicione DW até 10 mL em um tubo de 15 mL. Prepare-o na hora no dia do uso.
10. 10.000 unidades/mL de acromopeptidase: Dissolver 0,011 g de 900 unidades/mg de acromopeptidase (ver Tabela de Materiais) em 1 mL de DW, misturar bem e conservar a -20 °C.
11. Solução de trabalho de 60 unidades/mL de acromopeptidase: Adicione 3 μL de 10.000 unidades/mL de acromopeptidase em 0,5 mL de Tris HCl 50 mM. Prepare-o na hora no dia do uso.
12. Prepare 100x solução estoque de tiramida: Dissolva o reagente de tiramida em 150 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). Conservar a 2-8 °C até 6 meses.
13. 1x tampão de reação: Adicione 1 gota de tampão de reação 20x a 1 mL de DW. Isso pode ser substituído por tampão Tris, pH 7,4.
14. Soluções de reagentes de parada de reação
    1. Solução estoque de reagente de parada de reação: Adicione 1,45 mL de etanol a 95% a um frasco de reagente de parada de reação contido no kit de amplificação de sinal de tiramida (consulte a Tabela de Materiais). Conservar a -20 °C durante 6 meses
    2. Solução de trabalho do reagente de parada de reação: diluir a solução de estoque de reagente de parada de reação (1:11) em PBS. Prepare-o na hora no dia do uso.
15. Solução 100x H₂O₂ : Adicione 1 gota (cerca de 50 μL) de H₂O₂ a 1 mL de DW. Prepare-o na hora no dia do uso.
16. Solução de trabalho de tiramida (para um volume final de 510 μL): Adicione 5 μL de solução estoque de tiramida 100x, 5 μL de solução 100x H₂O₂ e 500 μL de tampão de reação 1x em tubo de 1,5 mL na ordem mencionada e misture suavemente pipetando. Prepare-o na hora no dia do uso.

3. Colheita de células

1. Colha 10 mL de cultura de C. watsonii em um tubo de 15 mL, colete células por centrifugação a 5.500 × g a 4 ° C por 8 min e descarte o sobrenadante. Mantenha as amostras no gelo entre o procedimento.
2. Ressuspenda o pellet com o sobrenadante restante, transfira a subamostra ressuspensa para um tubo de 1,5 mL e adicione 1 mL de PBS à lavagem. Colete as células por centrifugação (5.500 × g, 4 ° C, 5 min) e descarte o sobrenadante.

4. Fixação e preservação de células

1. Adicione 1 mL de solução de PFA a 1% e incube por 15 min em temperatura ambiente.
2. Centrifugar as células a 5.500 × g, 4 °C, 5 min, remover o sobrenadante por pipeta e descartá-lo no recipiente de resíduos químicos designado, adicionar 1 ml de PBS e ressuspendê-lo.
3. Centrifugar as células (5.500 × g, 4 °C, 5 min), retirar o sobrenadante com pipeta e eliminá-lo. Adicione 1 mL de metanol a 100% (mantido a -20 °C) e ressuspenda usando um misturador de vórtice. Manter as subamostras a -20 °C durante 15 minutos durante a noite.

5. Permeabilização e bloqueio

1. Centrifugue as células (5.500 × g, 4 ° C, 5 min), remova o sobrenadante (metanol) com pipeta e descarte-o na lixeira de resíduos químicos designada, adicione 1 mL de PBS e ressuspenda-o.
2. Centrifugue as células (5.500 × g, 4 °C, 5 min), remova o sobrenadante com pipeta e descarte-o, adicione 1 mL de Triton X-100 a 0,2% e incube por 15 min em temperatura ambiente.
3. Centrifugar as células (5.500 × g, 4 °C, 5 min), retirar o sobrenadante Triton X-100 com pipeta e eliminá-lo, adicionar 1 ml de PBS e ressuspendê-lo.
4. Centrifugue as células (5.500 × g, 4 ° C, 5 min), remova o sobrenadante usando uma pipeta, adicione 0,5 mL de lisozima (consulte a Tabela de Materiais) e 0,5 mL de PBG (etapa 2.4) e incube por 3 h a 37 ° C.
5. Centrifugar as células (5.500 × g, 4 °C, 5 min), remover cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e descartá-lo para um caixote do lixo designado, adicionar 0,5 ml de 60 unidades de acromopeptidase (passo 2.10) e 0,5 ml de PBG e incubar durante 30 min a 37 °C.
6. Centrifugar as células (5.500 × g, 4 °C, 5 min), remover o sobrenadante da acromopeptidase com uma pipeta, descartá-lo para o caixote do lixo designado e adicionar a quantidade necessária de PBS.
   NOTA: A quantidade necessária deve ser decidida pelo número de subamostras a serem observadas (uma subamostra é de 90 μL para um círculo de ~ 2 cm de diâmetro). Assegurar a preparação do(s) controlo(s) negativo(s); sem^1º nem^2º anticorpo e sem^1º anticorpo.

6. Preparação de amostras para imagem

1. Coloque as amostras em uma lâmina de vidro e adicione o 1º anticorpo²⁸.
   1. Desenhe dois círculos de cerca de ~ 2 cm de diâmetro em um vidro de lâmina revestido de polilisina com uma caneta marcadora de lâminas repelente de líquidos (consulte a Tabela de Materiais). Aplique 90 μL de subamostras nos círculos. Secar a subamostra aplicada numa capa química. Demora cerca de 30-60 min.
   2. Reidrate a subamostra e lave-a com 90 μL de PBS, incube por 2 min e descarte o PBS. Repita as etapas 2 vezes.
   3. Diluir o^1º anticorpo²⁸ (1 mg ^mL-1) 200 vezes em solução de bloqueio de PBG. Ajustar a quantidade da solução em função do número de amostras.
      1. Aplicar 90 μL de anticorpo primário (1^st)²⁸ em cada subamostra, exceto no controlo negativo. Coloque papel de seda destilado e úmido com água em uma câmara, feche-o por uma tampa e envolva-o com fita adesiva. Incubar durante a noite a 4 °C.
2. Aplique o^2º anticorpo.
   1. Remova o excesso do^1º anticorpo permitindo que a lâmina de vidro fique do lado comprido em papel de seda, gire-a para trazer as células para cima e adicione 0,2% de Triton X-100 em cada círculo usando uma pipeta e incube 2 min para enxaguar as células. Repita 5 vezes.
   2. Aplique suavemente o anticorpo secundário (2º⁾ conjugado com poli-rabanete peroxidase (HRP) (cabra, IgG anti-coelho) (consulte a Tabela de Materiais) e incube por 60 min em temperatura ambiente. Enxágue suavemente as células com PBS por 10 min; Repita 3 vezes.
3. Amplificação do sinal de tiramida
   1. Adicione 90 μL de solução de trabalho de tiramida às amostras e incube por 10 min em temperatura ambiente. Descarte a solução deixando a lâmina de vidro ficar no lado comprido sobre um lenço de papel. Adicione 90 μL de reagente de parada de reação e incube por 3 min em temperatura ambiente. Descarte a solução.
      NOTA: O tempo de incubação deve ser testado para cada proteína-alvo ou para cada microscópio. O tempo de incubação pode ser reduzido ou a etapa pode ser omitida para observar a alocação de proteínas usando um microscópio confocal para evitar a supersaturação do sinal.
4. Enxágue as células com PBS (5 vezes) a cada 30 min. Enxágue as células com DW. Remova a água rapidamente. Adicione uma gota de meio de montagem (consulte a Tabela de Materiais) e coloque a lamínula.
5. Pressione suavemente a lamínula para remover o excesso de meio de montagem e deixe secar por cerca de 30 min. Sele com esmalte transparente e guarde no escuro.

7. Detecção de sinal de fluorescência usando um microscópio de fluorescência

1. Ligue o microscópio de fluorescência, o computador e a fonte de luz UV. Abra o software da câmera conectada ao microscópio (consulte a Tabela de Materiais). Defina para monitorar imagens ao vivo. Apague a luz da sala.
   1. Insira a lâmina de vidro contendo as células no estágio de amostra. Use a lente com a menor ampliação e ajuste a objetiva e a lente condensadora para ajustar o foco. Mude a lente para ampliações maiores, uma a uma.
   2. Coloque óleo de imersão em cima da lamínula e troque a lente pela lente de imersão em óleo 100x. Cubra a fonte de luz da fonte de luz, selecione o conjunto de filtros DAPI para análise de tiramida-350 e abra o obturador de luz UV de excitação.
   3. Teste 3-4 tempos de exposição e decida o melhor tempo de exposição sem supersaturação. Selecione o conjunto de filtros FITC para observação de ficoeritrina, repita o procedimento e decida o melhor tempo de exposição. Considere a utilização de um modo de ganho ou binning aumentado na câmera para agilizar o procedimento e mitigar a degradação do sinal devido à fototoxicidade. Defina o modo de ganho e binning de volta para aquisição de imagem.
2. Selecione o campo de visão, tire um instantâneo para uma imagem de campo claro, imagem de tiramida e imagem de ficoeritrina com o tempo de exposição selecionado para cada imagem.

8. Detecção sob um microscópio confocal

1. Ligue o microscópio confocal e o computador e inicie o software de microscopia. Aqueça o laser por 60 min. Apague a luz da sala. Coloque a lâmina de vidro contendo as células no estágio de amostra usando óleo de imersão em uma lente objetiva.
2. Selecione o laser de 405 nm e defina os divisores de máximos (MBS) 405. Defina a potência do laser para 0,5%. Defina os parâmetros de medição para obter um tamanho de pixel de 0,03 μm, zoom 10 (tamanho da imagem 512 x 512 pixels). Defina o tempo de permanência do pixel como 0,02 ms, o que dá o tempo total de varredura como 5,06 s.
3. Defina a faixa do detector de 410 nm a 695 nm no detector espectral GaAsP, permitindo uma resolução espectral de 9 nm. Defina o ganho ideal (800-900). Inicie a verificação lambda.
   NOTA: O ganho ideal deve ser otimizado para cada microscópio.

9. Quantifique a intensidade do sinal usando Fiji

1. Abra a imagem capturada com o filtro DAPI sob o microscópio fluorescente. Selecione as células na imagem de campo claro e defina a região de interesse (ROI). Depois de definir o ROI para todas as células, salve o ROI.
2. Feche a imagem de campo claro e abra a imagem de fluorescência. Separe a imagem RGB em vermelho, azul e verde para extrair o sinal de tiramida 350.
3. Aplique o ROI preparado pela imagem de campo claro à imagem azul e meça a intensidade do sinal²⁹. Salve os resultados.

O sinal de fluorescência foi observado a partir de substâncias extracelulares no controle negativo, onde o^1º anticorpo não foi utilizado (Figura 1A-C). O sinal de fluorescência do reagente reforçado com tiramida, conjugado à grande subunidade da proteína Rubisco (RbcL), foi detectado com sucesso em C. watsonii sob microscópio de fluorescência usando um filtro DAPI com excitação UV (

Para cianobactérias, o sistema TSA encontrou uso generalizado na hibridização in situ de fluorescência TSA (TSA-FISH, CARD-FISH), visando rRNA específico. No entanto, sua aplicação para proteínas permanece limitada²⁶. Neste estudo, um procedimento TSA foi aplicado para permitir a imunodetecção de células inteiras da cianobactéria fixadora de N₂ C. watsonii, incorporando modificações com base em uma referência anterior

Confirmamos que não há conflitos de interesse relacionados a este estudo.

Agradecemos ao Dr. Radek Kana e Barbora Šedivá pela assistência na análise microscópica confocal e ao Dr. Roman Sobotka e à Dra. Kateřina Bišová pelos conselhos em imunodetecção e análise de microscopia de fluorescência. Esta pesquisa foi financiada pela Fundação de Pesquisa Tcheca GAČR (projeto 20-17627S para OP e TM), o projeto Mobility plus entre a JSPS e a Academia Tcheca de Ciências (JPJSBP 120222502) e JSPS KAKENHI (projeto 23H02301).