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Method Article
Ce protocole décrit la visualisation et la quantification d’une protéine particulière dans les cellules au niveau cellulaire pour la cyanobactérie contenant de la phycoérythrine, Crocosphaera watsonii.
Il s’agit d’un protocole de visualisation et de quantification d’une protéine spécifique dans les cellules au niveau cellulaire pour la cyanobactérie marine Crocosphaera watsonii, un producteur primaire crucial et fixateur d’azote dans les océans oligotrophes. L’un des défis pour les fixateurs N2 autotrophes marins (diazotrophes) est de distinguer les signaux de fluorescence dérivés de la sonde de l’autofluorescence. C. watsonii a été sélectionné pour représenter les cyanobactéries contenant de la chlorophylle, de la phycoérythrine et de la phycourobiline. Le protocole permet une visualisation simple et semi-quantitative des protéines de C. watsonii à l’échelle d’une seule cellule, ce qui permet d’étudier la production de protéines dans différentes conditions environnementales afin d’évaluer les activités métaboliques des cyanobactéries cibles. De plus, les méthodes de fixation et de perméabilisation sont optimisées pour améliorer les signaux de fluorescence des protéines cibles afin de les distinguer de l’autofluorescence, en particulier de la phycoérythrine et de la phycourobiline. Le signal amélioré peut être visualisé à l’aide de la microscopie confocale ou à fluorescence à champ large. De plus, l’intensité de la fluorescence a été semi-quantifiée à l’aide du logiciel Fidji. Ce flux de travail d’analyse unicellulaire permet d’évaluer les variations de cellule à cellule de contenu protéique spécifique. Le protocole peut être mis en œuvre dans n’importe quel laboratoire de sciences de la vie car il ne nécessite qu’un équipement standard et peut également être facilement adapté à d’autres cellules cyanobactériennes contenant de la phycoérythrine.
La variation physiologique d’une cellule à l’autre (communément appelée « hétérogénéité ») des activités métaboliques au sein des micro-organismes, y compris les cyanobactéries, a été documentée par des études sur des cultures de clones 1,2,3,4. Cette hétérogénéité englobe diverses activités métaboliques telles que la division cellulaire5, l’assimilation du carbone 6,7,8 et l’assimilation de l’azote 9,10. Par exemple, des recherches récentes ont indiqué que l’activité de fixation du N2 chez les cyanobactéries coloniales C. watsonii et C. subtropica (Cyanothece) présente une variabilité au niveau de la cellule unique, étant présente dans les sous-populations de cellules alors qu’elle est absente dans d’autres au sein de la communauté. Notamment, les activités d’absorption d’azote ou de fixation de N2 présentent également une variabilité entre les cellules in situ 11,12,13. Ces résultats ont été corroborés par des analyses d’isotopes stables de 15N effectuées à l’aide de spectromètres de masse à rapport isotopique (NanoSIMS)14,15. Cependant, bien que NanoSIMS offre une nouvelle voie pour analyser la composition isotopique au niveau des cellules individuelles, son utilisation reste limitée en raison de sa complexité technique et de son coût.
Une autre approche pour observer l’hétérogénéité intracellulaire dans les activités métaboliques est l’immunodétection. Des rapports antérieurs ont démontré l’immunodétection de la nitrogénase dans des cellules individuelles, mais cela pose des défis en raison de l’autofluorescence émise par leurs pigments photosynthétiques 16,17,18. Les cyanobactéries marines, en particulier celles qui sont adaptées aux eaux océaniques comme les grands diazotrophes océaniques C. watsonii et Trichodesmium, contiennent des quantités substantielles de phycobilines qui émettent de l’autofluorescence dans des longueurs d’onde plus courtes : phycoérythrine et phycourobiline19. Pour contourner cette autofluorescence, les fluorochromes émettant du bleu avec excitation UV ont été privilégiés pour les études sur les cyanobactéries 16,20,21. Cependant, cette stratégie n’a pas toujours donné de succès, car les cellules traitées uniquement avec des anticorps primaires ont émis une forte autofluorescence bleue à jaune bleuâtre sous excitation UV20,21. Des efforts ont été déployés pour atténuer ce problème en soumettant les cellules à une exposition à la lumière bleue ou UV avant l’observation et en utilisant des nanocristaux semi-conducteurs22. La présente étude utilise une stratégie différente qui améliore les signaux de fluorescence des protéines en utilisant le système d’amplification du signal tyramide (TSA) pour visualiser les protéines à faible contenu cellulaire.
La TSA, également connue sous le nom de dépôt rapporteur catalysé (CARD), est une méthode enzymatique très sensible permettant de détecter des cibles de faible abondance en immunocytochimie. Cette technique exploite l’activité catalytique de la peroxydase pour déposer de manière covalente le tyramide marqué à proximité des protéines cibles in situ23,24. En présence de peroxyde d’hydrogène, la peroxydase catalyse la condensation oxydative du tyramide en radicaux tyramide réactifs, qui se lient ensuite à des fractions riches en électrons telles que la tyrosine, la phénylalanine et le tryptophane25. Cela permet d’augmenter les signaux jusqu’à 10 à 200 fois par rapport aux méthodes standard, ce qui rend le signal détectable par des techniques chromogènes ou fluorescentes standard. Par conséquent, cette technique facilite l’évaluation rapide et simultanée de plusieurs protéines aux côtés de marqueurs phénotypiques dans des populations hétérogènes et des sous-ensembles cellulaires rares. Notamment, à partir de maintenant, la fusion des systèmes d’immunomarquage et de TSA pour les cyanobactéries s’est limitée à une seule étude qui a visualisé la saxitoxine chez Cylindrospermopsis raciborskii26.
La méthode décrite dans le présent document permet d’étudier la production de protéines dans des conditions environnementales variables au niveau de la cellule unique, ce qui permet d’évaluer les activités métaboliques chez les cyanobactéries cibles. La disponibilité de la détection des protéines d’immunofluorescence à cellules entières permet une visualisation rapide et semi-quantitative des protéines de C. watsonii au niveau de la cellule unique. De plus, cette méthode peut être facilement adaptée pour être utilisée avec d’autres cellules cyanobactériennes contenant de la phycourobiline et de la phycoérythrine.
1. Culture de cyanobactéries
2. Préparation des réactifs
3. Cellules de récolte
4. Fixation et conservation des cellules
5. Perméabilisation et blocage
6. Préparation des échantillons pour l’imagerie
7. Détection du signal de fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence
8. Détection au microscope confocal
9. Quantifier l’intensité du signal à l’aide des Fidji
Le signal de fluorescence a été observé à partir de substances extracellulaires dans le contrôle négatif, où l’anticorps 1er n’a pas été utilisé (Figure 1A-C). Le signal de fluorescence du réactif boosté par le tyramide, conjugué à la grande sous-unité de la protéine Rubisco (RbcL), a été détecté avec succès chez C. watsonii au microscope à fluorescence à l’aide d’un filtre ...
Pour les cyanobactéries, le système TSA a été largement utilisé dans l’hybridation in situ en fluorescence TSA (TSA-FISH, CARD-FISH), ciblant des ARNr spécifiques. Cependant, son application pour les protéines reste limitée26. Dans cette étude, une procédure TSA a été appliquée pour permettre l’immunodétection de la cyanobactérie fixatrice de N2 C. watsonii, en incorporant des modifications basées sur une référenc...
Nous confirmons qu’il n’y a aucun conflit d’intérêts lié à cette étude.
Nous remercions le Dr Radek Kana et Barbora Šedivá pour leur aide dans l’analyse microscopique confocale, ainsi que le Dr Roman Sobotka et le Dr Kateřina Bišová pour leurs conseils en immunodétection et en analyse par microscopie à fluorescence. Cette recherche a été soutenue financièrement par la Fondation tchèque pour la recherche GAČR (projet 20-17627S à OP et TM), le projet Mobility plus entre JSPS et l’Académie tchèque des sciences (JPJSBP 120222502), et JSPS KAKENHI (projet 23H02301).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Achromopeptidase | FUJIFILM | 014-09661 | |
Alexa Fluor350 | Thermo Scientific | B40952 | Tyramide-350 |
Alexa Fluor405 | Thermo Scientific | B48254 | Tyramide-405 |
Alexa Fluor488 Tyramide SuperBoost Kit | Thermo Scientific | B40922 | Goat anti-rabbit IgG |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
Centrifuge tubes (15 mL) | VWR | 525-1085 | For harvesting cells |
Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | Equipped with Airyscan |
Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | DAPI filter: Ex.360-370 nm, Em. 420-460 nm |
Gelatine | Merk | 4070 | |
High precision microscope cover glasses for confocal microscope | Deckgläser | No. 1.5H | |
Liquid Blocker Regular/Mini | Daido Sangyo Co., Ltd. | Part 6505 | For keeping the cells on the slide glass |
Lysozyme | ITW Reagents | A4972 | |
Methanol | Carl Roth | 67-56-1 | |
Monopotassium Phosphate | Penta | 12290 | |
Monunting medium | Sigma-Aldrich | 345789-20ML | FluorSave Reagent |
Mounting medium | Vectashild | H-1300 | |
Objective lens used in the confocal microscope | Zeiss | Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Poly-lysine coated slide glass | Sigma-Aldrich | P0425-72EA | |
Potassium chloride | Lach-Ner | ||
Safe lock tube (1.5 mL) | Eppendorf | 0030 120.086 | For treating cells and storing chemicals |
Sodium chloride | Penta | 16610 | |
Sodium hydrogen phosphate | Penta | 15130 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 |
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