Visualisation immunocytochimique de protéines à partir de cellules cyanobactériennes avec une autofluorescence élevée de phycoérythrine et de phycourobiline

Ce protocole décrit la visualisation et la quantification d’une protéine particulière dans les cellules au niveau cellulaire pour la cyanobactérie contenant de la phycoérythrine, Crocosphaera watsonii.

Il s’agit d’un protocole de visualisation et de quantification d’une protéine spécifique dans les cellules au niveau cellulaire pour la cyanobactérie marine Crocosphaera watsonii, un producteur primaire crucial et fixateur d’azote dans les océans oligotrophes. L’un des défis pour les fixateurs N₂ autotrophes marins (diazotrophes) est de distinguer les signaux de fluorescence dérivés de la sonde de l’autofluorescence. C. watsonii a été sélectionné pour représenter les cyanobactéries contenant de la chlorophylle, de la phycoérythrine et de la phycourobiline. Le protocole permet une visualisation simple et semi-quantitative des protéines de C. watsonii à l’échelle d’une seule cellule, ce qui permet d’étudier la production de protéines dans différentes conditions environnementales afin d’évaluer les activités métaboliques des cyanobactéries cibles. De plus, les méthodes de fixation et de perméabilisation sont optimisées pour améliorer les signaux de fluorescence des protéines cibles afin de les distinguer de l’autofluorescence, en particulier de la phycoérythrine et de la phycourobiline. Le signal amélioré peut être visualisé à l’aide de la microscopie confocale ou à fluorescence à champ large. De plus, l’intensité de la fluorescence a été semi-quantifiée à l’aide du logiciel Fidji. Ce flux de travail d’analyse unicellulaire permet d’évaluer les variations de cellule à cellule de contenu protéique spécifique. Le protocole peut être mis en œuvre dans n’importe quel laboratoire de sciences de la vie car il ne nécessite qu’un équipement standard et peut également être facilement adapté à d’autres cellules cyanobactériennes contenant de la phycoérythrine.

La variation physiologique d’une cellule à l’autre (communément appelée « hétérogénéité ») des activités métaboliques au sein des micro-organismes, y compris les cyanobactéries, a été documentée par des études sur des cultures de clones 1,2,3,4. Cette hétérogénéité englobe diverses activités métaboliques telles que la division cellulaire⁵, l’assimilation du carbone ^6,7,8 et l’assimilation de l’azote ^9,10. Par exemple, des recherches récentes ont indiqué que l’activité de fixation du N₂ chez les cyanobactéries coloniales C. watsonii et C. subtropica (Cyanothece) présente une variabilité au niveau de la cellule unique, étant présente dans les sous-populations de cellules alors qu’elle est absente dans d’autres au sein de la communauté. Notamment, les activités d’absorption d’azote ou de fixation de N₂ présentent également une variabilité entre les cellules in situ 11,12,13. Ces résultats ont été corroborés par des analyses d’isotopes stables ^{de 15}N effectuées à l’aide de spectromètres de masse à rapport isotopique (NanoSIMS)^14,15. Cependant, bien que NanoSIMS offre une nouvelle voie pour analyser la composition isotopique au niveau des cellules individuelles, son utilisation reste limitée en raison de sa complexité technique et de son coût.

Une autre approche pour observer l’hétérogénéité intracellulaire dans les activités métaboliques est l’immunodétection. Des rapports antérieurs ont démontré l’immunodétection de la nitrogénase dans des cellules individuelles, mais cela pose des défis en raison de l’autofluorescence émise par leurs pigments photosynthétiques 16,17,18. Les cyanobactéries marines, en particulier celles qui sont adaptées aux eaux océaniques comme les grands diazotrophes océaniques C. watsonii et Trichodesmium, contiennent des quantités substantielles de phycobilines qui émettent de l’autofluorescence dans des longueurs d’onde plus courtes : phycoérythrine et phycourobiline¹⁹. Pour contourner cette autofluorescence, les fluorochromes émettant du bleu avec excitation UV ont été privilégiés pour les études sur les cyanobactéries 16,20,21. Cependant, cette stratégie n’a pas toujours donné de succès, car les cellules traitées uniquement avec des anticorps primaires ont émis une forte autofluorescence bleue à jaune bleuâtre sous excitation UV^20,21. Des efforts ont été déployés pour atténuer ce problème en soumettant les cellules à une exposition à la lumière bleue ou UV avant l’observation et en utilisant des nanocristaux semi-conducteurs²². La présente étude utilise une stratégie différente qui améliore les signaux de fluorescence des protéines en utilisant le système d’amplification du signal tyramide (TSA) pour visualiser les protéines à faible contenu cellulaire.

La TSA, également connue sous le nom de dépôt rapporteur catalysé (CARD), est une méthode enzymatique très sensible permettant de détecter des cibles de faible abondance en immunocytochimie. Cette technique exploite l’activité catalytique de la peroxydase pour déposer de manière covalente le tyramide marqué à proximité des protéines cibles in situ^23,24. En présence de peroxyde d’hydrogène, la peroxydase catalyse la condensation oxydative du tyramide en radicaux tyramide réactifs, qui se lient ensuite à des fractions riches en électrons telles que la tyrosine, la phénylalanine et le tryptophane²⁵. Cela permet d’augmenter les signaux jusqu’à 10 à 200 fois par rapport aux méthodes standard, ce qui rend le signal détectable par des techniques chromogènes ou fluorescentes standard. Par conséquent, cette technique facilite l’évaluation rapide et simultanée de plusieurs protéines aux côtés de marqueurs phénotypiques dans des populations hétérogènes et des sous-ensembles cellulaires rares. Notamment, à partir de maintenant, la fusion des systèmes d’immunomarquage et de TSA pour les cyanobactéries s’est limitée à une seule étude qui a visualisé la saxitoxine chez Cylindrospermopsis raciborskii²⁶.

La méthode décrite dans le présent document permet d’étudier la production de protéines dans des conditions environnementales variables au niveau de la cellule unique, ce qui permet d’évaluer les activités métaboliques chez les cyanobactéries cibles. La disponibilité de la détection des protéines d’immunofluorescence à cellules entières permet une visualisation rapide et semi-quantitative des protéines de C. watsonii au niveau de la cellule unique. De plus, cette méthode peut être facilement adaptée pour être utilisée avec d’autres cellules cyanobactériennes contenant de la phycourobiline et de la phycoérythrine.

1. Culture de cyanobactéries

1. Cultivez des cellules de Crocosphaera watsonii PS0609 dans des flacons Erlenmeyer ou des photobioréacteurs dans le milieu YBCII²⁷. Pour déterminer la densité de culture, mesurez la densité cellulaire à l’aide d’une méthode de votre choix (p. ex., microscopie, cytométrie en flux, compteur de cellules, etc.).
2. Maintenir les densités cellulaires entre ~1 × 10⁴ à ~5 × 10⁶ cellules ^mL-1.

2. Préparation des réactifs

1. Maintenir 100 % de méthanol à -20 °C.
2. Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) : Dissoudre 1,36 g de KH₂PO₄, 1,42 g de Na₂HPO₄, 8,0 g de NaCl et 0,224 g de KCl dans 0,8 L d’eau distillée, remplir à 1 L, ajuster le pH à 7,4 et autoclaver le tout (voir le tableau des matériaux).
3. 1 % de paraformaldéhyde (PFA) dans le PBS
   1. Ajouter 50 ml de PBS dans un bécher en verre sur une plaque d’agitation dans une hotte ventilée, chauffer à 60 °C et mélanger à l’aide d’un agitateur.
   2. Introduisez 0,5 g de poudre de paraformaldéhyde dans la solution de PBS réchauffée. Augmentez progressivement le pH en introduisant 1 N NaOH à partir d’une pipette jusqu’à ce que la solution devienne transparente.Une fois que le paraformaldéhyde s’est complètement dissous, abaissez la température et procédez à la filtration de la solution.
   3. Ajustez le volume de la solution à 40 mL avec du PBS. Ajustez le pH avec de petites quantités de HCl dilué à environ 6,9. Conserver la solution à -20 °C.
4. solution bloquante de PBG (0,2 % de gélatine + 0,5 % d’albumine sérique bovine ; BSA, voir tableau des matériaux)
   1. Dissoudre 0,2 g de gélatine et 0,5 g de BSA dans 100 ml de PBS dans un bécher en verre de 200 ml. Chauffer le mélange à 60 °C et remuer. Ensuite, aliquotez-le dans un tube de 15 mL et conservez-le à -20 °C.
5. 0,2 % Triton X-100 dans du PBS : Ajouter 20 μL de Triton X-100 dans 10 mL de PBS. Préparez-le dans un tube de 15 mL et conservez-le à -20 °C.
6. 0,5 M EDTA : Dissoudre 1,46 g d’EDTA dans 10 mL d’eau distillée (DW) et ajuster le pH à 8,0 (l’EDTA ne se dissoudra pas à un pH < 8,0). Préparez-le dans un tube de 15 mL et conservez-le à -20 °C.
7. 1 M de Tris HCl : Dissoudre 1,58 g de Tris HCl dans 10 mL de DW et ajuster le pH à 8,0. Préparez-le dans un tube de 15 mL et conservez-le à -20 °C.
8. 50 mM de Tris HCl : Dissoudre 0,079 g de Tris HCl dans 10 mL de DW et ajuster le pH à 7,0. Préparez-le dans un tube de 15 mL et conservez-le à -20 °C.
9. Ajouter 10 mg/mL de lysozyme : Ajouter 100 mg de lysozyme, 1 mL de 0,5 M EDTA (pH 8) et 1 mL de 1 M de Tris HCl (pH 8). Ajouter DW jusqu’à 10 mL dans un tube de 15 mL. Préparez-le fraîchement le jour de l’utilisation.
10. 10 000 unités/ml d’achromopeptidase : Dissoudre 0,011 g de 900 unités/mg d’achromopeptidase (voir le tableau des matières) dans 1 mL de DW, bien mélanger et conserver à -20 °C.
11. Solution de travail de 60 unités/mL d’achromopeptidase : Ajouter 3 μL de 10 000 unités/mL d’achromopeptidase dans 0,5 mL de 50 mM de Tris HCl. Préparez-le fraîchement le jour de l’utilisation.
12. Préparez une solution mère de tyramide 100x : Dissoudre le réactif de tyramide dans 150 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver à une température de 2 à 8 °C jusqu’à 6 mois.
13. 1x tampon de réaction : Ajouter 1 goutte de tampon de réaction 20x à 1 mL de DW. Il peut être remplacé par un tampon Tris, pH 7,4.
14. Solutions réactives d’arrêt de réaction
    1. Solution mère de réactif d’arrêt de réaction : Ajouter 1,45 mL d’éthanol à 95 % dans un flacon de réactif d’arrêt de réaction contenu dans le kit d’amplification du signal de tyramide (voir le tableau des matériaux). Conserver à -20 °C pendant 6 mois
    2. Solution de travail du réactif d’arrêt de réaction : diluer la solution mère de réactif d’arrêt de réaction (1:11) dans du PBS. Préparez-le fraîchement le jour de l’utilisation.
15. 100 x solution de H₂O₂ : Ajouter 1 goutte (environ 50 μL) de H₂O₂ à 1 mL de DW. Préparez-le fraîchement le jour de l’utilisation.
16. Solution de travail du tyramide (pour un volume final de 510 μL) : Ajouter 5 μL de 100 x solution mère de tyramide, 5 μL de 100 x solution H₂O₂ et 500 μL de 1 tampon de réaction dans un tube de 1,5 mL dans l’ordre mentionné, et bien mélanger doucement par pipetage. Préparez-le fraîchement le jour de l’utilisation.

3. Cellules de récolte

1. Récolter 10 mL de culture de C. watsonii dans un tube de 15 mL, prélever les cellules par centrifugation à 5 500 × g à 4 °C pendant 8 minutes et jeter le surnageant. Gardez les échantillons sur de la glace entre les procédures.
2. Remettez la pastille en suspension avec le surnageant restant, transférez le sous-échantillon remis en suspension dans un tube de 1,5 mL et ajoutez 1 mL de PBS au lavage. Prélever les cellules par centrifugation (5 500 × g, 4 °C, 5 min) et jeter le surnageant.

4. Fixation et conservation des cellules

1. Ajouter 1 mL de solution de PFA à 1 % et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.
2. Centrifuger les cellules à 5 500 × g, 4 °C, 5 min, retirer le surnageant à l’aide d’une pipette et le jeter dans la poubelle de déchets chimiques assignée, ajouter 1 mL de PBS et le remettre en suspension.
3. Centrifuger les cellules (5 500 × g, 4 °C, 5 min), prélever le surnageant à l’aide d’une pipette et le jeter. Ajouter 1 mL de méthanol à 100 % (maintenu à -20 °C) et remettre en suspension à l’aide d’un mélangeur vortex. Maintenir les sous-échantillons à -20 °C pendant 15 minutes à toute la nuit.

5. Perméabilisation et blocage

1. Centrifuger les cellules (5 500 × g, 4 °C, 5 min), prélever le surnageant (méthanol) à l’aide d’une pipette et le jeter dans la poubelle de déchets chimiques assignée, ajouter 1 mL de PBS et le remettre en suspension.
2. Centrifuger les cellules (5 500 × g, 4 °C, 5 min), prélever le surnageant à l’aide d’une pipette et le jeter, ajouter 1 ml de Triton X-100 à 0,2 % et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.
3. Centrifuger les cellules (5 500 × g, 4 °C, 5 min), retirer le surnageant Triton X-100 à l’aide d’une pipette et le jeter, ajouter 1 mL de PBS et le remettre en suspension.
4. Centrifuger les cellules (5 500 × g, 4 °C, 5 min), prélever le surnageant à l’aide d’une pipette, ajouter 0,5 mL de lysozyme (voir le tableau des matières) et 0,5 mL de PBG (étape 2.4), et incuber pendant 3 h à 37 °C.
5. Centrifuger les cellules (5 500 × g, 4 °C, 5 min), retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette et le jeter dans la poubelle prévue à cet effet, ajouter 0,5 mL de 60 unités d’achromopeptidase (étape 2.10) et 0,5 mL de PBG et incuber pendant 30 min à 37 °C.
6. Centrifuger les cellules (5 500 × g, 4 °C, 5 min), prélever le surnageant d’achromopeptidase à l’aide d’une pipette, le jeter dans la poubelle prévue à cet effet et ajouter la quantité nécessaire de PBS.
   REMARQUE : La quantité nécessaire doit être déterminée par le nombre de sous-échantillons à observer (un sous-échantillon est de 90 μL pour un cercle de ~2 cm de diamètre). S’assurer de préparer le(s) contrôle(s) négatif(s) ; sans 1er^{ni 2 e} anticorps, et sans 1^er anticorps.

6. Préparation des échantillons pour l’imagerie

1. Placez les échantillons sur une lame de verre et ajoutez le 1er anticorps²⁸.
   1. Dessinez deux cercles d’environ ~2 cm de diamètre sur un verre à diapositive recouvert de polylysine avec un marqueur à lames hydrofuge (voir le tableau des matériaux). Appliquez 90 μL de sous-échantillons dans les cercles. Sécher le sous-échantillon appliqué dans une hotte chimique. Cela prend environ 30-60 min.
   2. Réhydratez le sous-échantillon et lavez-le avec 90 μL de PBS, incubez pendant 2 min et jetez le PBS. Répétez les étapes 2 fois.
   3. Diluer le 1er^{anticorps 28} fois (1 mg ^mL-1) 200 fois dans une solution bloquant le PBG. Ajustez la quantité de solution en fonction du nombre d’échantillons.
      1. Appliquer 90 μL d’anticorps primaire (1^st)²⁸ sur chaque sous-échantillon, sauf le témoin négatif. Mettez du papier de soie distillé humide à l’eau dans une chambre, fermez-le par un couvercle et enveloppez-le avec du ruban adhésif. Incuber toute la nuit à 4 °C.
2. Appliquez le 2ème^anticorps .
   1. Retirez l’excès de 1^er anticorps en laissant la lame de verre se tenir sur son côté long sur du papier de soie, tournez-la pour faire remonter les cellules et ajoutez 0,2 % de Triton X-100 dans chaque cercle à l’aide d’une pipette et incubez 2 min pour rincer les cellules. Répétez 5 fois.
   2. Appliquez délicatement l’anticorps secondaire conjugué (2^e) (IgG de chèvre, anti-lapin) (voir le tableau des matières) et incubez pendant 60 minutes à température ambiante. Rincez doucement les cellules avec du PBS pendant 10 min ; Répétez 3 fois.
3. Amplification du signal Tyramide
   1. Ajouter 90 μL de solution de travail de tyramide sur les échantillons et incuber pendant 10 min à température ambiante. Jetez la solution en laissant la lame de verre reposer sur le côté long sur un papier de soie. Ajouter 90 μL de réactif d’arrêt de réaction et incuber pendant 3 min à température ambiante. Jetez la solution.
      REMARQUE : Le temps d’incubation doit être testé pour chaque protéine cible ou pour chaque microscope. Le temps d’incubation peut être raccourci, ou l’étape peut être omise pour observer l’allocation des protéines à l’aide d’un microscope confocal afin d’éviter la sursaturation du signal.
4. Rincez les cellules avec du PBS (5 fois) toutes les 30 min. Rincez les cellules avec DW. Retirez l’eau vivement. Ajoutez une goutte de support de montage (voir tableau des matériaux) et placez le verre de protection.
5. Appuyez doucement sur la vitre de protection pour enlever l’excès de support de montage et laissez-le sécher pendant environ 30 min. Scellez-le avec du vernis à ongles transparent et rangez-le dans l’obscurité.

7. Détection du signal de fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence

1. Mettez sous tension le microscope à fluorescence, l’ordinateur et la source de lumière UV. Ouvrez le logiciel de la caméra connectée au microscope (voir Tableau des matériaux). Configuré pour surveiller les images en direct. Éteignez la lumière dans la pièce.
   1. Insérez la lame de verre contenant les cellules sur la platine de l’échantillon. Utilisez l’objectif avec le plus petit grossissement et ajustez l’objectif et l’objectif du condenseur pour affiner la mise au point. Changez l’objectif pour des grossissements plus grands un par un.
   2. Mettez de l’huile d’immersion sur la vitre de protection et remplacez l’objectif par l’objectif d’immersion dans l’huile 100x. Couvrez la source lumineuse de la source lumineuse, sélectionnez le jeu de filtres DAPI pour l’analyse Tyramide-350 et ouvrez l’obturateur de lumière UV d’excitation.
   3. Testez 3-4 temps d’exposition et décidez du meilleur temps d’exposition sans sursaturation. Sélectionnez le jeu de filtres FITC pour l’observation de la phycoérythrine, répétez la procédure et décidez du meilleur temps d’exposition. Envisagez d’utiliser un gain accru ou un mode de binning sur la caméra pour accélérer la procédure et atténuer la dégradation du signal due à la phototoxicité. Redéfinissez le gain et le mode de binning pour l’acquisition d’images.
2. Sélectionnez le champ de vision, prenez un instantané pour une image en fond clair, une image de tyramide et une image de phycoérythrine avec le temps d’exposition sélectionné pour chaque image.

8. Détection au microscope confocal

1. Allumez le microscope confocal et l’ordinateur et démarrez le logiciel de microscopie. Chauffez le laser pendant 60 min. Éteignez la lumière dans la pièce. Placez la lame de verre contenant les cellules sur la platine de l’échantillon à l’aide d’huile d’immersion sur une lentille d’objectif.
2. Sélectionnez le laser 405 nm et réglez les séparateurs de faisceau principaux (MBS) 405. Réglez la puissance du laser sur 0,5 %. Réglez les paramètres de mesure pour obtenir une taille de pixel de 0,03 μm, zoom 10 (taille de l’image 512 x 512 pixels). Réglez le temps de séjour des pixels sur 0,02 ms, ce qui donne un temps de balayage total de 5,06 s.
3. Réglez la portée du détecteur de 410 nm à 695 nm sur le détecteur spectral GaAsP permettant une résolution spectrale de 9 nm. Réglez le gain optimal (800-900). Démarrez l’analyse lambda.
   REMARQUE : Le gain optimal doit être optimisé pour chaque microscope.

9. Quantifier l’intensité du signal à l’aide des Fidji

1. Ouvrez l’image capturée avec le filtre DAPI sous le microscope fluorescent. Sélectionnez des cellules dans l’image en champ clair et définissez la région d’intérêt (ROI). Après avoir défini le retour sur investissement de toutes les cellules, enregistrez-le.
2. Fermez l’image en fond clair et ouvrez l’image de fluorescence. Séparez l’image RVB en rouge, bleu et vert pour extraire le signal Tyramide-350.
3. Appliquez le retour d’intérêt préparé par l’image en champ clair à l’image bleue et mesurez l’intensité du signal²⁹. Enregistrez les résultats.

Le signal de fluorescence a été observé à partir de substances extracellulaires dans le contrôle négatif, où l’anticorps 1^er n’a pas été utilisé (Figure 1A-C). Le signal de fluorescence du réactif boosté par le tyramide, conjugué à la grande sous-unité de la protéine Rubisco (RbcL), a été détecté avec succès chez C. watsonii au microscope à fluorescence à l’aide d’un filtre ...

Pour les cyanobactéries, le système TSA a été largement utilisé dans l’hybridation in situ en fluorescence TSA (TSA-FISH, CARD-FISH), ciblant des ARNr spécifiques. Cependant, son application pour les protéines reste limitée²⁶. Dans cette étude, une procédure TSA a été appliquée pour permettre l’immunodétection de la cyanobactérie fixatrice de N₂ C. watsonii, en incorporant des modifications basées sur une référenc...

Nous confirmons qu’il n’y a aucun conflit d’intérêts lié à cette étude.

Nous remercions le Dr Radek Kana et Barbora Šedivá pour leur aide dans l’analyse microscopique confocale, ainsi que le Dr Roman Sobotka et le Dr Kateřina Bišová pour leurs conseils en immunodétection et en analyse par microscopie à fluorescence. Cette recherche a été soutenue financièrement par la Fondation tchèque pour la recherche GAČR (projet 20-17627S à OP et TM), le projet Mobility plus entre JSPS et l’Académie tchèque des sciences (JPJSBP 120222502), et JSPS KAKENHI (projet 23H02301).