ויזואליזציה אימונוציטוכימית של חלבונים מתאים ציאנובקטריאליים עם אוטופלואורסצנטיות גבוהה של פיקואריתרין ופיקורובילין

פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה והכימות של חלבון מסוים בתוך תאים ברמה התאית עבור הציאנובקטריום המכיל פיקואריתרין, Crocosphaera watsonii.

מוצג פרוטוקול להדמיה וכימות של חלבון ספציפי בתאים ברמה התאית עבור הציאנובקטריום הימי Crocosphaera watsonii, יצרן ראשוני חיוני ומקבע חנקן באוקיינוסים אוליגוטרופיים. אחד האתגרים עבור מקבעי N₂ אוטוטרופיים ימיים (דיאזוטרופים) הוא הבחנה בין אותות פלואורסצנטיים שמקורם בבדיקה לבין אוטופלואורסצנטיות. C. watsonii נבחר לייצג ציאנובקטריות המכילות כלורופיל, פיקואריתרין ופיקורובילין. הפרוטוקול מאפשר הדמיה פשוטה וכמותית למחצה של חלבונים ב-C. watsonii ברמת תא בודד, ומאפשר לחקור את ייצור החלבון בתנאי סביבה שונים כדי להעריך את הפעילות המטבולית של ציאנובקטריה המטרה. יתר על כן, שיטות הקיבוע והחדירה מותאמות כדי לשפר את אותות הקרינה מחלבוני המטרה כדי להבדיל ביניהם לבין אוטו-פלואורסצנטיות, במיוחד מפיקואריתרין ופיקורובילין. ניתן לדמיין את האות המשופר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי או רחב. בנוסף, עוצמת הקרינה כומתה למחצה באמצעות תוכנת פיג'י. זרימת עבודה זו של ניתוח תא בודד מאפשרת הערכה של וריאציות תא לתא של תכולת חלבון ספציפית. ניתן לבצע את הפרוטוקול בכל מעבדה למדעי החיים מכיוון שהוא דורש רק ציוד סטנדרטי וניתן להתאים אותו בקלות לתאים ציאנובקטריאליים אחרים המכילים פיקואריתרין.

השונות הפיזיולוגית מתא לתא (המכונה בדרך כלל "הטרוגניות") בפעילויות מטבוליות בתוך מיקרואורגניזמים, כולל ציאנובקטריה, תועדה באמצעות מחקרים על תרביות שיבוט 1,2,3,4. הטרוגניות זו כוללת פעילויות מטבוליות מגוונות כגון חלוקת תאים⁵, הטמעת פחמן ^6,7,8 והטמעת חנקן ^9,10. לדוגמה, מחקרים אחרונים הצביעו על כך שפעילות קיבוע N₂ בציאנובקטריה קולוניאלית C. watsonii ו-C. subtropica (Cyanothece) מציגה שונות ברמת תא בודד, נוכחת בתת-אוכלוסיות של תאים בעוד שהיא נעדרת באחרים בקהילה. יש לציין כי ספיגת החנקן או פעילויות קיבוע N₂ מציגות גם שונות בין תאים באתרם 11,12,13. ממצאים אלה אומתו על ידי ניתוחי איזוטופים יציבים ^{של 15}N שנערכו עם ספקטרומטר מסה של יחס איזוטופים (NanoSIMS)^14,15. עם זאת, למרות ש-NanoSIMS מציע דרך חדשה לניתוח הרכב איזוטופי ברמת התא הבודד, השימוש בו נותר מוגבל בשל המורכבות הטכנית והעלות שלו.

גישה חלופית לצפייה בהטרוגניות תוך-תאית בפעילויות מטבוליות היא באמצעות זיהוי חיסוני. דיווחים קודמים הדגימו את הזיהוי החיסוני של ניטרוגנאז בתאים בודדים, אך הדבר מציב אתגרים בשל האוטו-פלואורסצנציה הנפלטת מהפיגמנטים הפוטוסינתטיים שלהם 16,17,18. ציאנובקטריה ימית, במיוחד אלה המותאמים למי האוקיינוס כמו הדיאזוטרופים האוקייניים העיקריים C. watsonii ו-Trichodesmium, מכילים כמויות משמעותיות של פיקובילינים הפולטים אוטו-פלואורסצנטיות באורכי גל קצרים יותר: פיקואריתרין ופיקורובילין¹⁹. כדי לעקוף את האוטו-פלואורסצנציה הזו, פלואורוכרומים פולטי כחול עם עירור UV הועדפו למחקרי ציאנובקטריה 16,20,21. עם זאת, אסטרטגיה זו לא הניבה הצלחה באופן עקבי, שכן תאים שטופלו אך ורק בנוגדנים ראשוניים פלטו אוטופלואורסצנטיות כחולות חזקות עד צהובות-כחלחלות תחת עירור UV^20,21. נעשו מאמצים להפחית בעיה זו על ידי חשיפה של תאים לחשיפה לאור כחול או UV לפני התצפית ועל ידי שימוש בננו-גבישים מוליכים למחצה²². המחקר הנוכחי משתמש באסטרטגיה שונה המשפרת את אותות הקרינה של חלבונים באמצעות מערכת הגברת אותות טירמיד (TSA) כדי לדמיין חלבונים בעלי תכולה תאית נמוכה.

TSA, הידועה גם בשם תצהיר מדווח מזורז (CARD), היא שיטה אנזימטית רגישה ביותר המאפשרת זיהוי מטרות בשפע נמוך באימונוציטוכימיה. טכניקה זו ממנפת את הפעילות הקטליטית של פרוקסידאז כדי להפקיד קוולנטית טירמיד מסומן בסמיכות לחלבוני מטרה באתרם ^23,24. בנוכחות מי חמצן, פרוקסידאז מזרז את העיבוי החמצוני של טירמיד לרדיקלים טירמידים תגובתיים, אשר נקשרים לאחר מכן לחלקים עשירים באלקטרונים כגון טירוזין, פנילאלנין וטריפטופן²⁵. זה משפר את האותות עד פי 10 עד פי 200 בהשוואה לשיטות סטנדרטיות, מה שהופך את האות לזיהוי באמצעות טכניקות כרומוגניות או פלואורסצנטיות סטנדרטיות. כתוצאה מכך, טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה ובו זמנית של חלבונים מרובים לצד סמנים פנוטיפיים באוכלוסיות הטרוגניות ותת-קבוצות תאים נדירות. יש לציין כי נכון לעכשיו, המיזוג של תיוג חיסוני ומערכות TSA עבור ציאנובקטריה הוגבל למחקר יחיד שהדמיין סקסיטוקסין ב-Cylindrospermopsis raciborskii²⁶.

השיטה המתוארת כאן מאפשרת לחקור את ייצור החלבון בתנאי סביבה משתנים ברמת התא הבודד, ומאפשרת להעריך את הפעילות המטבולית בציאנובקטריית המטרה. הזמינות של זיהוי חלבון אימונופלואורסצנטי של תא שלם מאפשרת הדמיה מהירה וכמותית למחצה של חלבונים ב - C. watsonii ברמת התא הבודד. יתר על כן, ניתן להתאים שיטה זו בקלות לשימוש עם תאים ציאנובקטריאליים אחרים המכילים פיקורובילין ופיקואריתרין.

1. גידול ציאנובקטריה

1. לטפח תאי Crocosphaera watsonii PS0609 בצלוחיות Erlenmeyer או בפוטו-ביו-ריאקטורים במדיום YBCII²⁷. כדי לקבוע את צפיפות התרבית, מדוד את צפיפות התא בשיטה לבחירה (למשל, מיקרוסקופיה, ציטומטריית זרימה, מונה תאים וכו').
2. שמור על צפיפות התאים בין ~1 × 10⁴ ל ~ 5 × 10⁶ תאים מ"^ל-1.

2. הכנת ריאגנטים

1. שמור על 100% מתנול ב-20 מעלות צלזיוס.
2. תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS): ממיסים 1.36 גרם של KH₂PO₄, 1.42 גרם של Na₂HPO₄, 8.0 גרם NaCl ו-0.224 גרם של KCl ב-0.8 ליטר מים מזוקקים, ממלאים ל-1 ליטר, מכוונים את ה-pH ל-7.4 ומבצעים חיטוי (ראה טבלת חומרים).
3. 1% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS
   1. מוסיפים 50 מ"ל PBS לכוס זכוכית על צלחת ערבוב בקולט אדים מאוורר, מחממים אותה ל-60 מעלות צלזיוס ומערבבים באמצעות מערבל.
   2. הכניסו 0.5 גרם אבקת פרפורמלדהיד לתמיסת PBS המחוממת. העלו את ה-pH בהדרגה על ידי הזנת טפטוף של 1 N NaOH מפיפטה עד שהתמיסה הופכת לשקופה.לאחר שהפרפורמלדהיד התמוסס במלואו, הנמיכו את הטמפרטורה והמשיכו לסנן את התמיסה.
   3. התאם את עוצמת הקול של התמיסה ל -40 מ"ל עם PBS. התאימו את ה-pH עם כמויות קטנות של HCl מדולל לכ-6.9. שמור על התמיסה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
4. תמיסת חסימת PBG (0.2% ג'לטין + 0.5% אלבומין בסרום בקר; BSA, ראה טבלת חומרים)
   1. ממיסים 0.2 גרם ג'לטין ו -0.5 גרם BSA ב -100 מ"ל PBS בכוס זכוכית של 200 מ"ל. מחממים את התערובת ל-60 מעלות ומערבבים. לאחר מכן, הכניסו אותו לצינור של 15 מ"ל ואחסנו אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
5. 0.2% טריטון X-100 ב-PBS: הוסף 20 מיקרוליטר של טריטון X-100 ל-10 מ"ל של PBS. מכינים אותו בצינור של 15 מ"ל ושומרים אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
6. 0.5 מ' EDTA: ממיסים 1.46 גרם EDTA ל-10 מ"ל מים מזוקקים (DW) ומתאימים את ה-pH ל-8.0 (EDTA לא יתמוסס ב-pH <-8.0). מכינים אותו בצינור של 15 מ"ל ושומרים אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
7. 1 M Tris HCl: ממיסים 1.58 גרם של Tris HCl ל-10 מ"ל של DW ומתאימים את ה-pH ל-8.0. מכינים אותו בצינור של 15 מ"ל ושומרים אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
8. 50 מ"מ Tris HCl: ממיסים 0.079 גרם של Tris HCl ל-10 מ"ל של DW ומתאימים את ה-pH ל-7.0. מכינים אותו בצינור של 15 מ"ל ושומרים אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
9. הוסף 10 מ"ג/מ"ל ליזוזים: הוסף 100 מ"ג ליזוזים, 1 מ"ל של 0.5 M EDTA (pH 8) ו-1 מ"ל של 1 M Tris HCl (pH 8). הוסף DW עד 10 מ"ל לתוך צינור של 15 מ"ל. הכינו אותו טרי ביום השימוש.
10. 10,000 יחידות/מ"ל אכרומופפטידאז: ממיסים 0.011 גרם של 900 יחידות/מ"ג אכרומופפטידאז (ראה טבלת חומרים) ל-1 מ"ל DW, מערבבים היטב ושומרים ב-20 מעלות צלזיוס.
11. 60 יחידות/מ"ל אכרומופטידאז פתרון עבודה: הוסף 3 מיקרוליטר של 10,000 יחידות/מ"ל אכרומופפטידאז ב-0.5 מ"ל של 50 מ"ל Tris HCl. הכן אותו טרי ביום השימוש.
12. הכן תמיסת מלאי טירמיד פי 100: ממיסים את מגיב הטירמיד ב-150 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד (DMSO). יש לאחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
13. מאגר תגובה 1x: הוסף טיפה אחת של מאגר תגובה 20x ל-1 מ"ל DW. ניתן להחליף זאת במאגר Tris, pH 7.4.
14. פתרונות ריאגנטים לעצירת תגובה
    1. פתרון מלאי ריאגנט לעצירת תגובה: הוסף 1.45 מ"ל של 95% אתנול לבקבוקון אחד של מגיב עצירת תגובה הכלול בערכת הגברת אות טירמיד (ראה טבלת חומרים). יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים
    2. פתרון עבודה של מגיב עצירת תגובה: לדלל את תמיסת מלאי המגיב לעצירת התגובה (1:11) ב-PBS. הכינו אותו טרי ביום השימוש.
15. פתרון 100x H₂O₂ : הוסף טיפה אחת (כ-50 מיקרוליטר) של H₂O₂ ל-1 מ"ל של DW. הכינו אותו טרי ביום השימוש.
16. פתרון עבודה של טירמיד (לנפח סופי של 510 מיקרוליטר): הוסף 5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי טירמיד 100x, 5 מיקרוליטר של תמיסת 100x H₂O₂ , ו-500 מיקרוליטר של מאגר תגובה 1x לתוך צינור של 1.5 מ"ל בסדר הנ"ל, וערבב בעדינות היטב על ידי פיפטינג. הכינו אותו טרי ביום השימוש.

3. קצירת תאים

1. קצרו 10 מ"ל של תרבית C. watsonii לתוך צינור של 15 מ"ל, אספו תאים על ידי צנטריפוגה ב-5,500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות, והשליכו את הסופרנטנט. שמור את הדגימות על קרח בין ההליך.
2. השעו מחדש את הגלולה עם הסופרנטנט שנותר, העבירו את תת-הדגימה המושעה לצינור של 1.5 מ"ל והוסיפו 1 מ"ל PBS לכביסה. אוספים תאים על ידי צנטריפוגה (5,500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות), וזורקים את הסופרנטנט.

4. קיבוע ושימור תאים

1. מוסיפים 1 מ"ל של תמיסת PFA 1% ודוגרים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
2. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 5,500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות, הסר את הסופרנטנט על ידי פיפט והשליך אותו לפח הפסולת הכימית שהוקצה, הוסף 1 מ"ל PBS והשהה אותו מחדש.
3. צנטריפוגה את התאים (5,500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות), הסר את הסופרנטנט על ידי פיפט והשליך אותו. הוסף 1 מ"ל של 100% מתנול (נשמר ב-20 מעלות צלזיוס) והשהה מחדש באמצעות מערבל מערבולת. שמור את דגימות המשנה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עד לילה.

5. חדירות וחסימה

1. צנטריפוגה של התאים (5,500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות), הסר את הסופרנטנט (מתנול) על ידי פיפטה והשליך אותו לפח הפסולת הכימית שהוקצה, הוסף 1 מ"ל PBS והשהה אותו מחדש.
2. צנטריפוגה את התאים (5,500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות), הסר את הסופרנטנט על ידי פיפטה והשליך אותו, הוסף 1 מ"ל של 0.2% טריטון X-100 ודגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
3. צנטריפוגה את התאים (5,500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות), הסר את הסופרנטנט Triton X-100 על ידי פיפטה והשליך אותו, הוסף 1 מ"ל PBS והשעה אותו מחדש.
4. צנטריפוגה של התאים (5,500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות), הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה, הוסף 0.5 מ"ל ליזוזים (ראה טבלת חומרים) ו-0.5 מ"ל PBG (שלב 2.4), ודגירה למשך 3 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.
5. צנטריפוגה את התאים (5,500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות), הסר בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה והשליך אותו לפח אשפה שהוקצה, הוסף 0.5 מ"ל של 60 יחידות אכרומופפטידאז (שלב 2.10) ו-0.5 מ"ל PBG ודגירה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
6. צנטריפוגה של התאים (5,500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות), הסר את הסופרנטנט של אכרומופפטידאז באמצעות פיפטה, השליך אותו לפח האשפה שהוקצה והוסף את הכמות הדרושה של PBS.
   הערה: יש להחליט על הכמות הדרושה לפי מספר תת-הדגימות שיש לצפות בהן (תת-דגימה אחת היא 90 מיקרוליטר עבור מעגל בקוטר ~2 ס"מ). הקפד להכין בקרות שליליות; ללא^{נוגדן 1st} או 2, וללא נוגדן^1st.

6. הכנת דגימות להדמיה

1. מניחים דגימות על שקופית זכוכית ומוסיפים את הנוגדן הראשון²⁸.
   1. צייר שני עיגולים בקוטר של כ~2 ס"מ על זכוכית שקופיות מצופה פולי-ליזין עם עט סימון שקופיות דוחה נוזלים (ראה טבלת חומרים). מרחו 90 מיקרוליטר של תת-דגימות לתוך העיגולים. יבש את תת-הדגימה המיושמת במכסה מנוע כימי. הנסיעה אורכת כ-30-60 דקות.
   2. יש להחזיר לחות לתת-הדגימה ולשטוף אותה עם 90 מיקרוליטר PBS, לדגור למשך 2 דקות ולהשליך את ה-PBS. חזור על השלבים פעמיים.
   3. יש לדלל את^הנוגדן הראשון²⁸ פעמים (1 מ"ג מ^"ל-1) 200 פעמים בתמיסת חסימת PBG. התאם את כמות התמיסה בהתאם למספר הדגימות.
      1. יש למרוח 90 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני (1^st)²⁸ על כל תת-דגימה למעט בקרה שלילית. הכניסו נייר טישו רטוב במים מזוקקים לתא, סגרו אותו בכיסוי ועטפו אותו בנייר דבק. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. יש למרוח^נוגדן שני.
   1. הסר את^העודף של נוגדן 1 על ידי מתן אפשרות לשקופית הזכוכית לעמוד על צדה הארוך על נייר טישו, סובב אותה כדי להעלות את התאים למעלה, והוסף 0.2% טריטון X-100 לכל עיגול באמצעות פיפטה ודגירה 2 דקות כדי לשטוף את התאים. חזור על הפעולה 5 פעמים.
   2. יש למרוח בעדינות נוגדן משני מצומד (2^nd) של צנון פולי-סוסים (HRP) (עז, IgG נגד ארנב) (ראה טבלת חומרים), ולדגור למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים בעדינות את התאים עם PBS למשך 10 דקות; חזור על הפעולה 3 פעמים.
3. הגברת אות טירמיד
   1. הוסף 90 מיקרוליטר של תמיסת עבודה טירמיד על דגימות, ודגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השלך את התמיסה על ידי מתן אפשרות למגלשת הזכוכית לעמוד על הצד הארוך על נייר טישו. הוסף 90 מיקרוליטר של מגיב עצירת תגובה ודגירה למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הפתרון.
      הערה: יש לבדוק את זמן הדגירה עבור כל חלבון מטרה או עבור כל מיקרוסקופ. ניתן לקצר את זמן הדגירה, או להשמיט את הצעד כדי לצפות בהקצאת החלבון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כדי למנוע רוויה יתר של האות.
4. שוטפים את התאים עם PBS (5 פעמים) כל 30 דקות. שוטפים את התאים עם DW. הסר את המים במהירות. הוסף טיפה אחת של אמצעי הרכבה (ראה טבלת חומרים) והנח את זכוכית הכיסוי.
5. לחץ בעדינות על זכוכית הכיסוי כדי להסיר את אמצעי ההרכבה העודף והניח לו להתייבש כ-30 דקות. אטמו אותו עם לק שקוף ואחסנו אותו בחושך.

7. איתור אות פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

1. הפעל את המיקרוסקופ הקרינה, המחשב ומקור האור UV. פתח את התוכנה של המצלמה המחוברת למיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים). הגדר לניטור תמונות חיות. כבה את האור בחדר.
   1. הכנס את שקופית הזכוכית המכילה את התאים בשלב הדגימה. השתמש בעדשה עם ההגדלה הקטנה ביותר והתאם את עדשת המטרה והמעבה כדי לכוונן את המיקוד. שנה את העדשה להגדלות גדולות יותר בזו אחר זו.
   2. שים שמן טבילה על גבי זכוכית הכיסוי והחלף את העדשה לעדשת טבילת שמן 100x. כסה את מקור האור ממקור האור, בחר את ערכת מסנני ה-DAPI לניתוח Tyramide-350, ופתח את תריס אור ה-UV העירור.
   3. בדוק 3-4 זמני חשיפה והחליט על זמן החשיפה הטוב ביותר ללא רוויה יתר. בחר את ערכת מסנני FITC לתצפית פיקואריתרין, חזור על ההליך והחליט על זמן החשיפה הטוב ביותר. שקול להשתמש במצב רווח מוגבר או binning במצלמה כדי לזרז את ההליך ולהפחית את ירידת האות עקב פוטוטוקסיות. החזר את מצב הרווח וה-binning לרכישת תמונה.
2. בחר את שדה הראייה, צלם תמונת בזק לתמונת שדה בהיר, תמונת טירמיד ותמונת פיקואריתרין עם זמן החשיפה שנבחר עבור כל תמונה.

8. זיהוי במיקרוסקופ קונפוקלי

1. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי והמחשב והפעל תוכנת מיקרוסקופיה. מחממים את הלייזר למשך 60 דקות. כבה את האור בחדר. הנח את שקופית הזכוכית המכילה את התאים על הדגימה stage באמצעות שמן טבילה על עדשת אובייקטיבי.
2. בחר את הלייזר 405 ננומטר והגדר את מפצלי האלומה הראשית (MBS) 405. הגדר את עוצמת הלייזר ל-0.5%. הגדר את פרמטרי המדידה לקבלת גודל פיקסל של 0.03 מיקרומטר, זום 10 (גודל תמונה 512 x 512 פיקסלים). הגדר את זמן השהייה של הפיקסלים כ-0.02 אלפיות השנייה, מה שנותן זמן סריקה כולל ל-5.06 שניות.
3. הגדר את טווח הגלאי בין 410 ננומטר ל-695 ננומטר בגלאי ספקטרלי GaAsP המאפשר רזולוציה ספקטרלית של 9 ננומטר. הגדר את הרווח האופטימלי (800-900). התחל את סריקת הלמבדה.
   הערה: יש לבצע אופטימיזציה של הרווח האופטימלי עבור כל מיקרוסקופ.

9. לכמת את עוצמת האות באמצעות פיג'י

1. פתח את התמונה שצולמה עם מסנן DAPI מתחת למיקרוסקופ הפלורסנט. בחר תאים בתמונת השדה הבהיר והגדר את אזור העניין (ROI). לאחר הגדרת ההחזר על ההשקעה עבור כל התאים, שמור את ההחזר על ההשקעה.
2. סגור את תמונת השדה הבהיר ופתח את תמונת הקרינה. הפרד את תמונת ה-RGB לאדום, כחול וירוק כדי לחלץ את אות Tyramide-350.
3. החל החזר ROI שהוכן על ידי תמונת שדה בהיר על תמונה כחולה ומדוד את עוצמת האות²⁹. שמור את התוצאות.

אות הקרינה נצפה מחומרים חוץ-תאיים בביקורת השלילית, שם לא נעשה^{שימוש בנוגדנים} 1 (איור 1A-C). אות הקרינה של המגיב המוגבר על ידי טירמיד, מצומד לתת-היחידה הגדולה של חלבון Rubisco (RbcL), זוהה בהצלחה ב-C. watsonii תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעו?...

עבור ציאנובקטריה, מערכת ה-TSA מצאה שימוש נרחב בהכלאה של TSA-פלואורסצנטי באתרה (TSA-FISH, CARD-FISH), המכוונת ל-rRNA ספציפי. עם זאת, היישום שלו לחלבונים נותר מוגבל²⁶. במחקר זה, יושם נוהל TSA כדי לאפשר זיהוי חיסוני של תא שלם של ציאנובקטריום C. watsonii המקבע N₂, תוך שילו...

אנו מאשרים שאין ניגודי אינטרסים הקשורים למחקר זה.

אנו מעריכים את ד"ר ראדק קאנה וברבורה שדיווה על הסיוע בניתוח מיקרוסקופי קונפוקלי ואת ד"ר רומן סובוטקה וד"ר קטרינה בישובה על ייעוץ בזיהוי חיסוני וניתוח מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מחקר זה נתמך כספית על ידי קרן המחקר הצ'כית GAČR (פרויקט 20-17627S ל-OP ו-TM), פרויקט Mobility plus בין JSPS והאקדמיה הצ'כית למדעים (JPJSBP 120222502), ו-JSPS KAKENHI (פרויקט 23H02301).