Visualización inmunocitoquímica de proteínas de células cianobacterianas con alta autofluorescencia de ficoeritrina y ficourobilina

Este protocolo describe la visualización y cuantificación de una proteína particular dentro de las células a nivel celular para la cianobacteria que contiene ficoeritrina, Crocosphaera watsonii.

Se presenta un protocolo para visualizar y cuantificar una proteína específica en las células a nivel celular para la cianobacteria marina Crocosphaera watsonii, un productor primario y fijador de nitrógeno crucial en los océanos oligotróficos. Uno de los desafíos para los fijadores de N₂ autótrofos marinos (diazótrofos) es distinguir las señales de fluorescencia derivadas de la sonda de la autofluorescencia. C. watsonii fue seleccionada para representar cianobacterias que contienen clorofila, ficoeritrina y ficourobilina. El protocolo permite la visualización simple y semicuantitativa de las proteínas en C. watsonii a nivel de una sola célula, lo que permite la investigación de la producción de proteínas en diferentes condiciones ambientales para evaluar las actividades metabólicas de las cianobacterias objetivo. Además, los métodos de fijación y permeabilización están optimizados para mejorar las señales de fluorescencia de las proteínas diana para distinguirlas de la autofluorescencia, especialmente de la ficoeritrina y la ficourobilina. La señal mejorada se puede visualizar mediante microscopía de fluorescencia confocal o de campo amplio. Además, la intensidad de la fluorescencia se semicuantificó utilizando el software Fiji. Este flujo de trabajo de análisis de una sola célula permite la evaluación de variaciones de célula a célula del contenido de proteínas específicas. El protocolo se puede realizar en cualquier laboratorio de ciencias de la vida, ya que solo requiere un equipo estándar y también se puede adaptar fácilmente a otras células cianobacterianas que contengan ficoeritrina.

La variación fisiológica de célula a célula (comúnmente conocida como "heterogeneidad") en las actividades metabólicas dentro de los microorganismos, incluidas las cianobacterias, se ha documentado a través de estudios en cultivos de clones 1,2,3,4. Esta heterogeneidad abarca diversas actividades metabólicas como la división celular⁵, la asimilación de carbono ^6,7,8 y la asimilación de nitrógeno ^9,10. Por ejemplo, investigaciones recientes han indicado que la actividad de fijación de N₂ en las cianobacterias coloniales C. watsonii y C. subtropica (Cyanothece) exhibe variabilidad a nivel de una sola célula, estando presente en subpoblaciones de células mientras que está ausente en otras dentro de la comunidad. Cabe destacar que las actividades de absorción de nitrógeno o fijación de_N2 también exhiben variabilidad entre las células in situ 11,12,13. Estos hallazgos han sido corroborados por análisis de isótopos estables de ¹⁵N realizados con espectrómetros de masas de relación isotópica (NanoSIMS)^14,15. Sin embargo, a pesar de que NanoSIMS ofrece una nueva vía para analizar la composición isotópica a nivel de célula individual, su uso sigue siendo limitado debido a su complejidad técnica y costo.

Un enfoque alternativo para observar la heterogeneidad intracelular en las actividades metabólicas es a través de la inmunodetección. Informes anteriores han demostrado la inmunodetección de nitrogenasa en células individuales, pero esto plantea desafíos debido a la autofluorescencia emitida por sus pigmentos fotosintéticos 16,17,18. Las cianobacterias marinas, en particular las adaptadas a las aguas oceánicas, como los principales diazótrofos oceánicos C. watsonii y Trichodesmium, contienen cantidades sustanciales de ficobilinas que emiten autofluorescencia en longitudes de onda más cortas: ficoeritrina y ficourobilina¹⁹. Para eludir esta autofluorescencia, los fluorocromos emisores de azul con excitación UV han sido favorecidos para los estudios de cianobacterias 16,20,21. Sin embargo, esta estrategia no ha dado siempre buenos resultados, ya que las células tratadas únicamente con anticuerpos primarios emitieron una autofluorescencia de color azul fuerte a amarillo azulado bajo excitación UV^20,21. Se han realizado esfuerzos para mitigar este problema mediante el sometimiento de las células a la exposición a luz azul o ultravioleta antes de la observación y mediante el empleo de nanocristales semiconductores²². El presente estudio emplea una estrategia diferente que mejora las señales de fluorescencia de proteínas utilizando el sistema de amplificación de señal de tiramida (TSA) para visualizar proteínas con bajo contenido celular.

La TSA, también conocida como deposición reportera catalizada (CARD), es un método enzimático altamente sensible que permite la detección de objetivos de baja abundancia en inmunocitoquímica. Esta técnica aprovecha la actividad catalítica de la peroxidasa para depositar covalentemente tiramida marcada en las proximidades de las proteínas diana in situ^23,24. En presencia de peróxido de hidrógeno, la peroxidasa cataliza la condensación oxidativa de la tiramida en radicales tiramida reactivos, que luego se unen a partes ricas en electrones como la tirosina, la fenilalanina y el triptófano²⁵. Esto mejora las señales hasta 10 a 200 veces en comparación con los métodos estándar, lo que hace que la señal sea detectable a través de técnicas cromogénicas o fluorescentes estándar. En consecuencia, esta técnica facilita la evaluación rápida y simultánea de múltiples proteínas junto con marcadores fenotípicos en poblaciones heterogéneas y subconjuntos de células raras. Cabe destacar que, hasta ahora, la amalgama de sistemas de inmunomarcaje y TSA para cianobacterias se ha limitado a un solo estudio que visualizó la saxitoxina en Cylindrospermopsis raciborskii²⁶.

El método descrito en este documento permite la investigación de la producción de proteínas en condiciones ambientales variables a nivel de una sola célula, lo que permite la evaluación de las actividades metabólicas en las cianobacterias objetivo. La disponibilidad de la detección de proteínas de inmunofluorescencia de células completas permite una visualización rápida y semicuantitativa de las proteínas de C. watsonii a nivel de una sola célula. Además, este método se puede adaptar fácilmente para su uso con otras células cianobacterianas que contengan ficourobilina y ficoeritrina.

1. Cultivo de cianobacterias

1. Cultivo de células de Crocosphaera watsonii PS0609 en matraces Erlenmeyer o fotobiorreactores en medio YBCII²⁷. Para determinar la densidad del cultivo, mida la densidad celular utilizando un método de elección (por ejemplo, microscopía, citometría de flujo, contador de células, etc.).
2. Mantenga las densidades de celdas entre ~ 1 ×^{10 4} a ~ 5 × 10⁶ celdas ^mL-1.

2. Preparación de reactivos

1. Mantener el metanol al 100% a -20 °C.
2. Solución salina tamponada con fosfato (PBS): Disuelva 1,36 g de KH₂PO₄, 1,42 g de Na₂HPO₄, 8,0 g de NaCl y 0,224 g de KCl en 0,8 L de agua destilada, llene hasta 1 L, ajuste el pH a 7,4 y autoclave (consulte la Tabla de materiales).
3. 1% de paraformaldehído (PFA) en PBS
   1. Añadir 50 ml de PBS a un vaso de precipitados de vidrio en una placa de agitación en una campana ventilada, calentarlo a 60 °C y mezclar con un agitador.
   2. Introduzca 0,5 g de polvo de paraformaldehído en la solución de PBS calentada. Eleve gradualmente el pH alimentando por goteo 1 N NaOH de una pipeta hasta que la solución se vuelva transparente.Después de que el paraformaldehído se haya disuelto por completo, baje la temperatura y proceda a filtrar la solución.
   3. Ajuste el volumen de la solución a 40 mL con PBS. Ajuste el pH con pequeñas cantidades de HCl diluido a aproximadamente 6,9. Conservar la solución a -20 °C.
4. Solución bloqueante de PBG (0,2% gelatina + 0,5% albúmina sérica bovina; BSA, ver Tabla de Materiales)
   1. Disuelva 0,2 g de gelatina y 0,5 g de BSA en 100 ml de PBS en un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml. Calentar la mezcla a 60 °C y remover. A continuación, colóquelo en un tubo de 15 ml y guárdelo a -20 °C.
5. 0,2% Triton X-100 en PBS: Agregue 20 μL de Triton X-100 en 10 mL de PBS. Prepáralo en un tubo de 15 mL y consérvalo a -20 °C.
6. 0,5 M de EDTA: Disuelva 1,46 g de EDTA en 10 mL de agua destilada (DW) y ajuste el pH a 8,0 (el EDTA no se disolverá en pH < 8,0). Prepáralo en un tubo de 15 mL y consérvalo a -20 °C.
7. 1 M Tris HCl: Disuelva 1,58 g de Tris HCl en 10 mL de DW y ajuste el pH a 8,0. Prepáralo en un tubo de 15 mL y consérvalo a -20 °C.
8. 50 mM Tris HCl: Disuelva 0,079 g de Tris HCl en 10 mL de DW y ajuste el pH a 7,0. Prepáralo en un tubo de 15 mL y consérvalo a -20 °C.
9. Añadir 10 mg/mL de lisozima: Añadir 100 mg de lisozima, 1 mL de EDTA 0,5 M (pH 8) y 1 mL de Tris HCl 1 M (pH 8). Agregue DW hasta 10 mL en un tubo de 15 mL. Prepáralo fresco el día de su uso.
10. 10.000 unidades/mL de achromopeptidasa: Disolver 0,011 g de 900 unidades/mg de achromopeptidasa (ver Tabla de Materiales) en 1 mL de DW, mezclar bien y conservar a -20 °C.
11. 60 unidades/mL de solución de trabajo de achromopeptidasa: Añadir 3 μL de 10.000 unidades/mL de achromopeptidasa en 0,5 mL de 50 mM de Tris HCl. Prepararlo fresco el día de su uso.
12. Preparar 100 veces la solución madre de tiramida: Disuelva el reactivo de tiramida en 150 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). Almacenar a 2-8 °C durante un máximo de 6 meses.
13. 1x Tampón de reacción: Agregue 1 gota de tampón de reacción 20x a 1 mL de DW. Esto se puede reemplazar con tampón Tris, pH 7.4.
14. Soluciones de reactivos de parada de reacción
    1. Solución madre de reactivo de parada de reacción: Agregue 1,45 ml de etanol al 95% a un vial de reactivo de parada de reacción contenido en el kit de amplificación de señal de tiramida (consulte la tabla de materiales). Almacenar a -20 °C durante 6 meses
    2. Solución de trabajo del reactivo de parada de reacción: diluir la solución madre del reactivo de parada de reacción (1:11) en PBS. Prepáralo fresco el día de su uso.
15. Solución 100x H₂O₂ : Añadir 1 gota (aproximadamente 50 μL) de H₂O₂ a 1 mL de DW. Prepáralo fresco el día de su uso.
16. Solución de trabajo de tiramida (para un volumen final de 510 μL): Añadir 5 μL de solución madre de tiramida 100x, 5 μL de solución 100x H₂O₂ y 500 μL de tampón de reacción 1x en un tubo de 1,5 mL en el orden mencionado, y mezclar suavemente bien pipeteando. Prepáralo fresco el día de su uso.

3. Recolección de células

1. Recolectar 10 mL de cultivo de C. watsonii en un tubo de 15 mL, recolectar células por centrifugación a 5.500 × g a 4 °C durante 8 min y desechar el sobrenadante. Mantenga las muestras en hielo entre el procedimiento.
2. Vuelva a suspender el gránulo con el sobrenadante restante, transfiera la submuestra resuspendida a un tubo de 1,5 ml y agregue 1 ml de PBS al lavado. Recoja las células por centrifugación (5.500 × g, 4 °C, 5 min) y deseche el sobrenadante.

4. Fijación y conservación de células

1. Agregue 1 mL de solución de PFA al 1% e incube durante 15 min a temperatura ambiente.
2. Centrifugar las células a 5.500 × g, 4 °C, 5 min, retirar el sobrenadante por pipeta y desecharlo en el contenedor de residuos químicos asignado, añadir 1 mL de PBS y volver a suspenderlo.
3. Centrifugar las células (5.500 × g, 4 °C, 5 min), eliminar el sobrenadante con pipeta y desecharlo. Añadir 1 mL de metanol al 100% (mantenido a -20 °C) y volver a suspender con un mezclador de vórtice. Mantenga las submuestras a -20 °C durante 15 minutos o toda la noche.

5. Permeabilización y bloqueo

1. Centrifugar las células (5.500 × g, 4 °C, 5 min), retirar el sobrenadante (metanol) con pipeta y desecharlo en el contenedor de residuos químicos asignado, añadir 1 mL de PBS y volver a suspenderlo.
2. Centrifugar las células (5.500 × g, 4 °C, 5 min), retirar el sobrenadante con pipeta y desecharlo, añadir 1 mL de Triton X-100 al 0,2% e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
3. Centrifugar las células (5.500 × g, 4 °C, 5 min), retirar el sobrenadante Triton X-100 con pipeta y desecharlo, añadir 1 mL de PBS y volver a suspenderlo.
4. Centrifugar las células (5.500 × g, 4 °C, 5 min), eliminar el sobrenadante con una pipeta, añadir 0,5 mL de lisozima (ver Tabla de Materiales) y 0,5 mL de PBG (paso 2.4), e incubar durante 3 h a 37 °C.
5. Centrifugar las células (5.500 × g, 4 °C, 5 min), retirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y desecharlo en un contenedor de residuos asignado, añadir 0,5 mL de 60 unidades de achromopeptidasa (paso 2.10) y 0,5 mL de PBG e incubar durante 30 min a 37 °C.
6. Centrifugar las células (5.500 × g, 4 °C, 5 min), eliminar el sobrenadante acromopeptidasa con una pipeta, desecharlo en la papelera asignada y añadir la cantidad necesaria de PBS.
   NOTA: La cantidad necesaria debe decidirse por el número de submuestras que se van a observar (una submuestra es de 90 μL para un círculo de ~2 cm de diámetro). Asegúrese de preparar el control o los controles negativos; sin^1º ni^2º anticuerpo, y sin^1º anticuerpo.

6. Preparación de muestras para la obtención de imágenes

1. Coloque las muestras en un portaobjetos de vidrio y agregue el 1er anticuerpo²⁸.
   1. Dibuje dos círculos de aproximadamente ~ 2 cm de diámetro en un vidrio deslizante recubierto de polilisina con un rotulador repelente a líquidos (consulte la Tabla de materiales). Aplique 90 μL de submuestras en los círculos. Seque la submuestra aplicada en una campana química. Se tarda unos 30-60 min.
   2. Rehidratar la submuestra y lavarla con 90 μL de PBS, incubar durante 2 min y desechar el PBS. Repita los pasos 2 veces.
   3. Diluir el^1er anticuerpo²⁸ (1 mg ^mL-1) 200 veces en solución bloqueadora de PBG. Ajuste la cantidad de solución en función del número de muestras.
      1. Aplique 90 μL de anticuerpo primario (1^pt)²⁸ en cada submuestra, excepto en el control negativo. Coloque papel de seda destilado mojado en agua en una cámara, ciérrelo con una tapa y envuélvalo con cinta de injerto. Incubar durante la noche a 4 °C.
2. Aplicar^2º anticuerpo.
   1. Retire el exceso de 1^anticuerpo dejando que el portaobjetos de vidrio se apoye sobre su lado largo sobre papel de seda, gírelo para que suban las células y agregue Triton X-100 al 0,2% en cada círculo con una pipeta e incube 2 minutos para enjuagar las células. Repite 5 veces.
   2. Aplique suavemente el anticuerpo secundario (^2º) conjugado (cabra, IgG anti-conejo) conjugado con peroxidasa de rábano policaballo (HRP) (ver Tabla de materiales) e incubar durante 60 min a temperatura ambiente. Enjuague suavemente las células con PBS durante 10 minutos; Repita 3 veces.
3. Amplificación de señal de tiramida
   1. Añadir 90 μL de solución de trabajo de tiramida a las muestras e incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche la solución dejando que el portaobjetos de vidrio se quede en el lado largo sobre un papel de seda. Añada 90 μl de reactivo de parada de reacción e incube durante 3 minutos a temperatura ambiente. Deseche la solución.
      NOTA: El tiempo de incubación debe probarse para cada proteína objetivo o para cada microscopio. El tiempo de incubación se puede acortar o se puede omitir el paso para observar la asignación de proteínas utilizando un microscopio confocal para evitar la sobresaturación de la señal.
4. Enjuague las células con PBS (5 veces) cada 30 min. Enjuague las celdas con DW. Retira el agua enérgicamente. Agregue una gota de medio de montaje (consulte la Tabla de materiales) y coloque el cubreobjetos.
5. Presione suavemente el cubreobjetos para eliminar el exceso de medio de montaje y déjelo secar durante unos 30 minutos. Séllalo con esmalte de uñas transparente y guárdalo en la oscuridad.

7. Detección de la señal de fluorescencia mediante un microscopio de fluorescencia

1. Encienda el microscopio de fluorescencia, la computadora y la fuente de luz UV. Abra el software de la cámara conectada al microscopio (consulte la tabla de materiales). Configurado para monitorear imágenes en vivo. Apague la luz de la habitación.
   1. Inserte el portaobjetos de vidrio que contiene las células en la platina de la muestra. Utilice la lente con el aumento más pequeño y ajuste el objetivo y la lente de condensador para ajustar el enfoque. Cambie la lente a aumentos más grandes uno por uno.
   2. Coloque aceite de inmersión encima del vidrio de cobertura y cambie la lente a la lente de inmersión en aceite 100x. Cubra la fuente de luz de la fuente de luz, seleccione el conjunto de filtros DAPI para el análisis de Tyramide-350 y abra el obturador de luz UV de excitación.
   3. Pruebe 3-4 tiempos de exposición y decida el mejor tiempo de exposición sin sobresaturación. Seleccione el juego de filtros FITC para la observación de ficoeritrina, repita el procedimiento y decida el mejor tiempo de exposición. Contemple la posibilidad de utilizar un aumento de la ganancia o un modo de agrupación en la cámara para acelerar el procedimiento y mitigar la degradación de la señal debido a la fototoxicidad. Vuelva a establecer la ganancia y el modo de agrupación para la adquisición de imágenes.
2. Seleccione el campo de visión, tome una instantánea para obtener una imagen de campo brillante, una imagen de tiramida y una imagen de ficoeritrina con el tiempo de exposición seleccionado para cada imagen.

8. Detección bajo un microscopio confocal

1. Encienda el microscopio confocal y la computadora e inicie el software de microscopía. Calienta el láser durante 60 min. Apague la luz de la habitación. Coloque el portaobjetos de vidrio que contiene las células en la platina de la muestra utilizando aceite de inmersión en una lente de objetivo.
2. Seleccione el láser de 405 nm y configure los divisores de haz principal (MBS) 405. Ajuste la potencia del láser al 0,5%. Ajuste los parámetros de medición para obtener un tamaño de píxel de 0,03 μm, zoom 10 (tamaño de imagen 512 x 512 píxeles). Establezca el tiempo de permanencia de los píxeles en 0,02 ms, lo que da un tiempo total de escaneo de 5,06 s.
3. Establezca el rango del detector de 410 nm a 695 nm en el detector espectral GaAsP permitiendo una resolución espectral de 9 nm. Ajuste la ganancia óptima (800-900). Inicie el escaneo lambda.
   NOTA: La ganancia óptima debe optimizarse para cada microscopio.

9. Cuantificar la intensidad de la señal utilizando Fiji

1. Abra la imagen capturada con el filtro DAPI bajo el microscopio fluorescente. Seleccione las celdas de la imagen de campo claro y defina la región de interés (ROI). Después de definir el ROI para todas las celdas, guarde el ROI.
2. Cierre la imagen de campo claro y abra la imagen de fluorescencia. Separe la imagen RGB en rojo, azul y verde para extraer la señal Tyramide-350.
3. Aplique el ROI preparado por la imagen de campo claro a la imagen azul y mida la intensidad de la señal²⁹. Guarde los resultados.

La señal de fluorescencia se observó a partir de sustancias extracelulares en el control negativo, donde no se utilizó el^1er anticuerpo (Figura 1A-C). La señal de fluorescencia del reactivo potenciado con tiramida, conjugada con la subunidad grande de la proteína Rubisco (RbcL), se detectó con éxito en C. watsonii bajo un microscopio de fluorescencia utilizando un filtro DAPI con excitación UV (

En el caso de las cianobacterias, el sistema TSA ha encontrado un uso generalizado en la hibridación in situ de fluorescencia TSA (TSA-FISH, CARD-FISH), dirigida a ARNr específicos. Sin embargo, su aplicación para las proteínas sigue siendo limitada²⁶. En este estudio, se aplicó un procedimiento TSA para permitir la inmunodetección en células enteras de la cianobacteria C. watsonii, fijadora de N₂, incorporando modificaciones ba...

Confirmamos que no hay conflictos de intereses relacionados con este estudio.

Agradecemos al Dr. Radek Kana y Barbora Šedivá por su ayuda con el análisis microscópico confocal y al Dr. Roman Sobotka y la Dra. Kateřina Bišová por su asesoramiento en inmunodetección y análisis de microscopía de fluorescencia. Esta investigación contó con el apoyo financiero de la Fundación Checa de Investigación GAČR (proyecto 20-17627S a OP y TM), el proyecto Mobility plus entre JSPS y la Academia Checa de Ciencias (JPJSBP 120222502) y JSPS KAKENHI (proyecto 23H02301).