JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول تصور وقياس بروتين معين داخل الخلايا على المستوى الخلوي للبكتيريا الزرقاء المحتوية على phycoerythrin ، Crocosphaera watsonii.

Abstract

يتم تقديم بروتوكول لتصور وقياس بروتين معين في الخلايا على المستوى الخلوي للبكتيريا الزرقاء البحرية Crocosphaera watsonii ، وهو منتج أساسي مهم ومثبت نيتروجين في المحيطات قليلة التغذية يتمثل أحد التحديات التي تواجه مثبتات N2 ذاتية التغذية البحرية (الديازوتروف) في التمييز بين إشارات التألق المشتقة من المسبار والتألق الذاتي. C. watsonii تم اختياره لتمثيل البكتيريا الزرقاء المحتوية على الكلوروفيل والفيكوروبيلين والفيكوروبيلين. يسمح البروتوكول بالتصور البسيط وشبه الكمي للبروتينات في C. watsonii على مستوى الخلية الواحدة ، مما يتيح التحقيق في إنتاج البروتين في ظل ظروف بيئية مختلفة لتقييم الأنشطة الأيضية للبكتيريا الزرقاء المستهدفة. علاوة على ذلك ، تم تحسين طرق التثبيت والنفاذية لتعزيز إشارات التألق من البروتينات المستهدفة لتمييزها عن التألق الذاتي ، خاصة عن phycoerythrin و phycourobilin. يمكن تصور الإشارة المحسنة باستخدام الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر أو واسع المجال. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد كثافة التألق بشكل شبه كمي باستخدام برنامج فيجي. يسمح سير عمل التحليل أحادي الخلية هذا بتقييم الاختلافات من خلية إلى أخرى لمحتوى بروتين معين. يمكن تنفيذ البروتوكول في أي مختبر لعلوم الحياة لأنه لا يتطلب سوى معدات قياسية ويمكن أيضا تكييفه بسهولة مع خلايا البكتيريا الزرقاء الأخرى المحتوية على فيكوريثرين.

Introduction

تم توثيق التباين الفسيولوجي من خلية إلى أخرى (يشار إليه عادة باسم "عدم التجانس") في الأنشطة الأيضية داخل الكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك البكتيريا الزرقاء ، من خلال الدراسات التي أجريت على مزارع الاستنساخ1،2،3،4. يشمل هذا عدم التجانس أنشطة التمثيل الغذائي المتنوعة مثل انقسام الخلايا5 ، واستيعاب الكربون6،7،8 ، واستيعاب النيتروجين9،10. على سبيل المثال ، أشارت التحقيقات الحديثة إلى أن نشاط تثبيت N2 في البكتيريا الزرقاء الاستعمارية C. watsonii و C. subtropica (Cyanothece) يظهر تباينا على مستوى الخلية المفردة ، حيث يكون موجودا في مجموعات سكانية فرعية من الخلايا بينما يكون غائبا في الآخرين داخل المجتمع. والجدير بالذكر أن امتصاص النيتروجين أو أنشطة تثبيت N2 تظهر أيضا تباينا بين الخلايا في الموقع11،12،13. تم إثبات هذه النتائج من خلال تحليلات النظائر المستقرة 15N التي أجريت باستخدام مطياف كتلة نسبة النظائر (NanoSIMS) 14،15. ومع ذلك ، على الرغم من أن NanoSIMS تقدم وسيلة جديدة لتحليل التركيب النظيري على مستوى الخلية الفردية ، إلا أن استخدامها لا يزال مقيدا بسبب تعقيدها التقني وتكلفتها.

هناك نهج بديل لمراقبة عدم التجانس داخل الخلايا في أنشطة التمثيل الغذائي من خلال الكشف المناعي. أظهرت التقارير السابقة الكشف المناعي عن النيتروجيناز في الخلايا الفردية ، لكن هذا يشكل تحديات بسبب التألق الذاتي المنبعث من أصباغ التمثيل الضوئي16،17،18. تحتوي البكتيريا الزرقاء البحرية ، وخاصة تلك التي تتكيف مع مياه المحيطات مثل الديازوتروف المحيطي الرئيسي C. watsonii و Trichodesmium ، على كميات كبيرة من الفيكوبيلين التي تنبعث منها التألق الذاتي بأطوال موجية أقصر: phycoerythrin و phycourobilin19. للتحايل على هذا التألق الذاتي ، تم تفضيل الفلوروكرومات الباعثة من اللون الأزرق مع إثارة الأشعة فوق البنفسجية لدراسات البكتيرياالزرقاء 16،20،21. ومع ذلك ، لم تحقق هذه الاستراتيجية نجاحا باستمرار ، حيث انبعثت الخلايا المعالجة فقط بالأجسام المضادة الأولية من التألق الذاتي الأزرق القوي إلى الأصفر المزرق تحت إثارة الأشعة فوق البنفسجية20،21. تم بذل جهود للتخفيف من هذه المشكلة عن طريق تعريض الخلايا للضوء الأزرق أو الأشعة فوق البنفسجية قبل المراقبة واستخدام البلورات النانوية شبه الموصلة22. تستخدم الدراسة الحالية استراتيجية مختلفة تعزز إشارات مضان البروتين باستخدام نظام تضخيم إشارة التيراميد (TSA) لتصور البروتينات ذات المحتوى الخلوي المنخفض.

TSA ، المعروف أيضا باسم ترسيب المراسل المحفز (CARD) ، هو طريقة إنزيمية شديدة الحساسية تتيح اكتشاف الأهداف منخفضة الوفرة في الكيمياء المناعية. تستفيد هذه التقنية من النشاط التحفيزي للبيروكسيداز لترسيب التيراميد المسمى تساهميا بالقرب من البروتينات المستهدفة في الموقع23،24. في وجود بيروكسيد الهيدروجين ، يحفز البيروكسيديز التكثيف التأكسدي للتيراميد إلى جذور تيراميد تفاعلية ، والتي ترتبط بعد ذلك بالشقوق الغنية بالإلكترون مثل التيروزين والفينيل ألانين والتربتوفان25. هذا يعزز الإشارات بما يصل إلى 10 إلى 200 ضعف مقارنة بالطرق القياسية ، مما يجعل الإشارة قابلة للاكتشاف عبر تقنيات اللونية أو الفلورية القياسية. وبالتالي ، تسهل هذه التقنية التقييم السريع والمتزامن للبروتينات المتعددة جنبا إلى جنب مع علامات النمط الظاهري في مجموعات غير متجانسة ومجموعات فرعية من الخلايا النادرة. والجدير بالذكر أنه حتى الآن ، اقتصر دمج أنظمة الملصقات المناعية وأنظمة TSA للبكتيريا الزرقاء على دراسة واحدة تصور الساكسيتوكسين في Cylindrospermopsis raciborskii26.

تسمح الطريقة الموضحة هنا بالتحقيق في إنتاج البروتين في ظل ظروف بيئية متفاوتة على مستوى الخلية الواحدة ، مما يتيح تقييم أنشطة التمثيل الغذائي في البكتيريا الزرقاء المستهدفة. يسمح توافر الكشف عن بروتين التألق المناعي للخلية الكاملة بالتصور السريع وشبه الكمي للبروتينات في C. watsonii على مستوى الخلية الواحدة. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للاستخدام مع خلايا البكتيريا الزرقاء الأخرى التي تحتوي على فيكوروبيلين وفيكوريثرين.

Protocol

1. زراعة البكتيريا الزرقاء

  1. زراعة خلايا Crocosphaera watsonii PS0609 في قوارير Erlenmeyer أو المفاعلات الضوئية الحيوية في وسط YBCII27. لتحديد كثافة الثقافة ، قم بقياس كثافة الخلية باستخدام طريقة الاختيار (على سبيل المثال ، الفحص المجهري ، وقياس التدفق الخلوي ، وعداد الخلايا ، وما إلى ذلك).
  2. حافظ على كثافة الخلايا بين ~ 1 × 104 إلى ~ 5 × 106 خلايا مل ل-1.

2. تحضير الكواشف

  1. احتفظ ب 100٪ ميثانول عند -20 درجة مئوية.
  2. محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): قم بإذابة 1.36 جم من KH2PO4 ، و 1.42 جم من Na2HPO4 ، و 8.0 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.224 جم من KCl في 0.8 لتر من الماء المقطر ، واملأها إلى 1 لتر ، واضبط درجة الحموضة عند 7.4 وأتوكلاف (انظر جدول المواد).
  3. 1٪ بارافورمالديهايد (PFA) في PBS
    1. أضف 50 مل من PBS إلى دورق زجاجي على طبق تقليب في غطاء جيد التهوية ، وقم بتسخينه إلى 60 درجة مئوية ، واخلطه بواسطة النمام.
    2. أدخل 0.5 جم من مسحوق بارافورمالدهيد في محلول PBS الدافئ. ارفع درجة الحموضة تدريجيا عن طريق تغذية 1 N هيدروكسيد الصوديوم بالتنقيط من الماصة حتى يصبح المحلول شفافا.بعد ذوبان بارافورمالدهيد تماما ، اخفض درجة الحرارة واستمر في تصفية المحلول.
    3. اضبط حجم المحلول على 40 مل باستخدام PBS. اضبط الرقم الهيدروجيني بكميات صغيرة من حمض الهيدروكلوريك المخفف إلى 6.9 تقريبا. حافظ على المحلول عند -20 درجة مئوية.
  4. محلول حجب PBG (0.2٪ جيلاتين + 0.5٪ ألبومين مصل بقري ؛ BSA ، انظر جدول المواد)
    1. قم بإذابة 0.2 جم من الجيلاتين و 0.5 جم من BSA في 100 مل من PBS في دورق زجاجي سعة 200 مل. سخني الخليط إلى 60 درجة مئوية وقلبي. ثم قم بتقسيسه في أنبوب سعة 15 مل وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
  5. 0.2٪ Triton X-100 في PBS: أضف 20 ميكرولتر من Triton X-100 إلى 10 مل من PBS. قم بإعداده في أنبوب سعة 15 مل واحتفظ به عند -20 درجة مئوية.
  6. 0.5 م EDTA: قم بإذابة 1.46 جم من EDTA في 10 مل من الماء المقطر (DW) واضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0 (لن يذوب EDTA في الرقم الهيدروجيني < 8.0). قم بإعداده في أنبوب سعة 15 مل واحتفظ به عند -20 درجة مئوية.
  7. 1 M Tris HCl: قم بإذابة 1.58 جم من Tris HCl إلى 10 مل من DW واضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0. قم بإعداده في أنبوب سعة 15 مل واحتفظ به عند -20 درجة مئوية.
  8. 50 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك: قم بإذابة 0.079 جم من حمض الهيدروكلوريك في 10 مل من DW واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0. قم بإعداده في أنبوب سعة 15 مل واحتفظ به عند -20 درجة مئوية.
  9. أضف 10 مجم / مل من الليزوزيم: أضف 100 مجم من الليزوزيم ، و 1 مل من 0.5 م EDTA (درجة الحموضة 8) ، و 1 مل من 1 M Tris HCl (درجة الحموضة 8). أضف DW حتى 10 مل في أنبوب سعة 15 مل. قم بإعداده طازجا في يوم الاستخدام.
  10. 10,000 وحدة / مل من أكروموببتيداز: قم بإذابة 0.011 جم من 900 وحدة / ملغ من الأكروموببتيداز (انظر جدول المواد) إلى 1 مل من DW ، واخلطها جيدا ، وحفظها عند -20 درجة مئوية.
  11. 60 وحدة / مل محلول عمل أكروموبيبتيداز: أضف 3 ميكرولتر من 10,000 وحدة / مل من أكروموببتيداز في 0.5 مل من 50 ملي من Tris HCl. قم بإعداده طازجا في يوم الاستخدام.
  12. تحضير محلول مخزون التيراميد 100x: قم بإذابة كاشف التيراميد في 150 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يحفظ في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  13. 1x المخزن المؤقت للتفاعل: أضف قطرة واحدة من المخزن المؤقت للتفاعل 20x إلى 1 مل من DW. يمكن استبدال هذا بمخزن ثلاثي ، درجة الحموضة 7.4.
  14. حلول كاشف إيقاف التفاعل
    1. محلول مخزون كاشف إيقاف التفاعل: أضف 1.45 مل من 95٪ من الإيثانول إلى قارورة واحدة من كاشف إيقاف التفاعل الموجود في مجموعة تضخيم إشارة التيراميد (انظر جدول المواد). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر
    2. حل عمل كاشف إيقاف التفاعل: قم بتخفيف محلول مخزون كاشف إيقاف التفاعل (1:11) في PBS. قم بإعداده طازجا في يوم الاستخدام.
  15. محلول 100x H2O2 : أضف قطرة واحدة (حوالي 50 ميكرولتر) من H2O2 إلى 1 مل من DW. قم بإعداده طازجا في يوم الاستخدام.
  16. محلول عمل التيراميد (للحجم النهائي البالغ 510 ميكرولتر): أضف 5 ميكرولتر من محلول مخزون التيراميد 100x ، و 5 ميكرولتر من محلول 100x H2O2 ، و 500 ميكرولتر من محلول التفاعل 1x في أنبوب 1.5 مل بالترتيب المذكور ، واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات. قم بإعداده طازجا في يوم الاستخدام.

3. حصاد الخلايا

  1. احصد 10 مل من C. watsonii مزرعة في أنبوب سعة 15 مل ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 5,500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. احتفظ بالعينات على الجليد بين الإجراء.
  2. أعد تعليق الحبيبات مع المادة الطافية المتبقية ، وانقل العينة الفرعية المعلقة إلى أنبوب سعة 1.5 مل ، وأضف 1 مل من PBS إلى الغسيل. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (5,500 × جم ، 4 درجات مئوية ، 5 دقائق) ، وتخلص من المادة الطافية.

4. تثبيت الخلايا والحفاظ عليها

  1. أضف 1 مل من محلول PFA 1٪ واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 5,500 × جم ، 4 درجات مئوية ، 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية بواسطة الماصة والتخلص منها في سلة النفايات الكيميائية المخصصة ، وأضف 1 مل من PBS ، وأعد تعليقها.
  3. الطرد المركزي الخلايا (5,500 × جم ، 4 درجات مئوية ، 5 دقائق) ، قم بإزالة المادة الطافية بواسطة الماصة وتخلص منها. أضف 1 مل من الميثانول بنسبة 100٪ (يحفظ عند -20 درجة مئوية) وأعد تعليقه باستخدام خلاط دوامة. احتفظ بالعينات الفرعية عند -20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى ليلة كاملة.

5. النفاذية والحجب

  1. الطرد المركزي للخلايا (5,500 × جم ، 4 درجات مئوية ، 5 دقائق) ، وقم بإزالة المادة الطافية (الميثانول) بواسطة الماصة وتخلص منها في سلة النفايات الكيميائية المخصصة ، وأضف 1 مل من PBS ، وأعد تعليقها.
  2. الطرد المركزي للخلايا (5,500 × جم ، 4 درجات مئوية ، 5 دقائق) ، قم بإزالة المادة الطافية بواسطة الماصة والتخلص منها ، أضف 1 مل من 0.2٪ Triton X-100 واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. الطرد المركزي للخلايا (5,500 × جم ، 4 درجات مئوية ، 5 دقائق) ، قم بإزالة Triton X-100-supernatant بواسطة الماصة وتخلص منها ، أضف 1 مل من PBS وأعد تعليقها.
  4. الطرد المركزي للخلايا (5,500 × جم ، 4 درجات مئوية ، 5 دقائق) ، وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأضف 0.5 مل من الليزوزيم (انظر جدول المواد) و 0.5 مل من PBG (الخطوة 2.4) ، واحتضن لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
  5. الطرد المركزي للخلايا (5,500 × جم ، 4 درجات مئوية ، 5 دقائق) ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة وتخلص منها في صندوق نفايات مخصص ، أضف 0.5 مل من 60 وحدة من الأكروموبيبتيداز (الخطوة 2.10) و 0.5 مل من PBG واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. الطرد المركزي للخلايا (5,500 × جم ، 4 درجات مئوية ، 5 دقائق) ، وقم بإزالة المادة الطافية achromopeptidase باستخدام ماصة ، وتخلص منها في سلة النفايات المخصصة ، وأضف الكمية اللازمة من PBS.
    ملاحظة: يجب تحديد الكمية اللازمة من خلال عدد العينات الفرعية التي يجب ملاحظتها (عينة فرعية واحدة هي 90 ميكرولتر لدائرة قطرها ~ 2 سم). تأكد من إعداد عنصر تحكم سلبي ؛ بدون جسم مضاد 1ST ولا 2ND ، وبدونجسم مضاد 1.

6. تحضير العينات للتصوير

  1. ضع العينات على شريحة زجاجية وأضف الجسم المضاد الأول28.
    1. ارسم دائرتين قطرهما حوالي ~ 2 سم على زجاج منزلق مطلي بالبولي لايسين بقلم تحديد منزلق طارد للسوائل (انظر جدول المواد). ضع 90 ميكرولتر من العينات الفرعية في الدوائر. جفف العينة الفرعية المطبقة في غطاء كيميائي. يستغرق حوالي 30-60 دقيقة.
    2. أعد ترطيب العينة الفرعية واغسلها ب 90 ميكرولتر من PBS ، واحتضانها لمدة دقيقتين ، وتخلص من PBS. كرر الخطوات 2 مرات.
    3. تمييع الجسم المضاد 1st 28 (1 مجم مل -1) 200 مرة في محلول حجب PBG. اضبط كمية المحلول حسب عدد العينات.
      1. ضع 90 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي (1شت)28 على كل عينة فرعية باستثناء التحكم السلبي. ضع المناديل الورقية المبللة بالماء المقطر في غرفة ، وأغلقها بغطاء ، ولفها بشريط تطعيم. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  2. تطبيق 2الأجسام المضادة.
    1. قم بإزالة الفائض منالجسم المضاد 1 st عن طريق السماح للشريحة الزجاجية بالوقوف على جانبها الطويل على المناديل الورقية ، وقم بتدويرها لرفع الخلايا ، وأضف 0.2٪ Triton X-100 إلى كل دائرة باستخدام ماصة واحتضانها لمدة دقيقتين لشطف الخلايا. كرر 5 مرات.
    2. ضع بلطف الجسم المضاد الثانوي المترافق (2nd) الفجل (HRP) (الماعز ، IgG المضاد للأرانب) (انظر جدول المواد) ، واحتضانه لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. شطف الخلايا برفق مع PBS لمدة 10 دقائق ؛ كرر 3 مرات.
  3. تضخيم إشارة التيراميد
    1. أضف 90 ميكرولتر من محلول عمل التيراميد إلى العينات ، واحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المحلول عن طريق السماح للشريحة الزجاجية بالوقوف على الجانب الطويل على المناديل الورقية. أضف 90 ميكرولتر من كاشف إيقاف التفاعل واحتضنه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل الحل.
      ملاحظة: يجب اختبار وقت الحضانة لكل بروتين مستهدف أو لكل مجهر. يمكن تقصير وقت الحضانة ، أو يمكن حذف الخطوة لمراقبة تخصيص البروتين باستخدام مجهر متحد البؤر لتجنب تشبع الإشارة.
  4. اشطف الخلايا باستخدام PBS (5 مرات) كل 30 دقيقة. اشطف الخلايا باستخدام DW. قم بإزالة الماء بخفة. أضف قطرة واحدة من وسيط التركيب (انظر جدول المواد) وضع زجاج الغطاء.
  5. اضغط برفق على زجاج الغطاء لإزالة وسط التثبيت الزائد واتركه يجف لمدة 30 دقيقة تقريبا. أغلقه بطلاء أظافر شفاف واحفظه في الظلام.

7. الكشف عن إشارة التألق باستخدام المجهر الفلوري

  1. قم بتشغيل المجهر الفلوري والكمبيوتر ومصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. افتح برنامج الكاميرا المتصلة بالمجهر (انظر جدول المواد). اضبط لمراقبة الصور الحية. أطفئ الضوء في الغرفة.
    1. أدخل الشريحة الزجاجية التي تحتوي على الخلايا على مرحلة العينة. استخدم العدسة بأصغر تكبير واضبط عدسة الهدف والمكثف لضبط التركيز البؤري. قم بتغيير العدسة إلى تكبيرات أكبر واحدة تلو الأخرى.
    2. ضع زيت الغاطس أعلى زجاج الغطاء وقم بتغيير العدسة إلى عدسة الغمر بالزيت 100x. قم بتغطية مصدر الضوء من مصدر الضوء ، وحدد مجموعة مرشح DAPI لتحليل Tyramide-350 ، وافتح غالق ضوء الأشعة فوق البنفسجية للإثارة.
    3. اختبر 3-4 مرات تعرض وحدد أفضل وقت للتعرض دون الإفراط في التشبع. حدد مجموعة مرشح FITC لمراقبة phycoerythrin ، وكرر الإجراء ، وحدد أفضل وقت للتعرض. فكر في استخدام وضع زيادة الكسب أو التجميع على الكاميرا لتسريع الإجراء وتخفيف تدهور الإشارة بسبب السمية الضوئية. اضبط وضع الكسب والتجميع مرة أخرى للحصول على الصور.
  2. حدد مجال الرؤية، والتقط لقطة لصورة مجال ساطع، وصورة تيراميد، وصورة فيكوريثرين مع وقت التعريض المحدد لكل صورة.

8. الكشف تحت المجهر متحد البؤر

  1. قم بتشغيل المجهر متحد البؤر والكمبيوتر وابدأ تشغيل برنامج الفحص المجهري. سخني الليزر لمدة 60 دقيقة. أطفئ الضوء في الغرفة. ضع الشريحة الزجاجية التي تحتوي على الخلايا على مرحلة العينة باستخدام زيت الغمر على عدسة موضوعية.
  2. حدد ليزر 405 نانومتر واضبط مقسمات الشعاع الرئيسي (MBS) 405. اضبط طاقة الليزر على 0.5٪. اضبط معلمات القياس للحصول على حجم بكسل يبلغ 0.03 ميكرومتر ، تكبير 10 (حجم الصورة 512 × 512 بكسل). اضبط وقت سكون البكسل على 0.02 مللي ثانية ، مما يعطي إجمالي وقت المسح الضوئي على أنه 5.06 ثانية.
  3. اضبط نطاق الكاشف من 410 نانومتر إلى 695 نانومتر على الكاشف الطيفي GaAsP مما يتيح دقة طيفية تبلغ 9 نانومتر. اضبط الكسب الأمثل (800-900). ابدأ فحص لامدا.
    ملاحظة: يجب تحسين الكسب الأمثل لكل مجهر.

9. تحديد شدة الإشارة باستخدام فيجي

  1. افتح الصورة الملتقطة بمرشح DAPI تحت المجهر الفلوري. حدد الخلايا في صورة الحقل الساطع وحدد منطقة الاهتمام (ROI). بعد تحديد عائد الاستثمار لجميع الخلايا ، احفظ عائد الاستثمار.
  2. أغلق صورة المجال الساطع وافتح الصورة الفلورية. افصل صورة RGB إلى الأحمر والأزرق والأخضر لاستخراج إشارة Tyramide-350.
  3. قم بتطبيق عائد الاستثمار المحضر بواسطة صورة المجال الساطع على الصورة الزرقاء وقياس شدة الإشارة29. احفظ النتائج.

النتائج

لوحظت إشارة التألق من مواد خارج الخلية في التحكم السلبي ، حيث لم يتم استخدام الجسمالمضاد 1 (الشكل 1A-C). تم اكتشاف إشارة التألق للكاشف المعزز بالتيراميد ، المقترنة بالوحدة الفرعية الكبيرة لبروتين Rubisco (RbcL) ، بنجاح في C. watsonii تحت ا?...

Discussion

بالنسبة للبكتيريا الزرقاء ، وجد نظام TSA استخداما واسع النطاق في التهجين الموضعي لتقيؤ TSA (TSA-FISH ، CARD-FISH) ، مستهدفا الحمض النووي الريبي المرسال المحدد. ومع ذلك ، فإن تطبيقه على البروتينات لا يزالمحدودا 26. في هذه الدراسة ، تم تطبيق إجراء TSA لتمكين الكشف المنا...

Disclosures

نؤكد عدم وجود تضارب في المصالح تتعلق بهذه الدراسة.

Acknowledgements

نحن نقدر الدكتور راديك كانا وباربورا سيديفا للمساعدة في التحليل المجهري متحد البؤر والدكتور رومان سوبوتكا والدكتورة كاتيرينا بيشوفا على المشورة في الكشف عن المناعة وتحليل المجهر الفلوري. تم دعم هذا البحث ماليا من قبل مؤسسة البحوث التشيكية GAČR (المشروع 20-17627S إلى OP و TM) ، ومشروع التنقل بالإضافة إلى JSPS والأكاديمية التشيكية للعلوم (JPJSBP 120222502) ، و JSPS KAKENHI (المشروع 23H02301).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AchromopeptidaseFUJIFILM014-09661
Alexa Fluor350Thermo ScientificB40952Tyramide-350
Alexa Fluor405Thermo ScientificB48254Tyramide-405
Alexa Fluor488 Tyramide SuperBoost KitThermo ScientificB40922Goat anti-rabbit IgG
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
CentrifugeEppendorf5804 R
Centrifuge tubes (15 mL)VWR525-1085For harvesting cells
Confocal microscopeZeissLSM880 Equipped with Airyscan
Fluorescence microscopeOlympusBX51DAPI filter: Ex.360-370 nm, Em. 420-460 nm
GelatineMerk4070
High precision microscope cover glasses for confocal microscopeDeckgläserNo. 1.5H
Liquid Blocker Regular/MiniDaido Sangyo Co., Ltd.Part 6505For keeping the cells on the slide glass
LysozymeITW ReagentsA4972
MethanolCarl Roth67-56-1
Monopotassium PhosphatePenta12290
Monunting mediumSigma-Aldrich345789-20MLFluorSave Reagent
Mounting mediumVectashildH-1300
Objective lens used in the confocal microscopeZeissPlan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
Poly-lysine coated slide glassSigma-AldrichP0425-72EA
Potassium chloride Lach-Ner
Safe lock tube (1.5 mL)Eppendorf0030 120.086For treating cells and storing chemicals
Sodium chloride Penta16610
Sodium hydrogen phosphate Penta15130
Triton X-100Sigma-AldrichX100

References

  1. Ackermann, M. A functional perspective on phenotypic heterogeneity in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 13 (8), 497-508 (2015).
  2. Schreiber, F., Ackermann, M. Environmental drivers of metabolic heterogeneity in clonal microbial populations. Current Opinion in Biotechnology. 62, 202-211 (2020).
  3. Takhaveev, V., Heinemann, M. Metabolic heterogeneity in clonal microbial populations. Current Opinion in Microbiology. 45, 30-38 (2018).
  4. van Heerden, J. H., et al. Lost in transition: start-up of glycolysis yields subpopulations of nongrowing cells. Science. 343 (6174), 1245114 (2014).
  5. Lindemann, D., Westerwalbesloh, C., Kohlheyer, D., Grunberger, A., von Lieres, E. Microbial single-cell growth response at defined carbon limiting conditions. RSC advances. 9 (25), 14040-14050 (2019).
  6. Kotte, O., Volkmer, B., Radzikowski, J. L., Heinemann, M. Phenotypic bistability in Escherichia coli's central carbon metabolism. Molecular Systems Biology. 10 (7), 736 (2014).
  7. Nikolic, N., et al. Cell-to-cell variation and specialization in sugar metabolism in clonal bacterial populations. PLoS Genetics. 13 (12), 1007122 (2017).
  8. Solopova, A., et al. Bet-hedging during bacterial diauxic shift. The Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7427-7432 (2014).
  9. Schreiber, F., et al. Phenotypic heterogeneity driven by nutrient limitation promotes growth in fluctuating environments. Nature Microbiology. 1, 16055 (2016).
  10. Zimmermann, M., et al. Substrate and electron donor limitation induce phenotypic heterogeneity in different metabolic activities in a green sulphur bacterium. Environmental Microbiology Reports. 10 (2), 179-183 (2018).
  11. Masuda, T., et al. Heterogeneous N2 fixation rates confer energetic advantage and expanded ecological niche of unicellular diazotroph populations. Communications Biology. 3, 172 (2020).
  12. Mohr, W., Vagner, T., Kuypers, M. M., Ackermann, M., Laroche, J. Resolution of conflicting signals at the single-cell level in the regulation of cyanobacterial photosynthesis and nitrogen fixation. PLoS One. 8 (6), 66060 (2013).
  13. Polerecky, L., et al. Temporal patterns and intra- and inter-cellular variability in carbon and nitrogen assimilation by the unicellular cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Frontiers in Microbiology. 12, 620915 (2021).
  14. Berthelot, H., et al. NanoSIMS single cell analyses reveal the contrasting nitrogen sources for small phytoplankton. ISME Journal. 13, 651-662 (2019).
  15. Foster, R. A., Sztejrenszus, S., Kuypers, M. M. Measuring carbon and N2 fixation in field populations of colonial and free-living unicellular cyanobacteria using nanometer-scale secondary ion mass spectrometry. Journal of Phycology. 49 (3), 502-516 (2013).
  16. Lin, S., Henze, S., Lundgren, P., Bergman, B., Carpenter, E. J. Whole-cell immunolocalization of nitrogenase in marine diazotrophic cyanobacteria, Trichodesmium spp. Applied and Environmental Microbiology. 64, 3052-3058 (1998).
  17. Berman-Frank, I., et al. Segregation of nitrogen fixation and oxygenic photosynthesis in the marine cyanobacterium Trichodesmium. Science. 294, 1534-1537 (2001).
  18. El-Shehawy, R., Lugomela, C., Ernst, A., Bergman, B. Diurnal expression of hetR and diazocyte development in the filamentous non-heterocystous cyanobacterium Trichodesmium erythraeum. Microbiology. 149, 1139-1146 (2003).
  19. Webb, E. A., Ehrenreich, I. M., Brown, S. L., Valois, F. W., Waterbury, J. B. Phenotypic and genotypic characterization of multiple strains of the diazotrophic cyanobacterium, Crocosphaera watsonii, isolated from the open ocean. Environmental Microbiology. 11 (2), 338-348 (2009).
  20. Taniuchi, Y., Murakami, A., Ohki, K. Whole-cell immunocytochemical detection of nitrogenase in cyanobacteria: improved protocol for highly fluorescent cells. Aquatic Microbial Ecology. 51, 237-247 (2008).
  21. Ohki, K., Taniuchi, Y. Detection of nitrogenase in individual cells of a natural population of Trichodesmium using immunocytochemical methods for fluorescent cells. Journal of Oceanography. 65, 427-432 (2009).
  22. Orcutt, K. M., Ren, S., Gundersen, K. Detecting proteins in highly autofluorescent cells using quantum dot antibody conjugates. Sensors. 9 (9), 7540-7549 (2009).
  23. Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification: Application to immunoassays. Journal of Immunological Methods. 125, 279-285 (1989).
  24. Bobrow, M. N., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. II. Application to membrane immunoassays. Journal of Immunological Methods. 137, 103-112 (1991).
  25. Bobrow, M. N., Litt, G. J., Shaughnessy, K. J., Mayer, P. C., Conlon, J. The use of catalyzed reporter deposition as a means of signal amplification in a variety of formats. Journal of Immunological Methods. 150, 145-149 (1992).
  26. Piccini, C., Fabre, A., Lacerot, G., Bonilla, S. Combining immunolabeling and catalyzed reporter deposition to detect intracellular saxitoxin in a cyanobacterium. Journal of Microbiol Methods. 117, 18-21 (2015).
  27. Chen, Y. B., Zehr, J. P., Mellon, M. Growth and nitrogen fixation of the diazotrophic filamentous nonheterocystous cyanobacterium Trichodesmium sp. IMS 101 in defined media: evidence for a circadian rhythm. Journal of Phycology. 32, 916-923 (1996).
  28. Ohki, K. Intercellular localization of nitrogenase in a non-heterocystous cyanobacterium (Cyanophyte), Trichodesmium sp. NIBB1067. Journal of Oceanography. 64, 211-216 (2008).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. McKnight, P. E., Najab, J. Mann-Whitney U Test. The Corsini Encyclopedia of Psychology. , 1 (2010).
  31. Steel, R. G. D. Some rank sum multiple comparison tests. Biometrics. 17, 539-552 (1961).
  32. M, S. H. K., Lovric, M. Standard Deviation. International Encyclopedia of Statistical Science. , (2014).
  33. Gross, A. J., Sizer, I. W. The oxidation of tyramine, tyrosine, and related compounds by peroxidase. Journal of Biological Chemistry. 234 (6), 1611-1614 (1959).
  34. Eling, T. E., Thompson, D. C., Foureman, G. L., Curtis, J. F., Hughes, M. F. Prostaglandin H synthase and xenobiotic oxidation. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 30, 1-45 (1990).
  35. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry Part A. 77 (11), 1020-1031 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Crocosphaera Watsonii Phycoerythrin Phycourobilin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved