Method Article
Dieses Protokoll beschreibt, wie elektrische Aufzeichnungen von Säugetierspermien in einer Ganzzellkonfiguration durchgeführt werden, mit dem Ziel, die Aktivität der Ionenkanäle direkt aufzuzeichnen. Die Methode hat maßgeblich dazu beigetragen, die elektrophysiologischen Profile mehrerer Ionenkanäle der Spermien zu beschreiben und ihre molekulare Identität und Regulation aufzudecken.
Die Erfassung der elektrischen Aktivität einer der kleinsten Zellen eines Säugetierorganismus - einer Samenzelle - ist seit vielen Jahrzehnten eine herausfordernde Aufgabe für Elektrophysiologen. Die Methode, die als "Spermatozoen-Patch-Clamp" bekannt ist, wurde 2006 eingeführt. Es hat die direkte Aufzeichnung der Ionenkanalaktivität in Ganzzell- und zellgebundenen Konfigurationen ermöglicht und war maßgeblich an der Beschreibung der Physiologie der Spermien und der molekularen Identität verschiedener Kalzium-, Kalium-, Natrium-, Chlorid- und Protonenionenkanäle beteiligt. Die Aufzeichnung von einzelnen Spermien erfordert jedoch fortgeschrittene Fähigkeiten und eine Ausbildung in Elektrophysiologie. Dieses detaillierte Protokoll fasst das Schritt-für-Schritt-Verfahren zusammen und zeigt einige "Tricks auf", um es jedem zugänglich zu machen, der die faszinierende Physiologie der Samenzelle erforschen möchte. Insbesondere beschreibt das Protokoll die Aufzeichnung von menschlichen und murinen Samenzellen, kann aber im Wesentlichen an jede Säugetiersamenzelle jeder Spezies angepasst werden. Das Protokoll behandelt wichtige Details der Anwendung dieser Technik, wie z.B. die Isolierung von Samenzellen, die Auswahl von Reagenzien und Geräten, die Immobilisierung der hochbeweglichen Zellen, die Bildung der dichten (Gigaohm) Dichtung zwischen einer Aufzeichnungselektrode und der Plasmamembran der Samenzellen, den Übergang in den Ganzspermienmodus (auch bekannt als Break-in) und beispielhafte Aufzeichnungen des Kalziumionenkanals der Spermienzelle. CatSper, von sechs Säugetierarten. Die Vorteile und Grenzen der Spermien-Patch-Clamp-Methode sowie die wichtigsten Schritte werden besprochen.
Ähnlich wie die traditionelle Patch-Klemme, die von Erwin Neher und Bert Sakmannerfunden wurde 1, ermöglicht die Spermien-Patch-Klemme die Abfrage der Aktivität einzelner Ionenkanäle sowie die Aufzeichnung der Aktivität der gesamten Ionenkanalpopulation innerhalb der einzelnen Zelle 2,3. Die Methode ermöglicht die Identifizierung eines spezifischen Ionenkanaltyps unter Abkopplungsgraden von enzymatischen intrazellulären Prozessen. Diese Methode ist entscheidend für die Bestimmung der Ionenkanalaktivität auf der Grundlage ihrer elektrophysiologischen und pharmakologischen Fingerabdrücke und bietet daher eine zuverlässige Identifizierungsstrategie. Der Nachteil der Methode ist, dass sie nicht in der Lage ist, nicht-elektrogene Transporter nachzuweisen. Darüber hinaus ist ein grundlegendes elektrophysiologisches Training hilfreich, um die Feinheiten des Protokolls zu verstehen. Um die Patch-Clamp-Technik zu beherrschen und sie auf Säugetierspermien anzuwenden, empfehlen wir das Studium der grundlegenden Patch-Clamp-Literatur 4,5. In diesem Artikel bieten wir eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung und heben einzigartige Praktiken hervor, die diese Technik leicht verständlich und für jeden zugänglich machen, der die Elektrophysiologie der Spermien praktizieren möchte.
Die Ionenhomöostase ist eine wesentliche physiologische Funktion von Spermien, die stark auf Ionenkanäle und Ionentransporter angewiesen ist, um physiologisch wichtige Ionengradienten aufrechtzuerhalten, intrazelluläres Kalzium zu variieren und die Transmembranspannung zu ändern. Ionenkanäle und Ionentransporter regulieren essentielle Funktionen der Spermien wie Beweglichkeit, Navigation im weiblichen Fortpflanzungstrakt, Spermienreifung und in Meeresorganismen die Chemotaxis zur Eizelle 6,7,8,9,10,11,12 . Die Beweglichkeit der Spermien ist ein allmählich erworbener Prozess. Die Samenzellen sind während ihrer Reifung im Hoden und während ihrer anschließenden Passage durch den Nebenhoden hauptsächlich ruhig. Ihre Beweglichkeit wird durch ein saures Nebenhodenmilieu gehemmt, was zu einer inneren Übersäuerung der Samenzelle führt. Dies beeinträchtigt die Funktion des Axonems, da es unterhalb eines pH-Werts von 6,013,14 nicht mehr funktionieren kann. Bei Exposition gegenüber der Samenflüssigkeit oder einer alkalischeren Umgebung ändern sich jedoch die intrazellulären Ionenkonzentrationen der Spermien und der zytoplasmatische pH-Wert erheblich, und das Spermium wird beweglich 15,16,17. Die Bewegung des Spermienflagellums wird durch die ATP-Hydrolyse angetrieben, die das Gleiten der axonemalen Mikrotubuliunterstützt 18, und dieser Prozess ist stark pH-abhängig14. Zusätzlich wird die Flagellenbewegung auch durch eine Erhöhung von intraflagellärem Calcium und cAMP 13,19,20,21,22,23,24 gesteuert. Diese Faktoren, d.h. die intrazelluläre Kalziumkonzentration der Spermien [Ca2+]i, pH, ATP und cAMP, sind die wichtigsten Regulationsmechanismen, die Änderungen der Motilität ermöglichen, und ihre Konzentrationen werden durch die Ionenkanäle und Transporter der Spermien streng reguliert.
Samenzellen sind insofern einzigartig, als sie eine Reihe von Proteinen exprimieren, die nirgendwo sonst im Körper zu finden sind. Bemerkenswerte Beispiele sind Spermienionenkanäle, wie der Kaliumkanal, Slo3 25,26,27,28,29 und der Cat-Ionenkanalvon Sperm, CatSper 2,30,31,32. Letzteres ist der Hauptkalziumkanal der Säugetierspermien31 und wird durch die intrazelluläre Alkalisierung 2,30,31,32,33,34 reguliert. CatSper wird auch durch speziesspezifische Signale reguliert 7,35 und ist in vierseitigen longitudinalen Nanodomänen entlang des Spermienflagellumsorganisiert 36,37,38. Bei Primaten wird CatSper durch eine Kombination aus flagellärer Alkalinität, Membrandepolarisation und Progesteronaktiviert 3,39,40,41, während für die Aktivierung von CatSper bei Mäusen kein Progesteron erforderlich ist 2,39. Eine weitere Besonderheit dieses Kanals ist seine Organisation mit mehreren Untereinheiten: CatSper ist ein Komplex aus mindestens 10 verschiedenen Untereinheiten 31,32,34,37,38,42,43,44,45,46,47 . Solch eine ausgeklügelte Struktur und Spezifika seiner Regulation behinderten die rekombinante Expression von CatSper in jedem bekannten heterologen Expressionssystem, und daher war die physiologische Charakterisierung von CatSper auf sein natives Expressionssystem - die Spermzelle - beschränkt. Während die molekulare Charakterisierung des CatSper-Proteins im Jahr 2000 von D. Ren et. al.31, der endgültige Beweis, dass CatSper ein echter Ionenkanal ist, war erst nach der Einführung der Spermien-Patch-Clamp-Methode im Jahr 2006 möglich2. Seitdem ermöglichte diese Technik eine präzise Charakterisierung vieler ionenleitender Signalwege in den Spermien 9,28,37,39,40,44,46,48-54.
Die klassische und einfachste Methode zur Untersuchung der Eigenschaften von Ionenkanälen - die Patch-Clamp-Technik - galt aufgrund ihrer Beweglichkeit und spezifischen Morphologie als nicht anwendbar auf Spermien (Abbildung 1A). Insbesondere das winzige Volumen des Zytoplasmas der Spermien und die enge Bindung der Plasmamembran der Spermien an die starren intrazellulären Strukturen wie die fibröse Scheide und den Zellkern der Spermien waren die größten Herausforderungen55. Diese beiden strukturellen Merkmale führen zu einer schlanken, pfeilförmigen Zelle, die so konzipiert ist, dass sie hochviskose Umgebungen wie die schützenden Gewänder von Eiern durchdringt, ohne die Plasmamembran signifikant zu verformen oder zu beschädigen.
Der erste Schritt der Patch-Clamp-Methode ist die Herstellung der dichten Versiegelung zwischen einer Aufzeichnungspipette (einer Glasmikropipette) und der Zellplasmamembran. Um dies zu erreichen, muss man so viel Plasmamembran in die Aufzeichnungspipette ziehen, dass sich zwischen der Plasmamembran und dem Glas ein mechanisch stabiler Gigaseal bildet. Die Plasmamembran muss flexibel und nicht starr sein (Abbildung 1B). Wie oben erwähnt, ist die gesamte Oberfläche der Plasmamembran der Spermien ziemlich fest verklebt, mit Ausnahme der Region, die als zytoplasmatisches Tröpfchen bekannt ist (Abbildung 1A und Abbildung 2). Daher wurde die starre Beschaffenheit der Plasmamembran der Spermien als Haupthindernis für die Erlangung der dichten Versiegelung oder des "Gigaseals" angesehen, der so genannt wird, weil >109 Ohm für gute Aufnahmen erforderlich sind. Mit der Einführung der Spermien-Patch-Clamp-Technik im Jahr 20062 wurde diese Barriere jedoch beseitigt, und diese Methode konnte erfolgreich auf Samenzellen mehrerer Säugetierarten angewendet werden 2,41,51,56. Dieser Durchbruch wurde durch die Fokussierung auf das zytoplasmatische Tröpfchen (CD)2,8 erreicht, eine winzige Struktur, die sich entlang des Mittelstücks des Spermiums befindet (Abbildung 1A und Abbildung 2) und einfach der Überrest der länglichen Spermatide ist - ein Vorläufer von Samenzellen, aus dem sich der Kopf und der Schwanz entwickeln. Funktionell kann es der Zelle helfen, sich an Veränderungen der extrazellulären Osmolarität während der Ejakulation anzupassen. Das wichtige Merkmal ist, dass die Plasmamembran innerhalb der CD flexibel genug ist, um in die Pipette gezogen zu werden, um eine Gigaohm-Dichtung zu bilden. Somit ist die Spermien-CD der beste Teil auf der Spermienoberfläche, durch den man eine erfolgreiche Gigaseal-Bildung und einen Übergang in einen Ganzzellmodus erreichen kann, der die Samenzelle schließlich elektrisch an einen Patch-Clamp-Verstärker koppelt 2,8. Es ist erwähnenswert, dass frühere Veröffentlichungen über eine erfolgreiche Gigasealbildung am Spermienkopf berichteten, was die Aufzeichnung in der zellgebundenen Konfiguration 54,57,58,59 ermöglicht. Die Aufzeichnungen in Ganzzellkonfiguration wurden bisher jedoch nur durch die Durchführung von Gigaseal-Bildung in der CD-Region berichtet. Dieser Ganzzellmodus ermöglicht den elektrischen Zugang zum gesamten Volumen der Spermien und ermöglicht somit die Detektion von Ionenkanalaktivitäten, die sich auf dem Spermienflagellum sowie auf dem Spermienkopf befinden. In den letzten Jahren seit ihrer Entwicklung hat die Spermien-Patch-Clamp-Technik zu enormen Fortschritten in unserem Verständnis der Spermien-Ionenkanäle geführt und ist bisher eine der robustesten Techniken, um die Funktionalität der Spermien-Ionenkanäle direkt zu untersuchen 9,28,37,39,40,44,46,48,49, 50,51,52,53 (Abbildung 1).
Die Spermien-Patch-Klemme unterscheidet sich in einigen Details von der klassischen Patch-Clamp-Technik, wie unten beschrieben. Erstens ist der größte Teil der Plasmamembran der Spermien fest mit der starren intrazellulären Struktur verbunden, und daher haben Spermien fast keine "überschüssige" Plasmamembran, die in die Pipette gezogen werden kann. Die einzige Region, die flexibel ist, ist die Membran der Zöliakie, die der Plasmamembran vieler Körperzellen ähnelt und daher leicht in die Pipette gezogen werden kann. Um eine Gigaohm-Dichtung mit der CD zu bilden, wird durch leichten Sog an der Oberseite der Pipette ein Unterdruck erzeugt, um einen kleinen Teil der Spermienplasmamembran in die Spitze der Mikropipette zu ziehen (Abbildung 1B). Dieser Teil der Membran bildet eine Ω-förmige Einstülpung in die Spitze der Pipette und sorgt für einen dichten Verschluss mit seinen Innenwänden.
Zweitens liegt die Größe des zytoplasmatischen Tröpfchens in menschlichen und Maus-Spermien zwischen 1 und 2 μm (Abbildung 1 und Abbildung 2). Daher erfordert die Anwendung der Patch-Clamp-Technik auf ein so kleines Objekt eine hochauflösende Optik. Die meisten Spermien-Patch-Clamp-Rigs sind mit einem inversen Mikroskop mit differentiellem Interferenzkontrast (DIC) oder optischen Nomarski-Komponenten ausgestattet (Abbildung 2 und Abbildung 3). Die Verwendung eines Mikroskops, das mit einer DIC-Optik für die Spermien-Patch-Klemme ausgestattet ist, wird gegenüber herkömmlichen Phasenkontrastoptiken dringend empfohlen, da die räumlichen Informationen, die in DIC zu sehen sind, dazu beitragen, eine überlegene Präzision bei der Positionierung einer Patch-Pipette auf der winzigen CD zu erreichen. Wir empfehlen auch die Verwendung eines 60-fachen Wasserimmersionsobjektivs oder eines ähnlichen Objektivs mit einer numerischen Apertur von 1,2. Dieses Objektiv hat einen großen Arbeitsabstand (0,28 mm), der die Beobachtung von frei schwimmenden Spermien in Lösung ermöglicht (Abbildung 2). Das Objektiv verfügt außerdem über einen Einstellkragen zur Anpassung an die Dicke des Deckglases (variabel von 0,13 bis 0,21 mm). Diese Kombination aus dem großen Arbeitsabstand und dem Einstellkragen ermöglicht die Beobachtung durch zwei 0,13 mm Abdeckgläser; Ein Deckglas dient als Glasboden der Aufnahmekammer, und das 5 mm Deckglas mit den abgelagerten Spermien wird darauf gelegt. Wie weiter unten diskutiert, ist das Ablegen von Samenzellen auf leicht austauschbaren runden 5-mm-Deckgläsern und nicht direkt auf dem Boden der Aufnahmekammer eine bequeme Möglichkeit, frische Samenzellen in die Aufnahmekammer zu laden.
Drittens muss das Spermien-Patch-Clamp-Rig mit einem rauscharmen Patch-Clamp-Verstärker und einem Digitizer ausgestattet sein, um winzige elektrische Ströme (Picoampere-Bereich) und winzige Änderungen des Membranpotentials aufzuzeichnen. Dieses Gerät muss das geringste Verstärkerrauschen gewährleisten. Die Abwesenheit von Vibrationen ist ein wesentlicher Bestandteil einer erfolgreichen Patch-Clamp-Aufnahme. Für die Klemmung von Spermienpflastern ist ein driftfreier, präziser Mikromanipulator erforderlich, der mit einer Mikromanipulatorplattform am inversen Mikroskop befestigt werden kann, um eine bessere Stabilität als ein unabhängiges Mikromanipulatorstativ zu gewährleisten (Abbildung 3A). Um den Aufbau zu testen, sollte man keine Bewegung der Pipettenspitze (unter 60-facher Vergrößerung) sehen, selbst wenn eine Person in der Nähe des Schwingungsisolationstisches auf dem Boden auf und ab springt.
Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für Tierversuche durchgeführt und vom UC Berkeley Animal Care and Use Committee (AUP 2015-07-7742) genehmigt, wobei alle Anstrengungen unternommen wurden, um das Leiden der Tiere zu minimieren. Alle beschriebenen Methoden stehen im Einklang mit den Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie der American Veterinary Medical Association und des IACUC-Ausschusses. Alle experimentellen Verfahren mit menschlichen Proben wurden vom Committee on Human Research an der University of California, Berkeley, unter der IRB-Protokollnummer 2013-06-5395 genehmigt.
1. Herstellung von Mikropipetten aus Glas für die Aufzeichnung von Ganzzellspermien mit Patch-Clamp.
HINWEIS: Die geringe Größe des zytoplasmatischen Tröpfchens erfordert Mikropipetten aus Glas mit feinen Spitzen.
2. Einrichten des Rigs
3. Isolierung und Reinigung von Säugetierspermien
HINWEIS: Ethanasieren Sie C57BL/6 männliche Mäuse im Alter von 3-6 Monaten durch Einatmen von CO2, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation. Nach einer Zervixluxation ist sofort eine Gewebeentnahme (Cauda oder Corpus Epididymis) von Mäusen durchzuführen.
4. Herstellung der Beschichtungslösung (nur für die Patch-Klemme für menschliche Spermien erforderlich)
HINWEIS: Ein wesentlicher Schritt besteht darin, das anhaftende Spermium vor dem Einlaufen vom Deckglas zu heben. Dieser Schritt ist nur für menschliche Samenzellen notwendig und erfordert eine Beschichtung des Glasdeckglases, um eine weniger klebende Glasoberfläche zu erzeugen. Die Deckglasbeschichtung verringert die Wahrscheinlichkeit, dass die Spermien am Deckglas haften bleiben, und ermöglicht es, dass menschliche Spermien nach erfolgreicher Gigaseal-Bildung vom Glasdeckglas abgehoben werden.
5. Aufzeichnung der Ionenleitfähigkeit aus der gesamten Plasmamembran der Spermien.
Die Spermien-Patch-Clamp-Methode ermöglicht die direkte Aufzeichnung des CatSper-Kanals.
Wie oben erwähnt, wurden CatSper-Aufzeichnungen durchgeführt, indem eine hochohmige Dichtung (Gigaohm) zwischen der Patch-Pipette und dem Säugetierspermium an ihrem zytoplasmatischen Tröpfchen hergestellt wurde. Beim Einbruch und Übergang in den Ganzzellmodus wird der volle elektrische Zugang zum gesamten Körper der Samenzelle und ihrem Inneren, einschließlich des Spermienkopfes und des Flagellums, erhalten 2,8,39,51. Dieser Zustand ermöglicht letztendlich die Aufzeichnung von jedem aktiven Ionenkanal, der sich auf der Plasmamembran der Spermien befindet. Eine nominell zweiwertige (DVF) Badlösung, die entweder Cäsium oder Natrium als Hauptpermeation enthält, ist für die Aufzeichnung von monovalenten CatSper-Strömen 2,8,39,51 vorzuziehen. Während der CatSper-Kanal zweiwertige Ionen wie Ca2+ und Ba2+ leitet, bewegen sie sich viel langsamer durch die CatSper-Pore, was zu kaum nachweisbaren Leitwerten von wenigen Picoampere (~10-20 pA)2,8,39,51 führt. Daher ist die Messung monovalenter und damit größerer Ströme über den CatSper-Kanal eine bequemere Methode zur Beurteilung des Stroms (Abbildung 8). Es ist wichtig zu beachten, dass CatSper auch durchlässig für Kalium ist; Daher muss der CatSper-Kanal blockiert werden, oder CatSper-defiziente Spermien müssen in Situationen verwendet werden, in denen man nur die Kaliumkanäle der Spermien untersuchen möchte 2,3,8,28,65. Durch Variation der Ionenzusammensetzung der Pipette und der Badlösung kann man bestimmte Ionenkanäle selektiv ausschließen und gleichzeitig Bedingungen für die selektive Aufzeichnung nur von bestimmten Ionenkanaltypen schaffen. Zum Beispiel führt die Zugabe von Cs+ in die Pipettenlösung zu einer Blockierung der Ionenpermeabilität durch die Kaliumkanäle der Spermien.
Der CatSper-Kanal ist bei Säugetieren unterschiedlich reguliert.
Spermien verschiedener Arten sind in ihrer Morphologie und ihren internen Regulationswegen unterschiedlich66. Es ist keine Überraschung, dass ihre Ionenkanäle auch auf einzigartige Weise reguliert werden, die die spezialisierten Mikroumgebungen des männlichen und weiblichen Fortpflanzungstrakts widerspiegelt. Die Spermien-Patch-Clamp-Methode wurde erfolgreich bei sechs Säugetierarten angewendet: Maus2, Ratte56, Mensch39,51, Rind, Wildschwein und Makake41, wie in Abbildung 9 gezeigt. Für diese Experimente wurden Samenzellen von adulten männlichen Rhesusaffen [Macaca mulatta] vom California National Primate Research Center in Übereinstimmung mit den Standards der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) unter Verwendung von genehmigten Tierprotokollen der University of California, Davis, gewonnen, wie in41 beschrieben; und alle Studien wurden in Übereinstimmung mit dem U.S. National Institutes of Health Guide for the Care and Useof Laboratory Animals durchgeführt. Bullen- und Wildschweinsperma wurden als Nebenprodukte gewonnen, die von der spezifischen IACUC-Zulassung durch die Einrichtungen des UCD Department of Animal Science ausgenommen waren, und alle Tiere wurden in von der AAALAC zugelassenen Einrichtungen gehalten. Bullen- und Wildschweinsamen kann auch aus kommerziellen Quellen gewonnen werden.
Primaten (Rhesusaffen) und menschliche Spermien zeigten ähnliche Eigenschaften und Regulation des CatSper-Kanals. Interessanterweise scheint die Progesteronaktivierung von CatSper nur bei Primatenspermien zu sein (Abbildung 9 und 41), da die Spermien von Wildschweinen, Bullen und Nagetieren keine Progesteron-stimulierte Veränderung ihrer CatSper-Ströme zeigten. Bei Bullen und Wildschweinen lag die Aktivität des CatSper-Kanals sogar unterhalb der nachweisbaren Grenzen (Abbildung 9), was darauf hindeutet, dass bei diesen Spezies der Kalziumeinstrom und die daraus resultierende Hyperaktivierung durch andere Kanäle/Transporter gesteuert wird oder dass ein anderer natürlicher Stimulator für die Aktivierung ihrer CatSper-Kanäle erforderlich ist. Bei allen hier genannten Spermienarten, einschließlich Bullen- und Eberspermien, wurde der volle elektrische Zugang zum Inneren der Samenzellen erreicht und die Zellen wurden im Ganzzellmodus aufgezeichnet, wie das Auftreten der großen Kapazitätsartefakte beim Einbruch deutlich machte (Abbildung 7). Dieser Zustand ermöglicht eine einfache Aufzeichnung des funktionellen CatSper-Kanals, und sein Fehlen in den Spermien von Ebern und Rindern deutet darauf hin, dass dieser Kanal entweder durch einen noch unbekannten endogenen Inhibitor blockiert ist, der in den Spermien dieser Spezies vorhanden ist, oder dass ein spezifischer Modulator aktiviert werden muss. Es handelt sich jedoch um vorläufige Experimente, und es sind zusätzliche Experimente für Spermien von Wildschweinen und Bullen erforderlich, um die funktionelle Bedeutung des CatSper-Kanals bei diesen Spezies sicherzustellen. Dieses breite Spektrum der Spermienionenkanaldiversität zwischen den Spezies könnte mit dem Verhältnis von Spermien zu Eizellengröße, dem Verhältnis zwischen Spermiengröße und den schützenden Gewändern der Eizelle zusammenhängen oder als Barriere für die Befruchtung durch andere Spezies dienen66.
Abbildung 1: Morphologische Diversität der Spermien von Säugetieren. (A) Unteres Bild: schematische Darstellung eines Spermatozoons; Zelluläre Kompartimente sind markiert. Obere Paneele: DIC-Bilder von Spermien verschiedener Arten im Uhrzeigersinn: Ratte (Rn; Rattus norvegicus); Maus (Mm; Mus musculus); Bulle (Bt; Bos taurus); Wildschwein (Sd; sus scrofa domesticus); Mensch (Hs; Homo sapiens) und Rhesusaffen (Mmu; Macaca mulatta). Die Maßstabsleiste gilt für alle DIC-Bilder. Die Einsätze weisen auf zytoplasmatische Tröpfchen hin. (B) Flicken der Samenzellen von Säugetieren. Um eine erfolgreiche Dichtungsbildung zwischen Pipettenspitze und Plasmamembran zu erreichen, wird ein Teil der Plasmamembran schonend in die Pipettenspitze eingesaugt. Der Übergang in den Ganzzellmodus erfolgt durch Aufbrechen der Plasmamembran zwischen der Spitze und der Zelle (diese Abbildung wurde aus8 reproduziert). Rechtes Bild: Menschliche Samenzellen, die an eine Mikropipette befestigt sind. (C) Schematische Darstellung des menschlichen Spermatozoons und einiger der flagellären Ionenkanäle, die in menschlichen Samenzellen mit der Patch-Clamp-Methode untersucht wurden, sowie der von ihnen geleiteten Ionen. CatSper- Calcium-Ionenkanal 39,51; Hv1- Protonenkanal 51,56,67; Slo3/Slo1-Kaliumkanäle 50,53,65,68; TRPV4- transienter Rezeptorpotential-Kationenkanal Vanilloid Typ 448. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Spermiengröße und variable Morphologie von zytoplasmatischen Tröpfchen. Die DIC-Bilder von intakten lebenden Samenzellen. (A) Vergleich der Größe einer menschlichen Samenzelle (unten) und zweier CHO-Zellen (oben). (B) Intaktes menschliches (Homo sapiens) Spermium (unten) und eine kopflose Samenzelle (Flagellum, oben). Zytoplasmatische Tröpfchen sind durch gelbe Pfeilspitzen gekennzeichnet; Diese Figur wurde von8. (C) Intaktes murines Spermium (Mus musculus) mit den normal geformten zytoplasmatischen Tröpfchen (CD), die durch die gelbe Pfeilspitze angezeigt werden. (D-G) Nebenhodenhafte murine Spermien haben zytoplasmatische Tröpfchen unterschiedlicher Größe und Form; Nur (C) und (G) sind für Patch-Clamp geeignet. (D) CD ist mikroskopisch klein und einseitig; (E) CD fehlt; (F) Die CD enthält Partikel, die die Aufnahmepipette verstopfen können; (G) Zöliakie ist glatt, gleichmäßig und nicht aufgequollen. Wenn Sie mit dieser Art von CD ein Gigasiegel bilden, wird dies wahrscheinlich zu einer erfolgreichen Aufnahme führen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Komponenten des Spermien-Patch-Clamp-Rigs. (A) Typisches Spermien-Elektrophysiologie-Rig mit wesentlichen Komponenten: (1) inverses Mikroskop; (2) rauscharmer Digitalisierer; (3) Verstärker; (4) Mikromanipulator mit geringer Drift, der mit einer Mikromanipulatorplattform an das inverse Mikroskop gekoppelt ist; (5) PC-Computer; (6) einen schwingungsdämpfenden Lufttisch; (7) Faradayscher Käfig zum Schutz des Setups vor elektrischen Störungen durch die Umgebung. Es ist wichtig, dass alle elektrisch betriebenen Komponenten des Rigs, einschließlich Computertastatur und -maus, ein geringes oder kein elektrisches Rauschen (50 Hz oder 60 Hz) erzeugen und dass alle Komponenten des Rigs ordnungsgemäß geerdet sind. (B) Mikropipettenabzieher zur Aufzeichnung der Pipettenherstellung. (C) (1) microForge zum Brennpolieren von Pipetten; (2) Kapillaren aus Borosilikatglas mit einem Außendurchmesser von 1,5 mm, einem Innendurchmesser von 0,86 mm und einem inneren Filament; (3) Pipetten-Auffangbox. (D) Phasen des erfolgreichen Feuerpolierens der Pipette: (a) Unpolierte Pipette mit einem Innendurchmesser von 2 mm; b) feuerpolierte Pipette mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm; c) Überpolierte, versiegelte Pipette, die nicht für die Aufzeichnung geeignet ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Komponenten des Aufnahmekammersystems und dessen Montage. (A) Wesentliche Bestandteile des Aufnahmekammersystems: (1) Mikroskoptischadapter für Plattformen der Serie 20 mit (2) zwei Tischhalteklemmen; (3-4) magnetisch beheizte Plattform der PM-Serie mit (3) Magnetklemmen zur Aufnahme der Perfusionskammer; (5) Perfusionskammer; (6) Agar-Brücke; (7) Magnetklemme, Referenzelektrode mit 2 mm Buchse zum Ag/AgCl-Pellet; (8) magnetische Halterung (MAG-1) für die Saugleitung; (9) Saugrohr; (10) O-Halter des Saugrohrs. (B) Zusammengebautes Aufzeichnungskammersystem mit den unter (A) angegebenen Komponenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Komponenten des Perfusionssystems. (A) zusammengesetzte Perfusionsleitung und (B) ihre wesentlichen Bestandteile: (1) 20-ml- und 3-ml-Spritzen; (2) Absperrhahn mit Luer-Anschlüssen; 4-Wege; männliches Schloss; (3) weiblicher Luer-Schlauchtülle-Adapter, 1/16"; (4) Perfusionsschlauch aus Polytetrafluorethylen (PTFE) (Microbore PTFE-Schlauch, 0,022" ID × 0,042" AD); (5) Perfusionsverteiler aus Polytetrafluorethylen mit 8 Positionen; (6) Silikon-Verbindungsschlauch (platingehärteter Silikonschlauch, 1/32" ID × 3/32" AD); (7) Verteileranschlussschlauch (PTFE-Schlauch, 1/32" ID × 1/16" AD). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Sektion männlicher Mäuse. (A) Männliche Fortpflanzungsorgane von Mausen; Sowohl Hoden als auch Nebenhoden sind dargestellt. (B) Die Nebenhoden werden in eine 35-mm-Zellkulturschale mit HS-Lösung überführt und das restliche Fett und die Samenleiter entfernt. (C) Jeder Nebenhoden wird dann mit einer #15 Skalpellklinge in Caput, Corpus und Cauda unterteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Bildung und Einbruch von Gigasealen in die Spermien der Maus. Die Schnittstelle des Tools "Membrane Test" der kommerziellen Patchklemmen-Software. Drei Stufen des Spermien-Patch-Klemmens: (A) Die aufgezeichnete Pipette wird in eine Bad-HS-Lösung getaucht, wodurch ein Pipettenwiderstand von 14,8 MΩ erzeugt wird; (B) Es bildet sich ein Gigaseal (der Widerstand beträgt 4,7 GΩ), Kapazitätstransienten werden kompensiert und das Spermium wird vom Deckglas abgehoben; (C) Übergang in den Ganzzellmodus. Das Einfahren und der Übergang in den Ganzzellenmodus erfolgt durch Anlegen kurzer (1 ms) allmählich ansteigender (430-650 mV, ~50 mV Schritte) Spannungsimpulse in Kombination mit einem Lichtsog, wie links gezeigt. Der Einbruch ist eingetreten, wie aus dem Erscheinungsbild der großen Kapazitätstransienten hervorgeht, die die gesamte Kapazität der Zelle widerspiegeln (~2,93 pF für diese Samenzelle). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Murine CatSper-Aufzeichnung von Wildtyp-Cauda epididymal, kapazitiven und CatSper-Knockout-Spermien. Zur Aufzeichnung der monovalenten CatSper-Aktivität wird alle 5 s ein Rampenprotokoll angewendet und CatSper-Ströme aus einem Haltepotential von 0 mV39,51 durch Spannungsrampen erzeugt. Spannungsrampen (-80 mV bis 80 mV; 850 ms) werden in HS und nominell zweiwertfreier Lösung (DVF) verwendet. Die Daten wurden bei 2-5 kHz abgetastet und bei 1 kHz gefiltert. Die Ausgangsströme werden in HS-Lösung aufgezeichnet, die aufgrund der Hemmung durch hohes extrazelluläres Magnesium39,51 keinen CatSper-Strom erzeugt. Basisströme sind nützlich, um die Leckleitfähigkeit (Nicht-Ionenkanalwege) abzuschätzen. Repräsentative Cs+-Ganzzell-CatSper-Stromdichten (pA/pF; blau), die von kaudalen WT-Spermien von Mäusen (nicht kapazitiv; links und kapazitiv; Mitte) und CatSper-defizienten kaudalen murinen Spermien (rechts) aufgezeichnet wurden. Die Ströme wurden durch Spannungsrampen ab einem Haltepotential von 0 mV und Rampen von -80 mV bis 80 mV in HS und nominell zweiwertfreier Lösung erzeugt. Ausgangsströme (schwarz), aufgezeichnet in HS-Lösung. Um die Stromdichten zu erhalten, wurden die CatSper-Stromamplituden auf die Zellkapazität (pA/pF) normiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Progesteronregulation von CatSper bei verschiedenen Säugetierarten. (A) Repräsentativer CatSper-Strom, der von Spermien verschiedener Spezies durch ein Spannungsrampenprotokoll ausgelöst wird, wie angegeben. Spezies: Mensch (Hs; H. sapiens); Rhesusaffen (Mmu; M. mulatta), Maus (Mm; M. musculus), Bulle (Bt; B. taurus); Ratte (Rn; R. norvegicus); Wildschwein (Sd; S. scrofa domesticus). Es wurden CatSper-Ströme in Abwesenheit (blau) und Anwesenheit (rot) von 1 mM Progesteron sowie die Basalströme in HS-Lösung (schwarz) aufgezeichnet. (B) CatSper-Stromamplituden (ICatSper, pA) und (C) Aufzeichnungen der durchschnittlichen Stromdichten (pA/pF) von Spermien verschiedener Spezies, wie angegeben; n gibt die Anzahl der verwendeten einzelnen Samenzellen an. Die Daten beziehen sich auf den Mittelwert +/- S.E.M. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: Der Unterschied in der Flagellenmotilität. Zwei repräsentative Beispiele für zytoplasmatische Tröpfchen und flagellare Motilität. Die überlagerten Bilder derselben Spermien von Ratten (Rn) und Menschen (Hs) wurden zu zwei verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen, zu denen sie die distalste Flagellenablenkung aufweisen. Gestrichelte Rechtecke zeigen die Region mit zytoplasmatischen Tröpfchen und ihrer entsprechenden räumlichen Mobilität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 11: Anordnung des U-Rohrs und seine wesentlichen Komponenten. (A) Bestandteile des U-Rohrs: (1) 10 mL serologische Pipette; (2) Silikonschlauch; (3) Verbindungsschlauch aus Silikon; (4) 1 ml Spritze; (5) Weiblicher Luer-Widerhaken-Adapter; (6) männlicher Luer-Integral-Lock-Adapter 1/8"; (7) Absperrhahn mit Luer-Anschlüssen; 4-Wege; männliches Schloss; (8) männlicher Widerhakenadapter der Luer-Serie, 1/16". (B) Vollständig montiertes U-Rohr und (C) U-Rohr, das am Faradayschen Käfig befestigt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 12: Eine schematische Darstellung der U-Rohr-Baugruppe. Linkes Panel: Der Überdruck wird durch den Mund bereitgestellt, um einen Unterschied im Flüssigkeitsstand im U-Rohr zu erzeugen. Der Flüssigkeitsstand im rechten Horn steigt um 2 cm. Nachdem diese Pegeldifferenz erzeugt wurde, wird der Absperrhahn gedreht, um das U-Rohr mit der Leitung zu verbinden, die zu einer Aufnahmepipette führt. Rechte Platte: Der höhere Flüssigkeitsstand im rechten Horn erzeugt einen Überdruck, der die Pipettenlösung ständig aus der Pipettenspitze drückt und die Spitze frei von Schmutz hält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Chemikalien | Molgewicht (g/mol) | Mm | g für 1L |
NaCl | 58.44 | 97.8 | 5,72 Gramm |
Kcl | 74.55 | 5 | 0,373 Gramm |
KH2PO4 | 136.09 | 0.37 | 50,4 mg |
MgSO4 x 7.H2Ω | 246.48 | 0.2 | 49,3 mg |
CaCl2 x 2.H2Ω | 147.02 | 2 | 0,294 Gramm |
HEPES | 238.3 | 20 | 4.766 Gramm |
Traubenzucker | 180.2 | 3 | 0,540 Gramm |
Natriumlactat (60 % w/w) | 112.06 | 20 | 3 ml |
Natriumpyruvat | 110 | 0.4 | 44 mg |
Tabelle 1: Lösung für humane Schlauchflüssigkeit (HTF)
Chemikalien | Molgewicht (g/mol) | Mm | g für 1L |
NaCl | 58.44 | 135 | 7.889 Gramm |
Kcl | 74.55 | 5 | 0,373 Gramm |
CaCl2 x 2. H2Ω | 147.02 | 2 | 0,294 Gramm |
MgSO4 x 7. H2Ω | 246.48 | 1 | 0,247 Gramm |
HEPES | 238.3 | 20 | 4.766 Gramm |
Traubenzucker | 180.2 | 5 | 0,901 g |
Natriumlactat (60 % w/w) | 112.06 | 10 | 1,5 ml |
Natriumpyruvat | 110 | 1 | 0,110 g |
Tabelle 2: Lösung mit hohem Salzgehalt (HS)
Chemikalien | Molgewicht (g/mol) | Mm | g (für 500 ml) |
CsMeSO3 | 228.0 | 140 | ca. 15.960 Gramm |
HEPES | 238.3 | 40 | 4.766 Gramm |
EDTA | 292.24 | 1 | 0,146 Gramm |
Tabelle 3: CsMeSO3 Badlösung (Divalente freie Badlösung: DVF)
Chemikalien | Molgewicht (g/mol) | Mm | mg (für 25 ml) |
CsMeSO3 | 228.0 | 130 | 741 mg |
HEPES | 238.3 | 70 | 417 mg |
EDTA | 292.24 | 2 | 14,6 mg |
EGTA (EGTA) | 380.35 | 3 | 28,5 mg |
CsCl | 1 M Lösung | 1 | ca. 25 μl |
Tabelle 4: CsMeSO3 Pipettenlösung
Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Durchführung elektrophysiologischer Ableitungen von Samenzellen verschiedener Spezies. Angesichts der physiologischen Bedeutung von Ionenkanälen und elektrogenen Transportern für Spermien ist diese Technik ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Physiologie der Spermien sowie Defekte zu untersuchen, die zur männlichen Unfruchtbarkeit führen. Der Experimentator mag die Ausführung dieser Technik anfangs als herausfordernd empfinden, aber mit Ausdauer und Ausdauer folgt der Erfolg.
Die Spermien von Säugetieren sind lang (normalerweise >50 μm), schmal und sehr beweglich. Die basale Schlagfrequenz (BF) von Säugetierspermien variiert stark mit Werten von durchschnittlich 4 Hz (Maus 69), 7-15 Hz (Wildschwein 70,71), 11 Hz (Ratte 72), 11-20 Hz (Bulle 18), 24 Hz (Rhesusaffen 23) und bis zu 25 Hz (Mensch 3). Das zytoplasmatische Tröpfchen (CD) ist der Eingang für die Aufzeichnung von Samenzellen. Bei Nagetierspermien ist die CD oft distal, bewegt sich aber entlang des Flagellums (Abbildung 10), was ein zusätzliches Hindernis für die Aufnahme darstellt. In menschlichen Samenzellen befindet sich die Zöliakie jedoch häufiger in der Nähe des Kopfes. Die Schlüsselkomponenten eines erfolgreichen Spermien-Patch-Clamps sind daher eine hervorragende Optik, um eine klare, scharfe Sicht auf die CD zu ermöglichen, und ein hochpräzises Mikromanipulatorsystem ohne Drift oder Vibrationen. Eine anfänglich hohe Ausfallrate ist zu erwarten und ist innerhalb der ersten Tage nach der Spermien-Patch-Klemme normal. Wir empfehlen eine routinemäßige Praxis mit mehreren Versuchen pro Woche. Mehrere Aufnahmen pro Tag und Woche etablieren eine Routine und verbessern die motorischen Fähigkeiten.
Bis vor kurzem wurde die Identifizierung und pharmakologische Charakterisierung von Ionenkanälen der Spermien dadurch behindert, dass sie nicht direkt untersucht werden konnten. Das Feld stützte sich weitgehend auf immunzytochemische Studien, die oft unter der Unspezifität der Antikörper und/oder dem Fehlen entsprechender genetischer Modelle leiden. Zur Untersuchung von Kalziumkanälen ist das klassische Kalziumbildgebungsverfahren weit verbreitet, das seine eigenen Vorteile und Grenzen hat 73,74,75,76,77. Während die Calcium-Bildgebung eine relativ einfache Methode ist, die für Studien mit mittlerem bis hohem Durchsatz anwendbar ist 78,79,80,81 und weniger invasiv ist, erfordert sie relativ intakte Zellen und stellt daher eine Hürde dar, um die Funktion von Ionenkanälen zu entschlüsseln, die von intrazellulären Signalkaskaden entkoppelt sind, oder um sie von Kalzium-Ionenaustauschern zu unterscheiden. Darüber hinaus ist es schwierig, das Membranpotential zu kontrollieren und daher den Beitrag der spannungsgesteuerten Kalziumkanäle auszuschließen. Zu den Vorteilen der Calciumfluorometrie gehört die Verwendung von Calcium-Ratiometric-Farbstoffen, die eine genaue Messung der Änderungen der Calciumionenkonzentration ermöglichen. Gleichzeitig muss man sich darüber im Klaren sein, dass die Empfindlichkeit dieser Farbstoffe je nach Änderung des intrazellulären pH-Werts variieren kann.
Im Folgenden beschreiben wir die kritischen Schritte innerhalb des Protokolls, einschließlich der Schritte zur Fehlerbehebung der Methode. Für die Herstellung der Versuchslösungen ist es unerlässlich, nur reine Reagenzien zu verwenden, da bereits geringe Verunreinigungen mit unerwünschten Ionen (wie Magnesium oder Schwermetallen) die Detektion von einwertigen Strömen beeinträchtigen können. Angesichts der geringen Größe der Samenzellen kann man mit einer relativ geringen Anzahl von Ionenkanälen pro Zelle rechnen. Daher reicht der Nettostrom von wenigen pA bis zu mehreren hundert pA. Daher muss das interne elektrische Rauschen des Bohrgeräts minimal sein, um die Erkennung kleiner Ströme zu gewährleisten, und die Verwendung von driftfreien Geräten wird dringend empfohlen. Um einen bestimmten Leitwert von elektrischem Rauschen und Hintergrundleck zu unterscheiden, müssen das Aufzeichnungsgerät und das Erdungssystem maximiert werden. Dies wird erreicht, indem das Bohrgerät ordnungsgemäß geerdet wird, um elektrische Störungen82 zu vermeiden. Die Verwendung eines Faradayschen Käfigs wird dringend empfohlen, um sich vor elektrischen Störungen zu schützen, die von einer Vielzahl elektrischer Geräte wie Gebäudeleuchten und elektrischen Wandleitungen verursacht werden. Es ist wichtig, dass alle elektrisch betriebenen Komponenten des Rigs, einschließlich der Computertastatur und der Maus, wenig oder gar kein elektrisches Rauschen (50 Hz oder 60 Hz) abstrahlen und dass alle Komponenten des Rigs ordnungsgemäß geerdet sind. Das elektrische Rauschen in der Ganzzellenkonfiguration sollte bei geschlossenen Ionenkanälen < 0,5 bis 1 pA betragen.
Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Überwachung der korrekten Osmolaritäten der Arbeitslösungen. Die Zusammensetzung der intra- und extrazellulären Lösungen muss genau bestimmt und ihre Osmolaritäten korrekt gemessen werden. Die extrazelluläre Lösung muss im Vergleich zur Pipettenlösung leicht hypoton sein, da sie zu einer winzigen Zellschwellung führt und verhindert, dass die Pipette durch die Spermienmembran verstopft wird. Hinweis: Wenn die Pipettenlösung zu hyperton ist und sich von der Badlösung um mehr als 10 mOsm unterscheidet, kommt es zu einer übermäßigen Zellschwellung und einem Siegelbruch. Das hat zur Folge, dass die Zelle zerbrechlich ist und das Gigasiegel innerhalb von Sekunden nach dem Einbruch verloren geht. Unserer Erfahrung nach ist eine ungenaue Lösungsvorbereitung einer der häufigsten Fehler, der ein erfolgreiches Patch-Clamping verhindert.
Ein weiteres potenzielles Hindernis, das es zu vermeiden gilt, sind weichmacher-/phthalathaltige Kunststoffe sowie mineralölgeschmierte Spritzen. Die Schläuche, Spritzen und alle Kunststoffgeräte, die mit Lösungen und damit mit Samenzellen in Berührung kommen, sollten keine Weichmacher oder andere Umweltgifte oder Öle auslaugen, da solche Chemikalien die Aktivität der Ionenkanäle erheblich verändern können. Wir verwenden Teflonschläuche mit kleinem Durchmesser als Hauptperfusionsleitung. Teflon (PTFE) hat wenig auslaugbare Verbindungen, ist aber ziemlich steif. Flexible Verbindungen bestehen aus hochreinen Silikonschläuchen, die über den Teflonschlauch passen. Alle Spritzen, die für das Perfusionssystem verwendet werden, verzichten auf jegliches Schmiermittel, da das Mineralöl oder andere Schmierzusätze die Ionenkanalaufzeichnung stören können.
Wir können nicht genug betonen, wie wichtig es ist, das richtige Glas zu verwenden und die richtige Mikropipettenform zu ziehen. Daher ist die optimale Herstellung von Glasmikropipetten eine Voraussetzung für ein erfolgreiches Patchen. Wir verwenden Mikropipetten aus Glas, die nur aus Borosilikatglas hergestellt werden, das ein Filament enthält, um die Lösungsfüllung zu verbessern. Die Spitze der Pipetten muss feuerpoliert werden, um den idealen dichten Verschluss zu gewährleisten. Pipettenspitzen mit einem Durchmesser von mehr als 2 μm (und damit einem Widerstand von 10 MΩ oder darunter) sind in der Regel nicht für Spermien-Patch-Clamp geeignet.
Ein weiterer wichtiger Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass die Mikropipettenspitze vor der Dichtungsbildung frei von Schmutz oder Luftblasen gehalten wird. Dies ist eine schwierige Aufgabe, da die Mikropipette in eine Lösung voller beweglicher Zellen geladen wird. Ein Faktor, der hilft, ein versehentliches "Anstoßen" der Pipette in frei schwimmende Samenzellen zu vermeiden, ist die Verwendung einer konstanten Perfusion, um alle nicht anhaftenden Zellen wegzuspülen. Ein weiteres Werkzeug ist ein selbstgebautes "U-Rohr", mit dem zwischen Über- und Unterdruckmodus gewechselt werden kann, um die Spitze sauber zu halten (Abbildung 11 und Abbildung 12).
Da Samenzellen in der Form und Größe ihrer zytoplasmatischen Tröpfchen (CD) sehr unterschiedlich sind, ist es wichtig, ein Tröpfchen mit geeigneter Morphologie auszuwählen. Wie in Abbildung 2 gezeigt, eignen sich nur CDs, die klein (1-3 μm), glatt, gleichmäßig und nicht übermäßig aufgequollen sind, für Patch-Clamp. Winzig, einseitig; "aufgeblähte", volltransparente CDs erzeugen schwache oder keine Dichtungen. CDs mit großen löslichen Partikeln können die Aufnahmepipette verstopfen. Wenn Hodenspermien von Mäusen in den Nebenhoden gelangen, befinden sich ihre Zöliakie im Halsbereich, in der Nähe des Kopfes. Auf ihrem Weg durch den Nebenhoden bewegen sich ihre Zöliakie entlang des Mittelstücks und erreichen schließlich die Verbindung zwischen dem Mittelstück und dem Hauptstück (dem Anulus), wenn die Spermien den Nebenhoden der Cauda erreichen. Daher befindet sich die Zöliakie, wie oben erwähnt, bei Samenzellen, die aus dem Corpus Epididymis isoliert wurden, normalerweise nahe der Mitte des Mittelstücks. In kaudalen Zellen befindet sich die Zöliakie in der Regel in der Nähe des Anulus (Abbildung 2C). Bei menschlichen Spermien befindet sich die Zöliakie im Halsbereich (Abbildung 2A,B).
Während dies für Spermien, die aus Labortieren isoliert wurden, kein Problem darstellt, besteht eine erhebliche Variabilität zwischen menschlichen Spendern. Schwankungen in der Spermienqualität innerhalb desselben Spenders wirken sich hauptsächlich auf die Qualität der Plasmamembran der Spermien aus und erschweren manchmal die Bildung von Dichtungen. Es gibt eine geringere Variabilität im Verhalten der Ionenkanäle und in der Pharmakologie, Faktoren, die wahrscheinlich mit der individuellen Genetik oder Physiologie korrelieren. Man muss hartnäckig sein und Proben aus verschiedenen Spenden über mehrere Tage hinweg auswerten und sich auf mehrere menschliche Spender verlassen. Die Arbeit mit menschlichem Material erfordert zusätzliche Geduld, da die Qualität der gespendeten Samen innerhalb desselben Spenders stark variiert, abhängig von verschiedenen Umweltfaktoren. Wir empfehlen, Proben von verschiedenen Spendetagen auszuwerten, um eine endgültige Entscheidung über den Spenderstatus zu treffen. Während ejakulierte, gereinigte Spermien in der Regel innerhalb von Stunden (bis zu 12 Stunden nach der Isolierung für menschliche Spermien) für die Elektrophysiologie geeignet sind, eignen sich Nebenhodenspermien von Mäusen nur innerhalb eines 2-Stunden-Fensters nach der Isolierung zum Patchen.
Und zu guter Letzt unterscheidet sich die Bildung von Gigasiegeln zwischen den Samenzellen. Bei Maus-/Nagetier-Spermien erfolgt die Gigaseal-Bildung fast augenblicklich, während mehrere Sekunden (und manchmal bis zu einer Minute) erforderlich sind, um einen Gigaseal mit einem menschlichen Sperma zu bilden. Oft ergibt sich bei der anfänglichen Absaugung ein Eingangswiderstand von 200 MΩ bis 800 MΩ. Das Umschalten des Haltepotentials auf -60 mV und das Bereitstellen von "Membrantest"-Kurzimpulsen auf bis zu 10 mV hilft oft, die Bildung von Gigasealen zu verhindern (durch Spannungsfeld-induzierte Bewegung der Membran in der Pipette).
Die Spermienzell-Patch-Clamp-Technik ermöglicht die detaillierte Untersuchung spezifischer Ionenkanäle in ihrem natürlichen Expressionssystem. Der Erfolg der Technik hängt von der richtigen Ausrüstung, hochwertigen lebensfähigen Samenzellen, reinen Reagenzien, grundlegenden elektrophysiologischen Fähigkeiten, Geduld und Ausdauer ab. Die Methode eröffnet neue Grenzen in der Physiologie der Spermien, indem sie die evolutionäre Vielfalt der Ionenkanäle, die Mechanismen ihrer Regulation und die Veränderungen ihrer Funktion untersucht, wenn sie vom männlichen in den weiblichen Fortpflanzungstrakt übergehen und durch exogene Bedingungen wie pH-Wert und Liganden verändert werden.
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH Grant R01GM111802, Pew Biomedical Scholars Award 00028642, Alfred P. Sloan Award FR-2015-65398 und Packer Wentz Endowment Will (to P.V.L.). Diese Arbeit wurde auch von der Deutschen Forschungsgemeinschaft 368482240/GRK2416 (an N.M.) und vom China Scholarship Council Fellowship an B.L. unterstützt. Wir danken Dr. Dan Feldman für die Bereitstellung von Rattengewebe, Katie Klooster und Stuart Meyers von der UC Davis für die Hilfe bei der Gewinnung von Primatensamenzellen und Steven Mansell für die Hilfe bei der Datenerfassung von Samenzellen von Wildschweinen und Bullen.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
IX71 with DIC optics | Olympus Inc | IX71 | Nikon TiU microscope can be used as well |
UplanSApo 60x | Olympus Inc | water immersion objective | |
Vibration-damping air table | Newport Inc | TMC airtables or similar can be used | |
Axopatch™ 200B amplifier | Axon™ /Molecular Devices | Sutter IPA®/Double IPA® Integrated patch clamp system is also an excellent amplifier | |
Axon Digidata analog to digital converter | Axon™ /Molecular Devices | 1440 or 1550 | can be used as well |
Vapor pressure osmometer | Wescor | model 5600 | |
MPC 385 micromanipulator | Sutter Instruments, Novato CA | MPC 385 | The Eppendorf micromanipulator TransferMan series can be also used |
Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato CA | P1000 | P97 can be used |
MicroForge | Narishige | MF-830 | Should be equiped with Nikon MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 objective |
Faraday cage | Homemade | to shield the setup from ambient electrical interference | |
5 mm glass Cover Slips | WPI | #502040 | |
Perfusion chamber | Warner Instruments, Inc | RC-24E | |
Borosilicate glass capilary | Sutter Instruments, Novato CA | BF 150-85-7.5 | outer diameter 1.5 mm, inner diameter 0.86 mm and an internal filament |
Teflon manifold MP-8 | Warner Instruments, Inc | 64-0211 | Teflon 8-position perfusion manifold |
Nunc 4-well plate | Nunc | #179820 | |
1 X HTF buffer | EmbryoMax | MR-070-D | capacitation solution |
SA-Oly/2 stage adapter | Warner Instruments, Inc | for series 20 platforms | only for Olympus microscope |
Magnetic heated platform | Warner Instruments, Inc | PM-1 or similar series | to hold RC-24E chamber |
MAG-1 magnetic clamp | Warner Instruments, Inc | #64-0358 | |
Microelectrode holder with 2mm Ag/AgCl pellet | WPI | MEH3F4515 | |
Stopcock with Luer connections; 4-way; male lock | Cole-Parmer, Inc | EW-30600–09 | |
female luer hose barb adapter, 1/16” | Cole-Parmer, Inc | EW-45508–00 | |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) perfusion tubing | Cole-Parmer, Inc | EW-06417–21 | (Microbore PTFE Tubing, 0.022” ID × 0.042” OD) |
Silicone connector tubing (platinum-cured silicone tubing, 1/32” ID × 3/32” OD) | Cole-Parmer, Inc | EW-95802–01 | |
Manifold connector tubing (PTFE Tubing, 1/32” ID × 1/16” OD) | Cole-Parmer, Inc | EW-06407–41 | |
male Luer series barb adapter, 1/16” | Cole-Parmer, Inc | 45518–00 | |
Male Luer integral lock adapter 1/8” | Cole-Parmer, Inc | 45-503-04 | |
Silicone connector tubing | Dow Silicone Corporation; MI | #508-008 | |
Syringes | Fisher Scientific or VWR | Air-Tite, Norm-Ject Luer | 1 mL, 3mL, and 20 mL |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 60216 | |
MgSO4 x 7.H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
CaCl2 x 2.H2O | Sigma-Aldrich | 21097 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523-250G | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Sodium lactate (60% w/w) | Sigma-Aldrich | L7900 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | BCBG2421V | |
CsMeSO3 | Sigma-Aldrich | C1426 | Cesium methanesulfonate |
KCl | Fisher Scientific | P217 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | BCBF5871V | |
Tris-HCl | Quality Biological | 315-006-721 | 1 M solution of similar |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | |
CsOH | Sigma-Aldrich | 232041 | |
Embryomax Human Tubal Fluid medium: | Millipore | MR-070-D | capacitation medium for murine sperm cells |
(Embryomax-HTF) | |||
Animals | |||
Male Wistar rats | Wistar | Harlan Laboratories (Livermore, CA) | adult rats |
Male C57BL/6 mice | C57BL/6 mice | Harlan Laboratories (Livermore, CA) | 3-6 month old |
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