İnsan Oositleri için Piezo-ICSI

Burada, piezo tahrikli bir mikropipet kullanarak insan oositlerine intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu için bir protokol açıklıyoruz.

İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) ile elde edilen ilk başarılı gebelikler bildirildiğinden beri, ICSI yardımcı üreme teknolojisinde (ART) önemli bir teknik haline gelmiştir. ICSI, zona pellucida ve membrana nüfuz etmek için sivri uçlu mikropipetler kullanır. Daha sonra, sitoplazma genellikle zar kırılması için mikropipete aspire edilir (konvansiyonel-ICSI). Konvansiyonel ICSI sonrası fare oositlerinin hayatta kalma ve döllenme oranları sırasıyla %16 ve %8 kadar düşüktü. Kimura ve Yanagimachi, fare ICSI için bir piezo sürücü ünitesi, cıva ve düz uçlu bir mikropipet uyguladılar. Membran kırılması, bu tür ekipmanların sitoplazmik aspirasyon olmadan mikropipete (piezo-ICSI) birleştirilmesiyle yarı otomatik olarak gerçekleştirilebilir. Bu yazarlar, konvansiyonel ICSI'ye (%16 ve %8) kıyasla önemli ölçüde daha yüksek sağkalım ve döllenme oranları (%80 ve %78) bildirmişlerdir. Bu nedenle, piezo-ICSI sadece fare oositleri için değil, aynı zamanda insan oositleri ICSI için de etkili olabilir. Bununla birlikte, insan oositleri için konvansiyonel ICSI'ye kıyasla piezo-ICSI'nin etkinliğini değerlendiren sadece beş makale mevcuttur. Bu beş makalenin tümü, konvansiyonel-ICSI'ninkilere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek gübreleme oranları bildirmiştir. Burada tarif edilen piezo-ICSI protokolünün amacı, konvansiyonel ICSI'ye kıyasla ICSI'nin klinik sonuçlarını iyileştirmektir.

Dr. Palermo'nun intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI)¹ ile elde edilen ilk başarılı gebelikleri bildirmesinden bu yana, ICSI yardımcı üreme teknolojisinde (ART) önemli bir teknik haline gelmiştir. ICSI, zona pellucida ve membrana nüfuz etmek için sivri uçlu mikropipetler kullanır. Daha sonra, sitoplazma genellikle zar kırılması için mikropipete aspire edilir (konvansiyonel-ICSI). Konvansiyonel-ICSI sonrası fare oositlerinin sağkalım ve döllenme oranları sırasıyla %16 ve %8 kadar düşüktü². Kimura ve Yanagimachi, fare ICSI² için bir piezo sürücü ünitesi, cıva ve düz uçlu bir mikropipet uyguladılar. Membran kırılması, bu tür ekipmanların (piezo-ICSI) birleştirilmesiyle yarı otomatik olarak gerçekleştirilebilir. Bu yazarlar, piezo-ICSI'nin geleneksel ICSI'ye (%16 ve) kıyasla önemli ölçüde daha yüksek sağkalım ve döllenme oranları (%80 ve %78) ^{bildirmişlerdir2}. Piezo-ICSI'de elde edilen sonuçların daha iyi olmasının nedenlerinden biri de membran kırılma süreci olabilir. Piezo-ICSI, mikropipete sitoplazmik aspirasyon olmadan zarı stabil ve yarı otomatik olarak kırabilir. Bu sonuçlar, membran kırılması sırasında mikropipete sitoplazmik aspirasyonun fare oositleri için invaziv olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, piezo-ICSI sadece fare oositleri için değil, aynı zamanda insan oositleri ICSI için de etkili olabilir.

Bununla birlikte, sadece beş mevcut makale, insan oositleri için konvansiyonel ICSI ile karşılaştırıldığında piezo-ICSI'nin etkinliğini değerlendirmiştir. Bu makalelerin beşi de, konvansiyonel ICSI ^3,4,5,6,7 ile gübreleme oranlarına kıyasla piezo-ICSI ile önemli ölçüde daha yüksek döllenme oranları bildirmiştir (Tablo 1). Bu nedenle, piezo-ICSI, konvansiyonel ICSI'ye kıyasla hayatta kalma ve döllenme oranlarını iyileştirebilir. Burada tarif edilen piezo-ICSI protokolünün amacı, konvansiyonel ICSI'ye kıyasla ICSI'nin klinik sonuçlarını iyileştirmektir.

Aşağıda açıklanan piezo-ICSI protokolü, Kameda Tıp Merkezi'ndeki insan araştırmaları etik komitesinin yönergelerini takip eder.

1. Ekipman ve hazırlık

1. Bir sürücü ünitesi, bir çalıştırma kutusu, bir ayak pedalı ve bir kontrolörden oluşan bir piezo-ICSI sistemi kullanın. Herhangi bir ters mikroskop veya üç eksenli mikromanipülatör kullanın. Piezo sürücü ünitesini mikropipet tutucuya takın ve ayak pedalını zemine yerleştirin. İşlem kutusunda YOĞUNLUK seviyesini 2'ye ve HIZ seviyesini 1'e ayarlayın.
2. Piyasada bulunan ve düz uçlu bir piezo-ICSI mikropipet kullanın. Bir mikropipeti çalışma sıvısıyla (florokarbon bazlı sıvı) 20 mm uzunluğunda doldurun. Çalışma sıvısında herhangi bir hava kabarcığı karıştırmaktan kaçının. Sıvı doldurma cihazı ile pipetin arkasına doğru hava kabarcıklarını veya fazla çalışma sıvısını aspire edin.
3. Mikropipeti enjeksiyon mikropipet tutucusuna takın. Enjeksiyon mikropipet tutucusunda silikon bir tüp varsa, pipetin kafasını silikon tüpe yaklaşık 5 mm yerleştirin. Tutucu kapağını sıkın ve mikropipeti sıkıca sabitleyin.
4. Tahrik ünitesini manipülatöre takın ve ağırlığından kaynaklanan herhangi bir dönüşü önlemek için sıkıca sabitleyin.
5. Mikropipeti mikroskop alanına yerleştirin. Enjektörü çalıştırın ve pipet kafasının içindeki havanın dışarı çıkması için işlem sıvısını mikropipetin kafasına doğru itin. Pipet kafasının içinde hava kalmadığını mikroskop yerine çıplak gözle doğrulayın.
6. ICSI kabını Şekil 1'de gösterildiği gibi cam tabanlı tabak üzerinde hazırlayın. % 7 polivinilpirolidon çözeltisinden (PVP) iki mikro damlacık hazırlayın: daha küçük mikro damlacık mikropipet (5 μL) hazırlanması içindir ve diğeri sperm seçimi içindir (10 μL). Tamponlu ortamdan cam tabanlı tabağın ortasında yapılan başka bir damlacık hazırlayın; bu mikro damlacık oosit içindir ve sperm enjeksiyonu (8 μL) için kullanılır.
7. Mikropipetin kafasını %7'lik bir PVP damlacığına yerleştirin ve mikropipetin iç duvarını kaplayın. Enjektörü, çalışma sıvısı ile PVP arasındaki arayüzey sınırı boyunca hareket ettirerek kuvvetli bir şekilde çalıştırın. Mikropipetin içini, pipetin başından yaklaşık 800 μm uzakta PVP ile durulayın.
   1. Arayüzey sınırı düzgün bir şekilde kayana kadar bu prosedürü (~ 3 veya 4 kez) tekrarlayın.

2. Sperm immobilizasyonu

1. İşlem kutusunda YOĞUNLUK seviyesini 2'ye ve HIZ seviyesini 1'e ayarlayın. Ayak pedalı açıldığında mikropipet tutucusuna bağlı tahrik ünitesinden piezo darbesini uygulayın. İşlem sırasında piezo darbesini uygularken, videonun sağ üst köşesinde "Piezo darbesi" simgesi belirir.
2. Bir yoğunluk gradyanı kullanarak hareketli spermi toplayın ve toplanan hareketli spermi tamponlu ortama tutun. Toplanan hareketli spermi yaklaşık 2-3 μL tutan tamponlu ortamı bir pipet kullanarak aspire edin. Daha sonra bu ortamı %7 PVP mikro damlacığının alt tarafına enjekte edin. 400x büyütme altında spermi seçin.
   1. Mikropipet ucunu seçilen spermin kuyruğuna takın ve ardından piezo sürücü ünitesini sürün. Tipik olarak, bir sperm immobilizasyonu için sürüşü 3 kez tekrarlayın. Sperm immobilizasyonundan sonra, spermi önce mikropipet kuyruğuna aspire edin.

3. Piezo-ICSI işlemi (yüksek gerilme kabiliyetine sahip bir zara sahip bir oosit)

1. Spermin başını, mikropipetin başından yaklaşık bir tam uzunlukta sperm geride bir pozisyonda tutun. Piezo tahrik ünitesini sürerken (bir oosit başına yaklaşık 5 kez), zona pellucida deformasyonu olmadan delinmeyi gerçekleştirmek için mikropipeti ilerletin. Mikropipet ucu zona pellucida'nın iç tabakasına ulaştığında ve daha sonra zona pellucida'nın içi oyulmuş parçası mikropipete tamamen aspire edildiğinde, zona pellucida'nın delinmesi tamamlanır.
2. Mikropipetin içindeki zona pellucida'nın içi oyulmuş parçasını çıkarın ve aynı zamanda spermi mikropipetin başına taşıyın. Mikropipeti içeri itin ve sitoplazmik zarı oosit çapının yaklaşık %90'ına kadar gerin.
3. Yeterince gerildiğinde, zarı yırtmak için piezo sürücüyü bir kez çalıştırın. Membranın geri teptiği teyit edildiğinde membran kırılması tamamlanır.
4. Zar kırıldıktan sonra, spermin başını oositin içine enjekte edin. Spermin başı mutlaka sitoplazmaya enjekte edildikten sonra gereksiz sıvı eklememeye dikkat edin.

4. Piezo-ICSI işlemi (düşük gerilme kabiliyetine sahip bir zara sahip bir oosit)

NOT: Germe sırasında kendiliğinden yırtılabilen, düşük gerilme kabiliyetine sahip bir zara sahip bir oosit ile nasıl başa çıkılacağını açıklıyoruz.

1. Sitoplazmik zarı germe noktasına kadar yüksek gerilme kabiliyetine sahip bir zar ile oosit ile aynı işlemi gerçekleştirin.
2. Etki sırasında zar kendiliğinden yırtılırsa, sperm enjeksiyonundan sonra oositlerin dejenerasyonunu önlemek için spermin başını mikropipetin konumundan daha fazla ileri itmeden enjekte edin.
3. Spermin başı mutlaka sitoplazmaya enjekte edildikten sonra gereksiz sıvı eklememeye dikkat edin.

Yukarıda tarif edilen konvansiyonel-ICSI ve piezo-ICSI, 4 embriyolog tarafından 10.488 olgun oosit (1.744 döngü) üzerinde gerçekleştirildi. Bunlardan 3.522 oosit (587 döngü) Ocak 2013 ile Eylül 2016 arasında konvansiyonel ICSI ile tohumlandı ve 6.966 oosit (1.157 döngü) Ekim 2016 ile Aralık 2020 arasında Kameda Tıp Merkezi'nde piezo-ICSI ile tohumlandı. Tablo 1 , kadınların ortalama yaşını, döllenme oranlarını, sağkalım oranlarını, dejenerasyon oranlarını, 5. gün blastosist oranlarını ve konvansiyonel-ICSI ve piezo-ICSI döngüleri başına ortalama dondurularak saklanmış blastosist sayısını göstermektedir. Piezo-ICSI'nin ortalama yaşı konvansiyonel-ICSI'ye kıyasla daha yüksek olmasına rağmen, döllenme, sağkalım ve blastosist oranları ve piezo-ICSI döngüsü başına ortalama kriyoprezervasyon blastosist sayısı konvansiyonel-ICSI'ye kıyasla anlamlı olarak daha yüksekti (Tablo 2).

Resim 1: Piezo-ICSI için kullanılan ICSI çanağı. Mikro damlacıkların düzeni burada açıklanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Konvansiyonel-ICSI ve piezo-ICSI arasındaki döllenme oranlarının karşılaştırılması. Tüm raporlarda, piezo-ICSI'de konvansiyonel-ICSI'ye kıyasla önemli ölçüde daha yüksek döllenme oranları gözlenmiştir.

Tablo 2: Kameda Tıp Merkezi'nin konvansiyonel-ICSI ve piezo-ICSI'nin etkinliğini karşılaştıran klinik sonuçları. Tüm karşılaştırma maddelerinde, piezo-ICSI'de konvansiyonel-ICSI'ye kıyasla önemli ölçüde daha iyi sonuçlar gözlendi.

Sonuçlar, piezo-ICSI'nin döllenme oranlarının, sağkalım oranlarının, 5. gün blastosist oranlarının ve ortalama dondurularak saklanmış blastosist sayısının konvansiyonel-ICSI'ye kıyasla önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi.

Piezo-ICSI protokolünde 2 kritik adım vardır. İlk adım, pipet tutucunun tutucu kapağını sıkıca bükmektir. İkinci adım, aspire edilen PVP hacmini mikropipete 300 mikrometreden daha az tutmaktır. Mikropipet tutucunun tutucu kapağının gevşek bir şekilde bükülmesi ve PVP'nin mikropipete 300 mikrometreden fazla aspirasyonu (bir tam sperm uzunluğu yaklaşık 60 mikrometredir), azalan piezo gücü nedeniyle sperm immobilizasyonunda, zona açılmasında ve zar kırılmasında zorluklara neden olur. Özellikle, işlem sırasında mikropipete aspire edilen PVP hacmine her zaman dikkat etmeliyiz. Bu, piezo-ICSI'nin sınırlamasıdır.

Piezo gücünü oluşturmak için mikropipetin içine işlem sıvısı olarak az miktarda ağır sıvı yerleştirmek önemlidir. Önceki raporlarda, cıva bir işlem sıvısı^{olarak 2,3,4} kullanılmıştır. Bununla birlikte, 5,6,7,8,9,11 yerine güvenli kullanım için cıva yerine florokarbon bazlı bir sıvı kullanılabilir. Florokarbon bazlı sıvının özgül ağırlığı 1.8'dir ve renksiz, şeffaftır ve suda çözünmez. İşlem sıvısı, spermi tutan PVP ile doğrudan temas halindedir. PVP'nin operasyon sıvısına maruz kalmasının sperm veya oosit üzerinde bazı olumsuz etkileri olabilir. Bununla birlikte, bu çalışmada piezo-ICSI'nin döllenme, sağkalım, 5. gün blastosisti oranları konvansiyonel-ICSI'ye göre anlamlı olarak daha yüksekti. Çalışma sıvısı ile PVP arasındaki doğrudan temastan kaynaklanan riskin oldukça düşük olduğuna inanıyoruz.

Daha önce mikropipet hazırlama süresini bir yağ enjektörü ve bir hava enjektörü ile ölçtük. Yağ enjektörünün ve hava enjektörünün mikropipet hazırlama süreleri sırasıyla 233 ve 106 saniye idi (P < 0.05)⁸. Yağsız olduğu için hava enjektörü ile mikropipet hazırlama süresi daha kısadır. Yağın varlığı, yapışkanlığı nedeniyle mikropipet hazırlama süresini uzatır. Mikropipeti pipet tutucusuna yerleştirdikten sonra mikropipetin içindeki yağ bölgesinde hava kabarcıkları karışırsa, piezo-ICSI çalışmayacağından pipet atılmalıdır. Ayrıca mikropipet hazırlama sırasında boşa harcanan mikropipetlerin sayısını da saydık. Yağ enjektörü ve hava enjektörü için hasta başına ortalama boşa harcanan mikropipet sayısı sırasıyla 0.28 ± 0.56 ve 0 ± 0 idi (P < 0.05),⁸. Bununla birlikte, piezo-ICSI⁸ sonrası sağkalım (%99 ve %99), döllenme (%89 ve %90) ve iyi kaliteli gün-3 embriyoları (%61 ve %61) oranlarında yağ ve hava enjektörleri arasında anlamlı bir fark yoktu. Çalışma sırasında yağ enjektörü grubunda (90 hasta) hava enjektörü grubuna (90 hasta) kıyasla fazladan 3,2 saat ve 25 mikropipet harcadık⁸. Sonuçlar, bir yağ enjektörü yerine bir hava enjektörü kullanmanın piezo-ICSI'nin iyi bir modifikasyonu olduğunu göstermektedir.

Piezo-ICSI, mikropipete sitoplazmik aspirasyon olmadan zarı yarı otomatik olarak kırabilir. Bu membran kırma prosedürü stabil ve kolaydır. Piezo-ICSI, ICSI eğitim süresinin kısaltılmasına da katkıda bulunabilir. Daha önce piezo-ICSI'nin genç bir embriyolog için sağkalım, döllenme, blastosist oranları üzerindeki etkisini değerlendirmiştik. Genç embriyolog, klinik ICSI tedavisine başlamadan önce 30 kez piezo-ICSI uygulaması aldı. Genç ve yaşlı embriyologların 1. 100 oositleri için sağkalım, fertilizasyon, blastokist oranlarını karşılaştırdık. Genç ve yaşlı embriyologların sağkalım, fertilizasyon, blastokist oranları sırasıyla %100 ve %97, %87 ve %91, %47 ve %57 idi⁹. Tüm karşılaştırma maddelerinde genç ve yaşlı embriyologlar arasında anlamlı bir fark yoktu. Bu sonuçlar, piezo-ICSI'nin, genç bir embriyoloğun ICSI eğitim süresinin kısaltılmasına katkıda bulunabilecek membran kırma prosedüründe önemli olduğunu göstermiştir.

Bazı araştırmacılar intrasitoplazmik morfolojik olarak seçilmiş sperm enjeksiyonunun (IMSI) klinik etkinliğini bildirmişlerdir. Setti ve ark. bir meta-analiz çalışmasında ICSI ve IMSI arasındaki klinik sonuçları karşılaştırmıştır¹⁰. ICSI ve IMSI grupları arasında döllenme oranlarında anlamlı bir fark yoktu¹⁰. Bununla birlikte, IMSI grubunun en kaliteli embriyo oranı, ICSI grubunun¹⁰ oranına kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti. Bildiğimiz kadarıyla, piezo-ICSI ile birlikte IMSI'nin döllenme ve embriyo gelişimi üzerindeki etkisini inceleyen hiçbir çalışma yoktur. Piezo-ICSI'de sperm seçimi büyütmesinin (400x'e karşı 1.200x) fertilizasyon ve embriyo gelişimi üzerindeki etkilerini retrospektif olarak araştırdık. 1.200x grubunun (%92) döllenme oranı, 400x grubuna (%77) kıyasla anlamlı derecede yüksekti (P = 0.0002)¹¹. 1.200x grubunun (%64) kaliteli gün-3 embriyo oranı, 400x grubuna (%46) kıyasla anlamlı derecede yüksekti (P = 0.0021)¹¹. Spermin kafasında 1.200x büyütme altında vakuol olmayan spermi seçmeye çalıştık. Bu prosedür, daha düşük derecede sperm DNA fragmantasyonu olan spermi seçebilir¹². Bu nedenle, IMSI, piezo-ICSI'nin yeni bir uygulaması olabilir.

Burada, insan ART'sinde canlı oositleri kaçırmadan ICSI sonuçlarını iyileştirebilen piezo-ICSI için bir protokol tanımladık.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.