Piezo-ICSI für humane Eizellen

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die intrazytoplasmatische Spermieninjektion in menschliche Eizellen mit einer piezobetriebenen Mikropipette.

Seit den ersten erfolgreichen Schwangerschaften, die durch intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) erreicht wurden, hat sich die ICSI zu einer wesentlichen Technik in der assistierten Reproduktionstechnologie (ART) entwickelt. ICSI verwendet Mikropipetten mit einer Stachelspitze, um die Zona pellucida und die Membran zu durchdringen. Dann wird das Zytoplasma in der Regel in die Mikropipette aspiriert, um die Membran zu brechen (konventionelle-ICSI). Die Überlebens- und Befruchtungsraten von Maus-Eizellen nach konventioneller ICSI lagen bei nur 16% bzw. 8%. Kimura und Yanagimachi verwendeten eine Piezo-Antriebseinheit, Quecksilber und eine Mikropipette mit flacher Spitze für Maus-ICSI. Der Membranbruch könnte halbautomatisch durchgeführt werden, indem diese Art von Geräten ohne zytoplasmatische Aspiration in die Mikropipette (Piezo-ICSI) kombiniert wird. Diese Autoren berichteten über signifikant höhere Überlebens- und Befruchtungsraten (80% und 78%) im Vergleich zu denen der konventionellen ICSI (16% und 8%). Daher kann die Piezo-ICSI nicht nur für Maus-Eizellen, sondern auch für humane Eizellen-ICSI wirksam sein. Es stehen jedoch nur fünf Arbeiten zur Verfügung, die die Wirksamkeit von Piezo-ICSI im Vergleich zu konventioneller ICSI für humane Eizellen untersuchten. Alle diese fünf Arbeiten berichteten über signifikant höhere Befruchtungsraten im Vergleich zu denen der konventionellen ICSI. Das Ziel des hier beschriebenen Piezo-ICSI-Protokolls ist es, die klinischen Ergebnisse der ICSI im Vergleich zur konventionellen ICSI zu verbessern.

Seit Dr. Palermo über die ersten erfolgreichen Schwangerschaften berichtete, die durch intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)¹ erreicht wurden, hat sich die ICSI zu einer unverzichtbaren Technik in der assistierten Reproduktionstechnologie (ART) entwickelt. ICSI verwendet Mikropipetten mit einer Stachelspitze, um die Zona pellucida und die Membran zu durchdringen. Dann wird das Zytoplasma in der Regel in die Mikropipette aspiriert, um die Membran zu brechen (konventionelle-ICSI). Die Überlebens- und Befruchtungsraten von Maus-Eizellen nach konventioneller ICSI lagen bei nur 16% bzw. 8%². Kimura und Yanagimachi verwendeten eine Piezo-Antriebseinheit, Quecksilber und eine Mikropipette mit flacher Spitze für die ICSI² der Maus. Der Membranbruch könnte durch die Kombination dieser Gerätetypen (Piezo-ICSI) halbautomatisch durchgeführt werden. Diese Autoren berichteten über signifikant höhere Überlebens- und Befruchtungsraten (80% und 78%) von Piezo-ICSI im Vergleich zu denen von konventioneller ICSI (16% und 8%)². Einer der Gründe für die besseren Ergebnisse bei der Piezo-ICSI könnte der Prozess des Membranbruchs sein. Die Piezo-ICSI kann die Membran ohne zytoplasmatische Aspiration stabil und halbautomatisch in die Mikropipette aufbrechen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die zytoplasmatische Aspiration in die Mikropipette während des Membranbruchs für Maus-Eizellen invasiv ist. Daher kann die Piezo-ICSI nicht nur für Maus-Eizellen, sondern auch für humane Eizellen-ICSI wirksam sein.

Allerdings haben nur fünf verfügbare Arbeiten die Wirksamkeit von Piezo-ICSI im Vergleich zu konventioneller ICSI für menschliche Eizellen untersucht. Alle fünf dieser Arbeiten berichteten über signifikant höhere Befruchtungsraten mit Piezo-ICSI im Vergleich zu Befruchtungsraten mit konventioneller ICSI 3,4,5,6,7 (Tabelle 1). Daher kann die Piezo-ICSI die Überlebens- und Befruchtungsraten im Vergleich zur konventionellen ICSI verbessern. Das Ziel des hier beschriebenen Piezo-ICSI-Protokolls ist es, die klinischen Ergebnisse der ICSI im Vergleich zur konventionellen ICSI zu verbessern.

Das im Folgenden beschriebene Protokoll der Piezo-ICSI folgt den Richtlinien der Ethikkommission für die Humanforschung am Kameda Medical Center.

1. Ausrüstung und Vorbereitung

1. Verwenden Sie ein Piezo-ICSI-System, das aus einer Antriebseinheit, einer Bedienbox, einem Fußschalter und einem Controller besteht. Verwenden Sie jede Art von inversem Mikroskop oder dreiachsigem Mikromanipulator. Befestigen Sie die Piezo-Antriebseinheit an der Mikropipettenhalterung und platzieren Sie den Fußschalter auf dem Boden. Stellen Sie die Stufe INTENSITY auf 2 und die Stufe SPEED auf 1 an der Bedienbox.
2. Verwenden Sie eine handelsübliche Piezo-ICSI-Mikropipette mit flacher Spitze. Füllen Sie eine Mikropipette mit der Operationsflüssigkeit (Flüssigkeit auf Fluorkohlenwasserstoffbasis) bis zu einer Länge von 20 mm. Vermeiden Sie es, Luftblasen in der Betriebsflüssigkeit zu vermischen. Saugen Sie mit der Flüssigkeitsfüllvorrichtung Luftblasen oder überschüssige Betriebsflüssigkeit in Richtung der Rückseite der Pipette ab.
3. Setzen Sie die Mikropipette in den Mikropipettenhalter für die Injektion ein. Wenn der Halter für die Injektionsmikropipette über ein Silikonröhrchen verfügt, führen Sie den Kopf der Pipette etwa 5 mm in das Silikonröhrchen ein. Ziehen Sie die Halterkappe fest und fixieren Sie die Mikropipette fest.
4. Befestigen Sie die Antriebseinheit am Manipulator und befestigen Sie sie fest, um eine Drehung durch das Gewicht zu vermeiden.
5. Positionieren Sie die Mikropipette im Mikroskopfeld. Betätigen Sie den Injektor und drücken Sie die Betriebsflüssigkeit zum Kopf der Mikropipette, so dass die Luft im Kopf der Pipette herausgedrückt wird. Vergewissern Sie sich, dass sich keine Luft mehr im Kopf der Pipette befindet, mit bloßem Auge und nicht mit einem Mikroskop.
6. Bereiten Sie die ICSI-Schale auf der Glasbodenschale zu, wie in Abbildung 1 gezeigt. Bereiten Sie zwei Mikrotröpfchen mit 7%iger Polyvinylpyrrolidonlösung (PVP) vor: Der kleinere Mikrotröpfchen ist für die Herstellung einer Mikropipette (5 μl) und der andere für die Spermienauswahl (10 μl) bestimmt. Bereiten Sie ein weiteres Tröpfchen in der Mitte der Glasbodenschale aus dem gepufferten Medium vor; Dieses Mikrotröpfchen ist für die Eizelle bestimmt und wird für die Spermieninjektion (8 μL) verwendet.
7. Führen Sie den Kopf der Mikropipette in ein 7%iges PVP-Tröpfchen ein und beschichten Sie die Innenwand der Mikropipette. Betätigen Sie den Injektor kräftig und bewegen Sie ihn entlang der Grenzfläche zwischen der Betriebsflüssigkeit und dem PVP. Spülen Sie das Innere der Mikropipette mit PVP etwa 800 μm vom Kopf der Pipette entfernt.
   1. Wiederholen Sie diesen Vorgang (~3 oder 4 Mal), bis die Grenzflächengrenze sanft gleitet.

2. Immobilisierung der Spermien

1. Stellen Sie die Stufe INTENSITY auf 2 und die Stufe SPEED auf 1 an der Bedienbox. Legen Sie den Piezoimpuls von der Antriebseinheit an, die an der Mikropipettenhalterung befestigt ist, wenn der Fußschalter eingeschaltet wird. Wenn Sie den Piezo-Impuls während des Eingriffs anwenden, erscheint das Symbol "Piezo-Impuls" oben rechts im Video.
2. Sammeln Sie die beweglichen Spermien mit Hilfe eines Dichtegradienten und halten Sie die gesammelten beweglichen Spermien in das gepufferte Medium. Aspirieren Sie das gepufferte Medium, das die gesammelten beweglichen Spermien enthält, mit einer Pipette um etwa 2-3 μl. Injizieren Sie dann dieses Medium in die Unterseite des 7%igen PVP-Mikrotröpfchens. Wählen Sie das Sperma unter 400-facher Vergrößerung aus.
   1. Befestigen Sie die Spitze der Mikropipette am Schwanz des ausgewählten Spermiums und treiben Sie dann die Piezo-Antriebseinheit an. Wiederholen Sie in der Regel das Fahren 3 Mal für eine Spermien-Immobilisierung. Nach der Spermienimmobilisierung aspirieren Sie die Spermien zuerst in den Schwanz der Mikropipette.

3. Piezo-ICSI-Operation (eine Eizelle mit einer Membran mit hoher Dehnungsfähigkeit)

1. Halten Sie den Kopf des Spermiums in einer Position, die etwa ein Spermium in voller Länge vom Kopf der Mikropipette entfernt ist. Während Sie die Piezo-Antriebseinheit antreiben (ca. 5 Mal pro Eizelle), schieben Sie die Mikropipette vor, um die Punktion ohne Verformung der Zona pellucida durchzuführen. Wenn die Mikropipettenspitze die innere Schicht der Zona pellucida erreicht und dann das ausgehöhlte Stück der Zona pellucida vollständig in die Mikropipette aspiriert wird, ist die Punktion der Zona pellucida abgeschlossen.
2. Entfernen Sie das ausgehöhlte Stück der Zona pellucida im Inneren der Mikropipette und bewegen Sie gleichzeitig das Sperma zum Kopf der Mikropipette. Schieben Sie die Mikropipette hinein und dehnen Sie die Zytoplasmamembran bis etwa 90% des Eizellendurchmessers.
3. Wenn er ausreichend gedehnt ist, starten Sie den Piezoantrieb einmal, um die Membran zu sprengen. Der Membranbruch ist abgeschlossen, wenn bestätigt wird, dass die Membran zurückprallt.
4. Nach dem Membranbruch injizieren Sie den Kopf des Spermiums in die Eizelle. Nachdem der Kopf des Spermas sicher in das Zytoplasma injiziert wurde, achten Sie darauf, keine unnötige Flüssigkeit hinzuzufügen.

4. Piezo-ICSI-Operation (eine Eizelle mit einer Membran mit geringer Dehnungsfähigkeit)

HINWEIS: Wir erklären, wie man mit einer Eizelle mit einer Membran mit geringer Dehnungsfähigkeit umgeht, die während der Dehnung spontan reißen kann.

1. Führen Sie die gleiche Aktion wie die Eizelle mit einer Membran mit hoher Dehnungsfähigkeit bis zur Dehnung der Zytoplasmamembran aus.
2. Wenn die Membran während der Aktion spontan reißt, injizieren Sie den Kopf des Spermas aus der Position der Mikropipette, ohne ihn weiter nach vorne zu schieben, um die Degeneration der Eizellen nach der Spermieninjektion zu vermeiden.
3. Nachdem der Kopf des Spermas sicher in das Zytoplasma injiziert wurde, achten Sie darauf, keine unnötige Flüssigkeit hinzuzufügen.

Die oben beschriebenen konventionellen ICSI und Piezo-ICSI wurden an 10.488 reifen Eizellen (1.744 Zyklen) von 4 Embryologen durchgeführt. Davon wurden 3.522 Eizellen (587 Zyklen) zwischen Januar 2013 und September 2016 mit konventioneller ICSI und 6.966 Eizellen (1.157 Zyklen) zwischen Oktober 2016 und Dezember 2020 im Kameda Medical Center mit Piezo-ICSI befruchtet. Tabelle 1 zeigt das Durchschnittsalter der Frauen, die Befruchtungsraten, die Überlebensraten, die Degenerationsraten, die Tag-5-Blastozystenraten und die durchschnittliche Anzahl der kryokonservierten Blastozysten pro Zyklus der konventionellen ICSI und der Piezo-ICSI. Obwohl das Durchschnittsalter der Frauen bei Piezo-ICSI im Vergleich zu denen der konventionellen ICSI höher war, waren die Befruchtungs-, Überlebens- und Blastozystenraten sowie die durchschnittliche Anzahl kryokonservierter Blastozysten pro Zyklus der Piezo-ICSI im Vergleich zu denen der konventionellen ICSI signifikant höher (Tabelle 2).

Abbildung 1: ICSI-Schüssel für Piezo-ICSI. Das Layout der Mikrotröpfchen wird hier beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Vergleich der Befruchtungsraten zwischen konventioneller ICSI und Piezo-ICSI. In allen Berichten wurden signifikant höhere Befruchtungsraten in der Piezo-ICSI im Vergleich zu denen der konventionellen ICSI beobachtet.

Tabelle 2: Klinische Ergebnisse des Kameda Medical Center zum Vergleich der Wirksamkeit von konventioneller ICSI und Piezo-ICSI. In allen Vergleichspunkten wurden signifikant bessere Ergebnisse in der Piezo-ICSI im Vergleich zu denen der konventionellen ICSI beobachtet.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Befruchtungsraten, die Überlebensraten, die Tag-5-Blastozystenraten und die durchschnittliche Anzahl kryokonservierter Blastozysten der Piezo-ICSI im Vergleich zu denen der konventionellen ICSI signifikant höher waren.

Das Piezo-ICSI-Protokoll besteht aus 2 kritischen Schritten. Der erste Schritt besteht darin, die Halterkappe des Pipettenhalters fest zu verdrehen. Der zweite Schritt besteht darin, das aspirierte PVP-Volumen in der Mikropipette bei weniger als 300 Mikrometern zu halten. Das lockere Verdrehen der Halterkappe des Mikropipettenhalters und das Aspirieren von PVP in die Mikropipette um mehr als 300 Mikrometer (eine volle Spermienlänge beträgt etwa 60 Mikrometer) verursachen aufgrund der abnehmenden Piezoleistung Schwierigkeiten bei der Immobilisierung der Spermien, das Öffnen der Zona und den Membranbruch. Insbesondere müssen wir während des Eingriffs immer auf das in die Mikropipette aspirierte PVP-Volumen achten. Hier liegt die Grenze des Piezo-ICSI.

Es ist wichtig, eine kleine Menge schwerer Flüssigkeit als Betriebsflüssigkeit in die Mikropipette zu geben, um die Piezoleistung zu erzeugen. In den vorangegangenen Berichten wurde Quecksilber als Betriebsflüssigkeit^{verwendet 2,3,4}. Es kann jedoch eine Flüssigkeit auf Fluorkohlenwasserstoffbasis anstelle von Quecksilber für die sichere Verwendung verwendet werden 5,6,7,8,9,11. Die Flüssigkeit auf Fluorkohlenstoffbasis hat ein spezifisches Gewicht von 1,8 und ist farblos, transparent und nicht wasserlöslich. Die Operationsflüssigkeit hat direkten Kontakt mit dem PVP, das das Sperma hält. Die Exposition des PVP gegenüber der Operationsflüssigkeit kann einige negative Auswirkungen auf das Sperma oder die Eizelle haben. Die Befruchtungs-, Überlebens- und Tag-5-Blastozysten der Piezo-ICSI waren jedoch in der vorliegenden Studie signifikant höher als die der konventionellen ICSI. Wir glauben, dass das Risiko, das durch den direkten Kontakt zwischen der Betriebsflüssigkeit und dem PVP entsteht, recht gering ist.

Zuvor haben wir die Zeit der Vorbereitung der Mikropipette mit einem Ölinjektor und einem Luftinjektor gemessen. Die durchschnittliche Zeit für die Vorbereitung der Mikropipetten des Ölinjektors und des Luftinjektors betrug 233 bzw. 106 Sekunden (P < 0,05)⁸. Die Vorbereitungszeit für die Mikropipette mit dem Luftinjektor ist geringer, da er ölfrei ist. Das Vorhandensein des Öls verlängert die Vorbereitungszeit der Mikropipette aufgrund seiner Klebrigkeit. Wenn sich nach dem Einsetzen der Mikropipette in den Pipettenhalter Luftblasen im Ölbereich innerhalb der Mikropipette vermischen, muss die Pipette verworfen werden, da die Piezo-ICSI nicht funktioniert. Wir haben auch die Anzahl der verschwendeten Mikropipetten während der Mikropipettenvorbereitung gezählt. Die durchschnittliche Anzahl der verschwendeten Mikropipetten pro Patient für den Ölinjektor und den Luftinjektor betrug 0,28 ± 0,56 bzw. 0 ± 0 (P < 0,05)⁸. Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen den Öl- und Luftinjektoren in den Überlebensraten (99% und 99%), der Befruchtung (89% und 90%) und der guten Qualität der Tag-3-Embryonen (61% und 61%) nach Piezo-ICSI⁸. Wir verschwendeten während der Studie 3,2 Stunden und 25 Mikropipetten in der Gruppe der Ölinjektoren (90 Patienten) im Vergleich zur Gruppe der Luftinjektoren (90 Patienten)⁸. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Verwendung eines Luftinjektors anstelle eines Ölinjektors eine gute Modifikation von Piezo-ICSI ist.

Die Piezo-ICSI kann die Membran halbautomatisch ohne zytoplasmatische Aspiration in die Mikropipette aufbrechen. Dieses Verfahren zum Brechen der Membran ist stabil und einfach. Die Piezo-ICSI könnte auch dazu beitragen, die ICSI-Einarbeitungszeit zu verkürzen. Wir haben zuvor die Wirkung der Piezo-ICSI auf die Überlebensraten, die Befruchtung und die Blastozyste bei einem jungen Embryologen untersucht. Die junge Embryologin erhielt 30 Mal eine Piezo-ICSI-Übung, bevor sie mit der klinischen ICSI-Behandlung begann. Wir verglichen die Überlebens-, Befruchtungs- und Blastozystenraten von jungen und älteren Embryologen für ihre 1. 100 Eizellen. Die Überlebens-, Befruchtungs- und Blastozystenraten der jungen und älteren Embryologen betrugen 100 % und 97 %, 87 % und 91 %, 47 % bzw. 57 %⁹. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den jungen und den leitenden Embryologen in allen Vergleichselementen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Piezo-ICSI eine Bedeutung für den Membranbruch hat, die zur Verkürzung der ICSI-Ausbildungszeit eines jungen Embryologen beitragen kann.

Einige Forscher berichteten über die klinische Wirksamkeit der intrazytoplasmatischen morphologisch selektierten Spermieninjektion (IMSI). Setti et al. verglichen die klinischen Ergebnisse zwischen ICSI und IMSI in einer Meta-Analyse-Studie¹⁰. Es gab keinen signifikanten Unterschied in den Befruchtungsraten zwischen der ICSI- und der IMSI-Gruppe¹⁰. Die Spitzenembryonenrate der IMSI-Gruppe war jedoch im Vergleich zu der der ICSI-Gruppe^{signifikant höher 10}. Unseres Wissens nach hat keine Studie den Einfluss von IMSI in Kombination mit Piezo-ICSI auf die Befruchtung und Embryonalentwicklung untersucht. Wir untersuchten retrospektiv die Auswirkungen der Vergrößerung der Spermienauswahl (400x vs. 1.200x) auf die Befruchtung und Embryonalentwicklung bei Piezo-ICSI. Die Befruchtungsrate der 1.200-fachen Gruppe (92 %) war signifikant höher als die der 400-fachen Gruppe (77 %) (P = 0,0002)¹¹. Die gute Qualität der Tag-3-Embryonenrate der 1.200-fachen Gruppe (64%) war signifikant höher als die der 400-fachen Gruppe (46%) (P = 0,0021)¹¹. Wir haben versucht, die Spermien ohne Vakuolen im Kopf der Spermien unter 1.200-facher Vergrößerung auszuwählen. Bei diesem Verfahren können die Spermien mit einem geringeren Grad an Spermien-DNA-Fragmentierung ausgewählt^{werden 12}. Daher könnte das IMSI eine neue Anwendung von Piezo-ICSI sein.

Hier haben wir ein Protokoll für Piezo-ICSI beschrieben, das die ICSI-Ergebnisse verbessern kann, ohne lebensfähige Eizellen in der humanen ART zu übersehen.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.