Piezo-ICSI para ovocitos humanos

En este artículo, describimos un protocolo para la inyección intracitoplasmática de espermatozoides en ovocitos humanos utilizando una micropipeta piezoeléctrica.

Desde que se reportaron los primeros embarazos exitosos logrados por inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), la ICSI se ha convertido en una técnica esencial en la tecnología de reproducción asistida (TRA). ICSI utiliza micropipetas con una punta de púa para penetrar en la zona pelúcida y la membrana. A continuación, el citoplasma suele aspirarse en la micropipeta para la rotura de la membrana (ICSI convencional). Las tasas de supervivencia y fertilización de los ovocitos de ratón después de la ICSI convencional fueron tan bajas como 16% y 8%, respectivamente. Kimura y Yanagimachi aplicaron una unidad de accionamiento piezoeléctrico, mercurio, y una micropipeta con punta plana para el ICSI del ratón. La rotura de la membrana se puede realizar de forma semiautomática combinando este tipo de equipos sin aspiración citoplasmática en la micropipeta (piezo-ICSI). Estos autores informaron tasas de supervivencia y fertilización significativamente más altas (80% y 78%) en comparación con las de ICSI convencional (16% y 8%). Por lo tanto, la ICSI piezoeléctrica puede ser eficaz no solo para los ovocitos de ratón, sino también para la ICSI de ovocitos humanos. Sin embargo, solo hay cinco artículos disponibles que evaluaron la efectividad de la ICSI piezoeléctrica en comparación con la ICSI convencional para ovocitos humanos. Todos estos cinco artículos informaron tasas de fertilización significativamente más altas en comparación con las de ICSI convencional. El objetivo del protocolo piezo-ICSI descrito aquí es mejorar los resultados clínicos de la ICSI en comparación con la ICSI convencional.

Desde que el Dr. Palermo reportó los primeros embarazos exitosos logrados por inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)¹, la ICSI se ha convertido en una técnica esencial en la tecnología de reproducción asistida (TRA). ICSI utiliza micropipetas con una punta de púa para penetrar en la zona pelúcida y la membrana. A continuación, el citoplasma suele aspirarse en la micropipeta para la rotura de la membrana (ICSI convencional). Las tasas de supervivencia y fertilización de los ovocitos de ratón después de la ICSI convencional fueron tan bajas como 16% y 8%, respectivamente². Kimura y Yanagimachi aplicaron una unidad de accionamiento piezoeléctrico, mercurio, y una micropipeta con punta plana para el ratón ICSI². La rotura de la membrana se puede realizar de forma semiautomática mediante la combinación de este tipo de equipos (piezo-ICSI). Estos autores informaron tasas de supervivencia y fertilización significativamente más altas (80% y 78%) de la ICSI piezoeléctrica en comparación con las de la ICSI convencional (16% y 8%)². Una de las razones de los mejores resultados obtenidos en el piezo-ICSI puede ser el proceso de rotura de la membrana. El piezo-ICSI puede romper la membrana de forma estable y semiautomática sin necesidad de aspiración citoplasmática en la micropipeta. Estos resultados sugirieron que la aspiración citoplasmática en la micropipeta durante la rotura de la membrana es invasiva para los ovocitos de ratón. Por lo tanto, la ICSI piezoeléctrica puede ser eficaz no solo para los ovocitos de ratón, sino también para la ICSI de ovocitos humanos.

Sin embargo, solo cinco artículos disponibles han evaluado la efectividad de la ICSI piezoeléctrica en comparación con la ICSI convencional para ovocitos humanos. Los cinco artículos informaron tasas de fertilización significativamente más altas con piezo-ICSI en comparación con las tasas de fertilización con ICSI convencional 3,4,5,6,7 (Tabla 1). Por lo tanto, la piezo-ICSI puede mejorar las tasas de supervivencia y fertilización en comparación con la ICSI convencional. El objetivo del protocolo piezo-ICSI descrito aquí es mejorar los resultados clínicos de la ICSI en comparación con la ICSI convencional.

El protocolo de piezo-ICSI que se describe a continuación sigue las directrices del comité de ética de investigación en seres humanos del Centro Médico Kameda.

1. Equipamiento y preparación

1. Utilice un sistema piezo-ICSI compuesto por una unidad de accionamiento, una caja de operaciones, un interruptor de pie y un controlador. Utilice cualquier tipo de microscopio invertido o micromanipulador de tres ejes. Conecte la unidad de accionamiento piezoeléctrico al soporte de micropipetas y coloque el interruptor de pedal en el suelo. Ajuste el nivel de INTENSIDAD a 2 y el nivel de VELOCIDAD a 1 en la caja de operación.
2. Utilice una micropipeta piezoeléctrica ICSI disponible en el mercado con una punta plana. Llene una micropipeta con el líquido de operación (fluido a base de fluorocarbonos) hasta una longitud de 20 mm. Evite mezclar burbujas de aire en el líquido de operación. Aspire las burbujas de aire o el exceso de líquido de funcionamiento hacia la parte posterior de la pipeta con el dispositivo de llenado de líquido.
3. Instale la micropipeta en el soporte de micropipetas de inyección. Si el soporte de la micropipeta de inyección tiene un tubo de silicona, inserte la cabeza de la pipeta unos 5 mm en el tubo de silicona. Apriete la tapa del soporte y fije firmemente la micropipeta.
4. Fije la unidad de accionamiento al manipulador y fíjela firmemente para evitar cualquier rotación causada por su peso.
5. Coloque la micropipeta en el campo del microscopio. Accione el inyector y empuje el líquido de operación hacia la cabeza de la micropipeta para que el aire dentro de la cabeza de la pipeta sea expulsado. Confirme que no queda aire dentro de la cabeza de la pipeta a simple vista en lugar de con un microscopio.
6. Prepare el plato ICSI en el plato con fondo de vidrio como se muestra en la Figura 1. Prepare dos microgotas de solución de polivinilpirrolidona (PVP) al 7%: la microgota más pequeña es para la preparación de la micropipeta (5 μL) y la otra es para la selección de espermatozoides (10 μL). Prepare otra gota hecha en el centro del plato con fondo de vidrio a partir del medio tamponado; esta microgota es para el ovocito y se utiliza para la inyección de espermatozoides (8 μL).
7. Inserte el cabezal de la micropipeta en una gota de PVP al 7% y cubra la pared interna de la micropipeta. Opere el inyector vigorosamente, moviéndolo a lo largo del límite interfacial entre el líquido de operación y el PVP. Enjuague el interior de la micropipeta con PVP a unos 800 μm de la cabeza de la pipeta.
   1. Repita este procedimiento (~ 3 o 4 veces) hasta que el límite interfacial se deslice suavemente.

2. Inmovilización de espermatozoides

1. Ajuste el nivel de INTENSIDAD a 2 y el nivel de VELOCIDAD a 1 en la caja de operación. Aplique el pulso piezoeléctrico desde la unidad de accionamiento conectada al soporte de micropipeta cuando el interruptor de pedal esté encendido. Al aplicar el pulso piezoeléctrico durante el procedimiento, aparece el icono "Pulso piezoeléctrico" en la parte superior derecha del vídeo.
2. Recoja los espermatozoides móviles mediante un gradiente de densidad y mantenga los espermatozoides móviles recolectados en el medio tamponado. Aspire el medio tamponado que contiene los espermatozoides móviles recolectados alrededor de 2-3 μL con una pipeta. A continuación, inyecte este medio en la parte inferior de la microgota PVP al 7%. Seleccione el esperma con un aumento de 400x.
   1. Coloque la punta de la micropipeta en la cola del esperma seleccionado y, a continuación, accione la unidad de accionamiento piezoeléctrico. Por lo general, repita la conducción 3 veces para una inmovilización de espermatozoides. Después de la inmovilización de los espermatozoides, aspire primero los espermatozoides en la cola de la micropipeta.

3. Operación piezo-ICSI (un ovocito con una membrana de alta capacidad de estiramiento)

1. Mantenga la cabeza de los espermatozoides en una posición aproximadamente a un espermatozoide de longitud completa de la cabeza de la micropipeta. Mientras se acciona la unidad piezoeléctrica (unas 5 veces por ovocito), avance la micropipeta para realizar la punción sin deformación de la zona pelúcida. Cuando la punta de la micropipeta llega a la capa interna de la zona pelúcida y luego la pieza ahuecada de la zona pelúcida se aspira completamente en la micropipeta, se completa la punción de la zona pelúcida.
2. Retire la pieza hueca de la zona pelúcida dentro de la micropipeta y, al mismo tiempo, mueva los espermatozoides a la cabeza de la micropipeta. Empuje la micropipeta hacia adentro y estire la membrana citoplasmática hasta aproximadamente el 90% del diámetro del ovocito.
3. Cuando esté lo suficientemente estirado, ponga en marcha el accionamiento piezoeléctrico una vez para romper la membrana. La rotura de la membrana se completa cuando se confirma que la membrana ha rebotado.
4. Después de la rotura de la membrana, inyecte la cabeza del espermatozoide en el ovocito. Después de que la cabeza del espermatozoide se inyecte seguramente en el citoplasma, preste atención a no agregar líquido innecesario.

4. Operación piezo-ICSI (un ovocito con una membrana de baja capacidad de estiramiento)

NOTA: Te explicamos cómo tratar un ovocito con una membrana de baja capacidad de estiramiento que puede romperse espontáneamente durante el estiramiento.

1. Realiza la misma acción que el ovocito con una membrana de alta capacidad de estiramiento hasta el punto de estirar la membrana citoplasmática.
2. Si la membrana se rompe espontáneamente durante la acción, inyecte la cabeza del espermatozoide desde la posición de la micropipeta sin empujarla más hacia adelante para evitar la degeneración de los ovocitos después de la inyección de espermatozoides.
3. Después de que la cabeza del espermatozoide se inyecte seguramente en el citoplasma, preste atención a no agregar líquido innecesario.

La ICSI convencional y la piezo-ICSI descritas anteriormente se realizaron en 10.488 ovocitos maduros (1.744 ciclos) por 4 embriólogos. De estos, 3.522 ovocitos (587 ciclos) fueron inseminados por ICSI convencional entre enero de 2013 y septiembre de 2016 y 6.966 ovocitos (1.157 ciclos) fueron inseminados por piezo-ICSI entre octubre de 2016 y diciembre de 2020 en el Centro Médico Kameda. La Tabla 1 muestra la edad promedio de las mujeres, las tasas de fertilización, las tasas de supervivencia, las tasas de degeneración, las tasas de blastocistos en el día 5 y el número promedio de blastocistos criopreservados por ciclos de ICSI convencional y piezoeléctrico. A pesar de que la edad promedio de las mujeres para la ICSI piezoeléctrica fue mayor en comparación con la de la ICSI convencional, las tasas de fertilización, supervivencia y blastocisto y el número promedio de blastocistos criopreservados por ciclos de la ICSI piezoeléctrica fueron significativamente más altas en comparación con las de la ICSI convencional (Tabla 2).

Figura 1: Antena ICSI utilizada para piezo-ICSI. Aquí se describe el diseño de las microgotas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Comparación de las tasas de fertilización entre ICSI convencional y piezoeléctrico. En todos los informes, se observaron tasas de fertilización significativamente más altas en el piezo-ICSI en comparación con las del ICSI convencional.

Tabla 2: Resultados clínicos del Centro Médico Kameda comparando la eficacia de la ICSI convencional y la piezo-ICSI. En todos los ítems de comparación, se observaron resultados significativamente mejores en el piezo-ICSI en comparación con los del ICSI convencional.

Los resultados demostraron que las tasas de fertilización, las tasas de supervivencia, las tasas de blastocistos del día 5 y el número promedio de blastocistos criopreservados de la ICSI piezoeléctrica fueron significativamente más altas en comparación con las de la ICSI convencional.

Hay 2 pasos críticos en el protocolo piezo-ICSI. El primer paso es girar firmemente la tapa del soporte del soporte de pipeta. El segundo paso es mantener el volumen de PVP aspirado en la micropipeta a menos de 300 micrómetros. Girar sin apretar la tapa del soporte de la micropipeta y aspirar PVP en la micropipeta más de 300 micrómetros (una longitud completa de esperma es de aproximadamente 60 micrómetros) causa dificultades en la inmovilización de espermatozoides, apertura de la zona y rotura de la membrana debido a la disminución de la potencia piezoeléctrica. En particular, siempre debemos prestar atención al volumen de PVP aspirado en la micropipeta durante el procedimiento. Esta es la limitación del piezo-ICSI.

Es esencial colocar una pequeña cantidad de líquido pesado como líquido de operación dentro de la micropipeta para crear la potencia piezoeléctrica. En los informes anteriores, el mercurio se utilizó como líquido de operación ^2,3,4. Sin embargo, se puede usar un fluido a base de fluorocarbono en lugar de mercurio para un uso seguro 5,6,7,8,9,11. El líquido a base de fluorocarbono tiene un peso específico de 1,8 y es incoloro, transparente y no soluble en agua. El líquido de operación tiene contacto directo con el PVP que contiene los espermatozoides. La exposición del PVP al líquido de operación puede tener algunos efectos negativos en el espermatozoide o el ovocito. Sin embargo, las tasas de fertilización, supervivencia, blastocisto de día-5 de piezo-ICSI fueron significativamente más altas en comparación con las de ICSI convencional en el presente estudio. Creemos que el riesgo del contacto directo entre el líquido de operación y el PVP es bastante bajo.

Previamente medimos el tiempo de preparación de la micropipeta con un inyector de aceite y un inyector de aire. Los tiempos medios de preparación de la micropipeta del inyector de aceite y del inyector de aire fueron de 233 y 106 segundos, respectivamente (P < 0,05)⁸. El tiempo de preparación de la micropipeta con el inyector de aire es menor porque no contiene aceite. La presencia del aceite prolonga el tiempo de preparación de la micropipeta debido a su pegajosidad. Si se mezclan burbujas de aire en el área de aceite dentro de la micropipeta después de insertar la micropipeta en el soporte de la pipeta, la pipeta debe desecharse porque el piezo-ICSI no funcionará. También contamos el número de micropipetas desperdiciadas durante la preparación de la micropipeta. El número medio de micropipetas desperdiciadas por paciente para el inyector de aceite y el inyector de aire fue de 0,28 ± 0,56 y 0 ± 0 (P < 0,05), respectivamente⁸. Sin embargo, no hubo diferencias significativas entre los inyectores de aceite y aire en las tasas de supervivencia (99% y 99%), fertilización (89% y 90%) y embriones de día 3 de buena calidad (61% y 61%) después de piezo-ICSI⁸. Perdimos 3,2 horas y 25 micropipetas adicionales en el grupo de inyector de aceite (90 pacientes) en comparación con el grupo de inyector de aire (90 pacientes) durante el estudio⁸. Los resultados indican que el uso de un inyector de aire en lugar de un inyector de aceite es una buena modificación del piezo-ICSI.

El piezo-ICSI puede romper la membrana de forma semiautomática sin aspiración citoplasmática en la micropipeta. Este procedimiento de rotura de membrana es estable y fácil. El piezo-ICSI también podría contribuir a acortar el período de formación del ICSI. Previamente evaluamos el efecto del piezo-ICSI sobre las tasas de supervivencia, fertilización, blastocisto para un embriólogo joven. El joven embriólogo recibió la práctica de piezo-ICSI 30 veces antes de comenzar el tratamiento clínico con ICSI. Comparamos las tasas de supervivencia, fertilización y blastocisto de embriólogos jóvenes y senior para sus primeros 100 ovocitos. Las tasas de supervivencia, fertilización y blastocisto de los embriólogos jóvenes y senior fueron de 100% y 97%, 87% y 91%, 47% y 57%, respectivamente⁹. No hubo diferencias significativas entre los embriólogos jóvenes y los mayores en todos los ítems de comparación. Estos resultados indicaron que el piezo-ICSI tiene importancia en el procedimiento de rotura de membrana que puede contribuir a acortar el período de formación de ICSI de un embriólogo joven.

Algunos investigadores informaron sobre la eficacia clínica de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides morfológicamente seleccionados (IMSI). Setti et al. compararon los resultados clínicos entre ICSI e IMSI en un estudio de metaanálisis¹⁰. No hubo diferencia significativa en las tasas de fertilización entre los grupos ICSI e IMSI¹⁰. Sin embargo, la tasa de embriones de alta calidad del grupo IMSI fue significativamente mayor en comparación con la del grupo ICSI¹⁰. Hasta donde sabemos, ningún estudio ha examinado el impacto de la IMSI combinada con la piezo-ICSI en la fertilización y el desarrollo embrionario. Investigamos retrospectivamente los efectos de la magnificación de la selección de espermatozoides (400x vs. 1.200x) sobre la fertilización y el desarrollo embrionario en piezo-ICSI. La tasa de fertilización del grupo 1.200x (92%) fue significativamente mayor en comparación con la del grupo 400x (77%) (P = 0,0002)¹¹. La tasa de embriones de buena calidad en el día 3 del grupo de 1.200x (64%) fue significativamente mayor en comparación con la del grupo de 400x (46%) (P = 0,0021)¹¹. Intentamos seleccionar los espermatozoides sin vacuolas en la cabeza de los espermatozoides con un aumento de 1.200x. Este procedimiento podría seleccionar los espermatozoides con un menor grado de fragmentación del ADN espermático¹². Por lo tanto, el IMSI puede ser una nueva aplicación de la piezo-ICSI.

Aquí, describimos un protocolo para piezo-ICSI que puede mejorar los resultados de ICSI sin perder ovocitos viables en el tratamiento antirretroviral humano.

Los autores no tienen nada que revelar.