Piézo-ICSI pour les ovocytes humains

Nous décrivons ici un protocole d’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes dans des ovocytes humains à l’aide d’une micropipette piézoélectrique.

Depuis que les premières grossesses réussies obtenues par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) ont été rapportées, l’ICSI est devenue une technique essentielle dans la technologie de procréation assistée (ART). L’ICSI utilise des micropipettes avec une pointe pour pénétrer dans la zone pellucide et la membrane. Ensuite, le cytoplasme est généralement aspiré dans la micropipette pour la rupture de la membrane (ICSI conventionnelle). Les taux de survie et de fécondation des ovocytes de souris après l’ICSI conventionnelle étaient aussi bas que 16 % et 8 %, respectivement. Kimura et Yanagimachi ont appliqué une unité d’entraînement piézoélectrique, du mercure, et une micropipette à pointe plate pour l’ICSI de souris. La rupture de la membrane pourrait être effectuée de manière semi-automatique en combinant ces types d’équipements sans aspiration cytoplasmique dans la micropipette (piézo-ICSI). Ces auteurs ont signalé des taux de survie et de fécondation significativement plus élevés (80 % et 78 %) que ceux de l’ICSI conventionnelle (16 % et 8 %). Par conséquent, la PIÉZO-ICSI peut être efficace non seulement pour les ovocytes de souris, mais aussi pour l’ICSI des ovocytes humains. Cependant, seuls cinq articles sont disponibles qui ont évalué l’efficacité de la piézo-ICSI par rapport à l’ICSI conventionnelle pour les ovocytes humains. Ces cinq articles ont fait état de taux de fécondation significativement plus élevés que ceux de l’ICSI conventionnelle. L’objectif du protocole piézo-ICSI décrit ici est d’améliorer les résultats cliniques de l’ICSI par rapport à l’ICSI conventionnelle.

Depuis que le Dr Palermo a signalé les premières grossesses réussies obtenues par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI)¹, l’ICSI est devenue une technique essentielle dans la technologie de procréation assistée (ART). L’ICSI utilise des micropipettes avec une pointe pour pénétrer dans la zone pellucide et la membrane. Ensuite, le cytoplasme est généralement aspiré dans la micropipette pour la rupture de la membrane (ICSI conventionnelle). Les taux de survie et de fécondation des ovocytes de souris après l’ICSI conventionnelle étaient aussi bas que 16 % et 8 %, respectivement². Kimura et Yanagimachi ont appliqué une unité d’entraînement piézoélectrique, du mercure, et une micropipette à pointe plate pour souris ICSI². La rupture de la membrane pourrait être effectuée de manière semi-automatique en combinant ces types d’équipements (piézo-ICSI). Ces auteurs ont signalé des taux de survie et de fécondation significativement plus élevés (80 % et 78 %) de l’ICSI piézoélectrique par rapport à ceux de l’ICSI conventionnelle (16 % et 8 %)². L’une des raisons des meilleurs résultats obtenus dans le piézo-ICSI peut être le processus de rupture de la membrane. Le piézo-ICSI peut briser de manière stable et semi-automatique la membrane sans aspiration cytoplasmique dans la micropipette. Ces résultats suggèrent que l’aspiration cytoplasmique dans la micropipette lors de la rupture de la membrane est invasive pour les ovocytes de souris. Par conséquent, la PIÉZO-ICSI peut être efficace non seulement pour les ovocytes de souris, mais aussi pour l’ICSI des ovocytes humains.

Cependant, seuls cinq articles disponibles ont évalué l’efficacité de l’ICSI piézoélectrique par rapport à l’ICSI conventionnelle pour les ovocytes humains. Ces cinq articles ont rapporté des taux de fécondation significativement plus élevés avec l’ICSI piézoélectrique par rapport aux taux de fécondation avec l’ICSI conventionnelle 3,4,5,6,7 (tableau 1). Par conséquent, l’ICSI piézoélectrique peut améliorer les taux de survie et de fécondation par rapport à l’ICSI conventionnelle. L’objectif du protocole piézo-ICSI décrit ici est d’améliorer les résultats cliniques de l’ICSI par rapport à l’ICSI conventionnelle.

Le protocole de piézo-ICSI décrit ci-dessous suit les directives du comité d’éthique de la recherche humaine du Centre médical Kameda.

1. Équipement et préparation

1. Utilisez un système piézo-ICSI composé d’une unité d’entraînement, d’un boîtier de commande, d’une pédale de commande et d’un contrôleur. Utilisez n’importe quel type de microscope inversé ou de micromanipulateur à trois axes. Fixez l’unité d’entraînement piézoélectrique au support de micropipette et placez la pédale sur le sol. Réglez le niveau d’intensité sur 2 et le niveau de vitesse sur 1 sur la boîte de commande.
2. Utilisez une micropipette piézo-ICSI disponible dans le commerce avec une pointe plate. Remplissez une micropipette avec le liquide d’opération (fluide à base de fluorocarbone) sur une longueur de 20 mm. Évitez de mélanger des bulles d’air dans le liquide de fonctionnement. Aspirez les bulles d’air ou l’excès de liquide de fonctionnement vers l’arrière de la pipette avec le dispositif de remplissage de liquide.
3. Installez la micropipette dans le support de micropipette d’injection. Si le support de micropipette d’injection est équipé d’un tube en silicone, insérez la tête de la pipette à environ 5 mm dans le tube en silicone. Serrez le capuchon du support et fixez fermement la micropipette.
4. Fixez l’unité d’entraînement au manipulateur et fixez-la fermement pour éviter toute rotation causée par son poids.
5. Positionnez la micropipette dans le champ du microscope. Faites fonctionner l’injecteur et poussez le liquide de fonctionnement vers la tête de la micropipette de sorte que tout air à l’intérieur de la tête de la pipette soit expulsé. Confirmez qu’il n’y a plus d’air à l’intérieur de la tête de la pipette à l’œil nu plutôt qu’au microscope.
6. Préparez le plat ICSI sur le plat à fond de verre comme illustré à la figure 1. Préparez deux microgouttelettes d’une solution de polyvinylpyrrolidone (PVP) à 7 % : la plus petite microgouttelette est destinée à la préparation d’une micropipette (5 μL) et l’autre à la sélection des spermatozoïdes (10 μL). Préparez une autre gouttelette faite au centre du plat à fond de verre à partir du milieu tamponné ; cette microgouttelette est destinée à l’ovocyte et est utilisée pour l’injection de spermatozoïdes (8 μL).
7. Insérez la tête de la micropipette dans une gouttelette PVP à 7 % et recouvrez la paroi intérieure de la micropipette. Faites fonctionner l’injecteur vigoureusement, en le déplaçant le long de la limite interfaciale entre le liquide de fonctionnement et le PVP. Rincez l’intérieur de la micropipette avec du PVP à environ 800 μm de la tête de la pipette.
   1. Répétez cette procédure (~3 ou 4 fois) jusqu’à ce que la limite interfaciale glisse en douceur.

2. Immobilisation des spermatozoïdes

1. Réglez le niveau d’intensité sur 2 et le niveau de vitesse sur 1 sur la boîte de commande. Appliquez l’impulsion piézoélectrique de l’unité d’entraînement fixée au support de micropipette lorsque la pédale de commande est activée. Lors de l’application de l’impulsion piézoélectrique pendant la procédure, l’icône « Impulsion piézoélectrique » apparaît en haut à droite de la vidéo.
2. Collectez les spermatozoïdes mobiles à l’aide d’un gradient de densité et conservez les spermatozoïdes mobiles collectés dans le milieu tamponné. Aspirez le milieu tamponné contenant les spermatozoïdes mobiles collectés sur environ 2 à 3 μL à l’aide d’une pipette. Injectez ensuite ce milieu dans la face inférieure de la microgouttelette PVP à 7 %. Sélectionnez les spermatozoïdes sous un grossissement de 400x.
   1. Fixez l’embout de la micropipette à la queue du spermatozoïde sélectionné, puis entraînez l’unité d’entraînement piézoélectrique. En règle générale, répétez la conduite 3 fois pour une immobilisation des spermatozoïdes. Après l’immobilisation du spermatozoïde, aspirez d’abord le spermatozoïde dans la queue de la micropipette.

3. Opération piézo-ICSI (un ovocyte avec une membrane à haute capacité d’étirement)

1. Gardez la tête du spermatozoïde à une position d’environ un spermatozoïde pleine longueur en arrière de la tête de la micropipette. Tout en entraînant l’unité d’entraînement piézoélectrique (environ 5 fois par ovocyte), avancez la micropipette pour effectuer la ponction sans déformation de la zone pellucide. Lorsque la pointe de la micropipette atteint la couche interne de la zone pellucide, puis que le morceau évidé de la zone pellucide est complètement aspiré dans la micropipette, la ponction de la zone pellucide est terminée.
2. Retirez le morceau évidé de la zone pellucide à l’intérieur de la micropipette et déplacez en même temps le sperme vers la tête de la micropipette. Enfoncez la micropipette et étirez la membrane cytoplasmique jusqu’à environ 90 % du diamètre de l’ovocyte.
3. Lorsqu’il est suffisamment étiré, démarrez une fois l’entraînement piézoélectrique pour rompre la membrane. La rupture de la membrane est terminée lorsqu’il est confirmé que la membrane a rebondi.
4. Après la rupture de la membrane, injectez la tête du spermatozoïde dans l’ovocyte. Une fois que la tête du spermatozoïde est sûrement injectée dans le cytoplasme, faites attention à ne pas ajouter de liquide inutile.

4. Opération piézo-ICSI (un ovocyte avec une membrane à faible capacité d’étirement)

REMARQUE : Nous expliquons comment traiter un ovocyte avec une membrane à faible capacité d’étirement qui peut se rompre spontanément pendant l’étirement.

1. Effectuer la même action que l’ovocyte avec une membrane à haute capacité d’étirement jusqu’au point d’étirer la membrane cytoplasmique.
2. Si la membrane se rompt spontanément pendant l’action, injectez la tête du spermatozoïde depuis la position de la micropipette sans la pousser plus en avant pour éviter la dégénérescence des ovocytes après l’injection de spermatozoïdes.
3. Une fois que la tête du spermatozoïde est sûrement injectée dans le cytoplasme, faites attention à ne pas ajouter de liquide inutile.

L’ICSI conventionnelle et l’ICSI piézoélectrique décrites ci-dessus ont été réalisées sur 10 488 ovocytes matures (1 744 cycles) par 4 embryologistes. Parmi ceux-ci, 3 522 ovocytes (587 cycles) ont été inséminés par ICSI conventionnelle entre janvier 2013 et septembre 2016 et 6 966 ovocytes (1 157 cycles) ont été inséminés par ICSI piézoélectrique entre octobre 2016 et décembre 2020 au Centre Médical Kameda. Le tableau 1 montre l’âge moyen des femmes, les taux de fécondation, les taux de survie, les taux de dégénérescence, les taux de blastocystes au jour 5 et le nombre moyen de blastocystes cryoconservés par cycles d’ICSI conventionnelle et de PIÉZO-ICSI. Bien que l’âge moyen des femmes pour l’ICSI piézoélectrique soit plus élevé que celui de l’ICSI conventionnelle, les taux de fécondation, de survie et de blastocyste ainsi que le nombre moyen de blastocystes cryoconservés par cycle d’ICSI piézoélectrique étaient significativement plus élevés que ceux de l’ICSI conventionnelle (tableau 2).

Figure 1 : Antenne ICSI utilisée pour la piézo-ICSI. La disposition des microgouttelettes est décrite ici. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Comparaison des taux de fertilisation entre l’ICSI conventionnelle et l’ICSI piézo. Dans tous les rapports, des taux de fécondation significativement plus élevés ont été observés dans l’ICSI piézoélectrique par rapport à ceux de l’ICSI conventionnelle.

Tableau 2 : Résultats cliniques du Kameda Medical Center comparant l’efficacité de l’ICSI conventionnelle et de l’ICSI piézo. Dans tous les éléments de comparaison, des résultats significativement meilleurs ont été observés dans l’ICSI piézoélectrique par rapport à ceux de l’ICSI conventionnelle.

Les résultats ont démontré que les taux de fécondation, les taux de survie, les taux de blastocystes au jour 5 et le nombre moyen de blastocystes cryoconservés de l’ICSI piézoélectrique étaient significativement plus élevés que ceux de l’ICSI conventionnelle.

Il y a 2 étapes critiques dans le protocole piézo-ICSI. La première étape consiste à tourner fermement le capuchon du support de pipette. La deuxième étape consiste à maintenir le volume PVP aspiré dans la micropipette inférieur à 300 micromètres. Le fait de tordre lâchement le capuchon du support de la micropipette et l’aspiration du PVP dans la micropipette de plus de 300 micromètres (une longueur totale de spermatozoïde est d’environ 60 micromètres) entraînent des difficultés d’immobilisation des spermatozoïdes, d’ouverture de la zone et de rupture de la membrane en raison de la diminution de la puissance piézoélectrique. En particulier, nous devons toujours faire attention au volume PVP aspiré dans la micropipette pendant la procédure. C’est la limite de la piézo-ICSI.

Il est essentiel de placer une petite quantité de liquide lourd comme liquide d’opération à l’intérieur de la micropipette pour créer la puissance piézoélectrique. Dans les rapports précédents, le mercure était utilisé comme liquide d’opération ^2,3,4. Cependant, un fluide à base de fluorocarbone peut être utilisé à la place du mercure pour une utilisation sûre à la place 5,6,7,8,9,11. Le liquide à base de fluorocarbone a une densité de 1,8 et est incolore, transparent et non soluble dans l’eau. Le liquide de l’opération est en contact direct avec le PVP qui retient le sperme. L’exposition du PVP au liquide opératoire peut avoir des effets négatifs sur le spermatozoïde ou l’ovocyte. Cependant, les taux de fécondation, de survie, de blastocyste du jour-5 de l’ICSI piézoélectrique étaient significativement plus élevés que ceux de l’ICSI conventionnelle dans la présente étude. Nous pensons que le risque lié au contact direct entre le liquide de fonctionnement et le PVP est assez faible.

Nous avons précédemment mesuré le temps de préparation de la micropipette avec un injecteur d’huile et un injecteur d’air. Les temps moyens de préparation de l’injecteur d’huile et de l’injecteur d’air par micropipette étaient respectivement de 233 et 106 secondes (P < 0,05)⁸. Le temps de préparation de la micropipette avec l’injecteur d’air est plus court car il est sans huile. La présence de l’huile prolonge le temps de préparation de la micropipette en raison de son caractère collant. Si des bulles d’air se mélangent dans la zone d’huile à l’intérieur de la micropipette après avoir inséré la micropipette dans le support de pipette, la pipette doit être jetée car le piézo-ICSI ne fonctionnera pas. Nous avons également compté le nombre de micropipettes gaspillées lors de la préparation des micropipettes. Le nombre moyen de micropipettes gaspillées par patient pour l’injecteur d’huile et l’injecteur d’air était de 0,28 ± 0,56 et de 0 ± 0 (P < 0,05), respectivement⁸. Cependant, il n’y avait pas de différence significative entre les injecteurs d’huile et d’air dans les taux de survie (99 % et 99 %), de fécondation (89 % et 90 %) et d’embryons de bonne qualité au jour 3 (61 % et 61 %) après piézo-ICSI⁸. Nous avons perdu 3,2 heures et 25 micropipettes supplémentaires dans le groupe injecteur d’huile (90 patients) par rapport au groupe injecteur d’air (90 patients) au cours de l’étude⁸. Les résultats indiquent que l’utilisation d’un injecteur d’air au lieu d’un injecteur d’huile est une bonne modification de la piézo-ICSI.

Le piézo-ICSI peut briser la membrane de manière semi-automatique sans aspiration cytoplasmique dans la micropipette. Cette procédure de rupture de membrane est stable et facile. Le piézo-ICSI pourrait également contribuer à raccourcir la période de formation ICSI. Nous avons précédemment évalué l’effet de la piézo-ICSI sur les taux de survie, de fécondation, de blastocyste chez un jeune embryologiste. Le jeune embryologiste a reçu 30 fois la pratique de l’ICSI piézoélectrique avant de commencer le traitement clinique ICSI. Nous avons comparé les taux de survie, de fécondation et de blastocyste d’embryologistes jeunes et seniors pour leurs 1er 100 ovocytes. Les taux de survie, de fécondation et de blastocyste des embryologistes jeunes et seniors étaient respectivement de 100 % et 97 %, 87 % et 91 %, 47 % et 57 %. Il n’y avait pas de différence significative entre les embryologistes jeunes et les embryologistes seniors dans tous les éléments de comparaison. Ces résultats ont indiqué que la piézo-ICSI a une signification dans la procédure de rupture de la membrane qui peut contribuer à raccourcir la période d’entraînement ICSI d’un jeune embryologiste.

Certains chercheurs ont rapporté l’efficacité clinique de l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes morphologiquement sélectionnés (IMSI). Setti et al. ont comparé les résultats cliniques entre l’ICSI et l’IMSI dans une étude de méta-analyse¹⁰. Il n’y avait pas de différence significative dans les taux de fécondation entre les groupes ICSI et IMSI¹⁰. Cependant, le taux d’embryons de qualité supérieure du groupe IMSI était significativement plus élevé que celui du groupe ICSI¹⁰. À notre connaissance, aucune étude n’a examiné l’impact de l’IMSI combiné à la piézo-ICSI sur la fécondation et le développement embryonnaire. Nous avons étudié rétrospectivement les effets de l’amplification de la sélection des spermatozoïdes (400x contre 1 200x) sur la fécondation et le développement embryonnaire en piézo-ICSI. Le taux de fécondation du groupe 1 200x (92 %) était significativement plus élevé que celui du groupe 400x (77 %) (P = 0,0002)¹¹. Le taux d’embryons de bonne qualité au jour 3 du groupe 1 200x (64 %) était significativement plus élevé que celui du groupe 400x (46 %) (P = 0,0021)¹¹. Nous avons essayé de sélectionner les spermatozoïdes sans vacuoles dans la tête du spermatozoïde sous un grossissement de 1 200x. Cette procédure pourrait sélectionner les spermatozoïdes avec un degré plus faible de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes¹². Par conséquent, l’IMSI peut être une nouvelle application de la piézo-ICSI.

Ici, nous avons décrit un protocole pour la piézo-ICSI qui peut améliorer les résultats de l’ICSI sans manquer d’ovocytes viables dans le TAR humain.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.