Piezo-ICSI para oócitos humanos

Aqui, descrevemos um protocolo para injeção intracitoplasmática de espermatozóides em oócitos humanos usando uma micropipeta acionada por piezo.

Desde que foram relatadas as primeiras gestações bem-sucedidas alcançadas por injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI), a ICSI tornou-se uma técnica essencial na tecnologia de reprodução assistida (ART). A ICSI usa micropipetas com ponta pontiaguda para penetrar na zona pelúcida e na membrana. Em seguida, o citoplasma é geralmente aspirado para a micropipeta para quebra da membrana (ICSI convencional). As taxas de sobrevivência e fertilização de oócitos de camundongos após ICSI convencional foram tão baixas quanto 16% e 8%, respectivamente. Kimura e Yanagimachi aplicaram uma unidade de acionamento piezoelétrica, mercúrio e uma micropipeta com ponta plana para ICSI de camundongo. A quebra da membrana pode ser realizada de forma semiautomática combinando esses tipos de equipamentos sem aspiração citoplasmática na micropipeta (piezo-ICSI). Esses autores relataram taxas de sobrevivência e fertilização significativamente maiores (80% e 78%) em comparação com as ICSI convencionais (16% e 8%). Portanto, o piezo-ICSI pode ser eficaz não apenas para oócitos de camundongos, mas também para ICSI de oócitos humanos. No entanto, apenas cinco artigos estão disponíveis que avaliaram a eficácia do piezo-ICSI em comparação com o ICSI convencional para oócitos humanos. Todos esses cinco artigos relataram taxas de fertilização significativamente mais altas em comparação com as da ICSI convencional. O objetivo do protocolo piezo-ICSI descrito aqui é melhorar os resultados clínicos da ICSI em comparação com a ICSI convencional.

Desde que o Dr. Palermo relatou as primeiras gestações bem-sucedidas alcançadas por injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI)¹, a ICSI tornou-se uma técnica essencial na tecnologia de reprodução assistida (ART). A ICSI usa micropipetas com ponta pontiaguda para penetrar na zona pelúcida e na membrana. Em seguida, o citoplasma é geralmente aspirado para a micropipeta para quebra da membrana (ICSI convencional). As taxas de sobrevivência e fertilização de oócitos de camundongos após ICSI convencional foram tão baixas quanto 16% e 8%, respectivamente². Kimura e Yanagimachi aplicaram uma unidade de acionamento piezoelétrica, mercúrio e uma micropipeta com ponta plana para ICSI² de camundongo. A quebra da membrana pode ser realizada de forma semiautomática combinando esses tipos de equipamentos (piezo-ICSI). Esses autores relataram taxas de sobrevivência e fertilização significativamente maiores (80% e 78%) de ICSI piezo-ICSI em comparação com as de ICSI convencional (16% e 8%)². Uma das razões para os melhores resultados obtidos no piezo-ICSI pode ser o processo de quebra da membrana. O piezo-ICSI pode romper a membrana de forma estável e semiautomática sem aspiração citoplasmática na micropipeta. Esses resultados sugeriram que a aspiração citoplasmática para a micropipeta durante a quebra da membrana é invasiva para oócitos de camundongos. Portanto, o piezo-ICSI pode ser eficaz não apenas para oócitos de camundongos, mas também para ICSI de oócitos humanos.

No entanto, apenas cinco artigos disponíveis avaliaram a eficácia da ICSI piezo-ICSI em comparação com a ICSI convencional para oócitos humanos. Todos os cinco artigos relataram taxas de fertilização significativamente mais altas com piezo-ICSI em comparação com as taxas de fertilização com ICSI convencional 3,4,5,6,7 (Tabela 1). Portanto, o ICSI-piezo-pode melhorar as taxas de sobrevivência e fertilização em comparação com o ICSI-convencional. O objetivo do protocolo piezo-ICSI descrito aqui é melhorar os resultados clínicos da ICSI em comparação com a ICSI convencional.

O protocolo de piezo-ICSI descrito abaixo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana do Kameda Medical Center.

1. Equipamento e preparação

1. Use um sistema piezo-ICSI composto por uma unidade de acionamento, uma caixa de operação, um pedal e um controlador. Use qualquer tipo de microscópio invertido ou micromanipulador de três eixos. Conecte a unidade de acionamento piezoelétrico ao suporte da micropipeta e coloque o pedal no chão. Defina o nível de INTENSIDADE para 2 e o nível de VELOCIDADE para 1 na caixa de operação.
2. Use uma micropipeta piezo-ICSI disponível comercialmente com uma ponta plana. Encha uma micropipeta com o líquido de operação (fluido à base de fluorocarbono) até um comprimento de 20 mm. Evite misturar bolhas de ar no líquido de operação. Aspire quaisquer bolhas de ar ou excesso de líquido de operação para a parte de trás da pipeta com o dispositivo de enchimento de líquido.
3. Instale a micropipeta no suporte da micropipeta de injeção. Se o suporte da micropipeta de injeção tiver um tubo de silicone, insira a cabeça da pipeta cerca de 5 mm no tubo de silicone. Aperte a tampa do suporte e fixe firmemente a micropipeta.
4. Conecte a unidade de acionamento ao manipulador e fixe firmemente para evitar qualquer rotação causada por seu peso.
5. Posicione a micropipeta no campo do microscópio. Opere o injetor e empurre o líquido de operação para a cabeça da micropipeta de modo que qualquer ar dentro da cabeça da pipeta seja pressionado para fora. Confirme se não há ar dentro da cabeça da pipeta a olho nu e não com um microscópio.
6. Prepare o prato ICSI no prato com fundo de vidro conforme mostrado na Figura 1. Prepare duas microgotículas de solução de polivinilpirrolidona (PVP) a 7%: a microgota menor é para a preparação de micropipeta (5 μL) e a outra é para seleção de espermatozóides (10 μL). Prepare outra gota feita no centro do prato com fundo de vidro a partir do meio tamponado; esta microgotícula é para o oócito e é usada para injeção de espermatozóides (8 μL).
7. Insira a cabeça da micropipeta em uma gota de PVP a 7% e cubra a parede interna da micropipeta. Opere o injetor vigorosamente, movendo-o ao longo do limite interfacial entre o líquido de operação e o PVP. Enxágue o interior da micropipeta com PVP a cerca de 800 μm da cabeça da pipeta.
   1. Repita este procedimento (~ 3 ou 4 vezes) até que o limite interfacial deslize suavemente.

2. Imobilização de espermatozoides

1. Defina o nível de INTENSIDADE para 2 e o nível de VELOCIDADE para 1 na caixa de operação. Aplique o pulso piezo da unidade de acionamento conectada ao suporte da micropipeta quando o pedal estiver ligado. Ao aplicar o pulso piezo durante o procedimento, o ícone "Pulso piezo" aparece no canto superior direito do vídeo.
2. Colete o esperma móvel usando um gradiente de densidade e segure o esperma móvel coletado no meio tamponado. Aspire o meio tamponado contendo o esperma móvel coletado por cerca de 2-3 μL usando uma pipeta. Em seguida, injete este meio na parte inferior da microgota de PVP a 7%. Selecione o esperma com ampliação de 400x.
   1. Conecte a ponta da micropipeta à cauda do esperma selecionado e, em seguida, conduza a unidade de acionamento piezoelétrica. Normalmente, repita a condução 3 vezes para uma imobilização de espermatozóides. Após a imobilização do esperma, aspire o esperma para a cauda da micropipeta primeiro.

3. Operação piezo-ICSI (um oócito com membrana de alta capacidade de alongamento)

1. Mantenha a cabeça do espermatozóide em uma posição a cerca de um espermatozóide de comprimento total da cabeça da micropipeta. Enquanto aciona a unidade de acionamento piezoelétrico (cerca de 5 vezes por oócito), avance a micropipeta para realizar a punção sem deformação da zona pelúcida. Quando a ponta da micropipeta atinge a camada interna da zona pelúcida e, em seguida, a peça oca da zona pelúcida é completamente aspirada para dentro da micropipeta, a punção da zona pelúcida é concluída.
2. Remova o pedaço oco da zona pelúcida dentro da micropipeta e, ao mesmo tempo, mova o esperma para a cabeça da micropipeta. Empurre a micropipeta e estique a membrana citoplasmática até cerca de 90% do diâmetro do oócito.
3. Quando estiver suficientemente esticado, inicie o acionamento piezoelétrico uma vez para romper a membrana. A quebra da membrana é concluída quando é confirmado que a membrana se recuperou.
4. Após a quebra da membrana, injete a cabeça do espermatozóide no oócito. Depois que a cabeça do espermatozoide for certamente injetada no citoplasma, preste atenção para não adicionar líquido desnecessário.

4. Operação piezo-ICSI (um oócito com membrana de baixa capacidade de alongamento)

NOTA: Explicamos como lidar com um oócito com uma membrana de baixa capacidade de alongamento que pode se romper espontaneamente durante o alongamento.

1. Execute a mesma ação que o oócito com membrana de alta capacidade de alongamento até o ponto de esticar a membrana citoplasmática.
2. Se a membrana for rompida espontaneamente durante a ação, injete a cabeça do espermatozoide a partir da posição da micropipeta sem empurrá-la mais para frente para evitar a degeneração dos oócitos após a injeção do esperma.
3. Depois que a cabeça do espermatozoide for certamente injetada no citoplasma, preste atenção para não adicionar líquido desnecessário.

A ICSI convencional e a piezo-ICSI descritas acima foram realizadas em 10.488 oócitos maduros (1.744 ciclos) por 4 embriologistas. Destes, 3.522 oócitos (587 ciclos) foram inseminados por ICSI convencional entre janeiro de 2013 e setembro de 2016 e 6.966 oócitos (1.157 ciclos) foram inseminados por piezo-ICSI entre outubro de 2016 e dezembro de 2020 no Kameda Medical Center. A Tabela 1 mostra a idade média das mulheres, as taxas de fertilização, as taxas de sobrevivência, as taxas de degeneração, as taxas de blastocisto no dia 5 e o número médio de blastocistos criopreservados por ciclos de ICSI convencional e piezo-ICSI. Embora a idade média das mulheres da ICSI piezo-tenha sido maior em comparação com a da ICSI convencional, as taxas de fertilização, sobrevivência e blastocisto e o número médio de blastocistos criopreservados por ciclos de ICSI piezo-foram significativamente maiores em comparação com os da ICSI convencional (Tabela 2).

Figura 1: Prato ICSI usado para piezo-ICSI. O layout das microgotículas é descrito aqui. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Comparação das taxas de fertilização entre ICSI convencional e piezo-ICSI. Em todos os relatos, taxas de fertilização significativamente maiores foram observadas na ICSI piezo-em comparação com as da ICSI convencional.

Tabela 2: Resultados clínicos do Kameda Medical Center comparando a eficácia da ICSI convencional e da piezo-ICSI. Em todos os itens de comparação, foram observados resultados significativamente melhores no ICSI piezo-em comparação com os do ICSI-convencional.

Os resultados demonstraram que as taxas de fertilização, as taxas de sobrevivência, as taxas de blastocisto no dia 5 e o número médio de blastocistos criopreservados da ICSI piezo-foram significativamente maiores em comparação com as da ICSI convencional.

Existem 2 etapas críticas no protocolo piezo-ICSI. O primeiro passo é torcer firmemente a tampa do suporte da pipeta. O segundo passo é manter o volume de PVP aspirado na micropipeta inferior a 300 micrômetros. Torcer frouxamente a tampa do suporte da micropipeta e aspirar PVP na micropipeta mais de 300 micrômetros (um comprimento total de espermatozóide é de cerca de 60 micrômetros) causa dificuldades na imobilização do esperma, abertura da zona e quebra da membrana devido à diminuição do poder piezoelétrico. Em particular, sempre temos que prestar atenção ao volume de PVP aspirado na micropipeta durante o procedimento. Esta é a limitação do piezo-ICSI.

É essencial colocar uma pequena quantidade de líquido pesado como líquido de operação dentro da micropipeta para criar a energia piezoelétrica. Nos relatos anteriores, o mercúrio foi utilizado como líquido de operação ^2,3,4. No entanto, um fluido à base de fluorocarbono pode ser usado em vez de mercúrio para uso seguro 5,6,7,8,9,11. O líquido à base de fluorocarbono tem uma gravidade específica de 1,8 e é incolor, transparente e não solúvel em água. O líquido de operação tem contato direto com o PVP que contém o esperma. A exposição do PVP ao líquido de operação pode ter alguns efeitos negativos no esperma ou oócito. No entanto, as taxas de fertilização, sobrevivência e blastocisto do dia 5 da ICSI piezo-foram significativamente maiores em comparação com as da ICSI convencional no presente estudo. Acreditamos que o risco do contato direto entre o líquido da operação e o PVP é bastante baixo.

Medimos previamente o tempo de preparo da micropipeta com um injetor de óleo e um injetor de ar. Os tempos médios de preparo da micropipeta do injetor de óleo e do injetor de ar foram de 233 e 106 segundos, respectivamente (P < 0,05)⁸. O tempo de preparação da micropipeta com o injetor de ar é menor porque é isento de óleo. A presença do óleo prolonga o tempo de preparação da micropipeta devido à sua viscosidade. Se bolhas de ar se misturarem na área de óleo dentro da micropipeta após inserir a micropipeta no porta-pipeta, a pipeta deve ser descartada porque o piezo-ICSI não funcionará. Também contamos o número de micropipetas desperdiçadas durante o preparo da micropipeta. O número médio de micropipetas desperdiçadas por paciente para o injetor de óleo e injetor de ar foi de 0,28 ± 0,56 e 0 ± 0 (P < 0,05), respectivamente⁸. No entanto, não houve diferença significativa entre os injetores de óleo e ar nas taxas de sobrevivência (99% e 99%), fertilização (89% e 90%) e embriões de dia 3 de boa qualidade (61% e 61%) após piezo-ICSI⁸. Desperdiçamos 3,2 horas extras e 25 micropipetas no grupo injetor de óleo (90 pacientes) em comparação com o grupo injetor de ar (90 pacientes) durante o estudo⁸. Os resultados indicam que o uso de um injetor de ar em vez de um injetor de óleo é uma boa modificação do piezo-ICSI.

O piezo-ICSI pode romper a membrana semi-automaticamente sem aspiração citoplasmática na micropipeta. Este procedimento de quebra de membrana é estável e fácil. A ICSI piezográfica poderia também contribuir para encurtar o período de formação em ICSI. Avaliamos previamente o efeito do piezo-ICSI nas taxas de sobrevivência, fertilização, blastocisto para um embriologista jovem. O jovem embriologista recebeu a prática piezo-ICSI 30 vezes antes de iniciar o tratamento clínico com ICSI. Comparamos as taxas de sobrevivência, fertilização e blastocisto de embriologistas jovens e seniores para seus primeiros 100 oócitos. As taxas de sobrevivência, fertilização e blastocisto dos embriologistas jovens e seniores foram de 100% e 97%, 87% e 91%, 47% e 57%, respectivamente⁹. Não houve diferença significativa entre os embriologistas jovens e seniores em todos os itens de comparação. Esses resultados indicaram que a ICSI piezo-tem importância no procedimento de quebra de membrana que pode contribuir para encurtar o período de treinamento da ICSI de um embriologista jovem.

Alguns investigadores relataram a eficiência clínica da injeção intracitoplasmática de espermatozóides morfologicamente selecionados (IMSI). Setti et al. compararam os desfechos clínicos entre ICSI e IMSI em um estudo de meta-análise¹⁰. Não houve diferença significativa nas taxas de fertilização entre os grupos ICSI e IMSI¹⁰. No entanto, a taxa de embriões de alta qualidade do grupo IMSI foi significativamente maior em comparação com a do grupo ICSI¹⁰. Até onde sabemos, nenhum estudo examinou o impacto do IMSI combinado com piezo-ICSI na fertilização e no desenvolvimento embrionário. Investigamos retrospectivamente os efeitos da ampliação da seleção de espermatozoides (400x vs. 1.200x) na fertilização e no desenvolvimento embrionário em piezo-ICSI. A taxa de fertilização do grupo 1.200x (92%) foi significativamente maior em comparação com a do grupo 400x (77%) (P = 0,0002)¹¹. A taxa de embriões de boa qualidade no dia 3 do grupo de 1.200x (64%) foi significativamente maior em comparação com a do grupo de 400x (46%) (P = 0,0021)¹¹. Tentamos selecionar o esperma sem vacúolos na cabeça do esperma com aumento de 1.200x. Este procedimento pode selecionar o esperma com um menor grau de fragmentação do DNA do esperma¹². Portanto, o IMSI pode ser uma nova aplicação do piezo-ICSI.

Aqui, descrevemos um protocolo para piezo-ICSI que pode melhorar os resultados da ICSI sem perder oócitos viáveis na TARV humana.

Os autores não têm nada a divulgar.