ヒト卵子の圧電ICSI

ここでは、ピエゾ駆動マイクロピペットを使用してヒト卵子に細胞質内精子を注入するためのプロトコルについて説明します。

細胞質内精子注入法(ICSI)による妊娠成功が初めて報告されて以来、ICSIは生殖補助医療(ART)において不可欠な技術となっています。ICSIは、先端がスパイキングされたマイクロピペットを使用して、透明帯と膜を貫通します。その後、細胞質は通常、膜の切断(従来のICSI)のためにマイクロピペットに吸引されます。従来のICSI後のマウス卵子の生存率と受精率は、それぞれ16%と8%と低かった。木村と柳町は、マウス顕微授精用にピエゾドライブユニット、水銀、先端がフラットなマイクロピペットを適用しました。膜の破損は、細胞質吸引なしでこれらのタイプの機器をマイクロピペット(ピエゾICSI)に組み合わせることにより、半自動的に行うことができます。これらの著者は、従来のICSI(16%および8%)と比較して、生存率および受精率(80%および78%)が有意に高いと報告した。したがって、圧電ICSIはマウスの卵子だけでなく、ヒトの卵子のICSIにも有効である可能性があります。しかし、ヒト卵子に対する圧電ICSIの有効性を従来のICSIと比較して評価した論文は5つしかありません。これら5つの論文はすべて、従来のICSIと比較して有意に高い受精率を報告しました。ここで説明するピエゾICSIプロトコルの目標は、従来のICSIと比較してICSIの臨床結果を改善することです。

パレルモ博士が細胞質内精子注入法(ICSI)¹によって初めて妊娠に成功したことを報告して以来、ICSIは生殖補助医療(ART)において不可欠な技術となっています。ICSIは、先端がスパイキングされたマイクロピペットを使用して、透明帯と膜を貫通します。その後、細胞質は通常、膜の切断(従来のICSI)のためにマイクロピペットに吸引されます。従来の顕微授精後のマウス卵子の生存率と受精率は、それぞれ16%と8%と低かった²。木村と柳町は、マウスICSI²用のピエゾドライブユニット、水銀、先端がフラットなマイクロピペットを適用しました。膜の破損は、これらのタイプの機器(圧電ICSI)を組み合わせることで半自動的に行うことができます。これらの著者は、ピエゾICSIの生存率と受精率(80%および78%)が、従来のICSIの生存率と受精率(80%および78^%)が従来のICSIの生存率と受精率(80%および8%)と有意に高いと報告しました2。ピエゾICSIでより良い結果が得られる理由の1つは、膜の破損のプロセスである可能性があります。ピエゾICSIは、マイクロピペットに細胞質を吸引することなく、安定して半自動的にメンブレンを破砕することができます。これらの結果は、膜切断時のマイクロピペットへの細胞質吸引がマウス卵子にとって侵襲的であることを示唆しています。したがって、圧電ICSIはマウスの卵子だけでなく、ヒトの卵子のICSIにも有効である可能性があります。

しかし、ヒト卵子に対する圧電ICSIの有効性を従来のICSIと比較して評価した論文は5件しかありません。これらの5つの論文はすべて、従来の^ICSIによる受精率と比較して、圧電ICSIによる受精率が有意に高いと報告しました3,4,5,6,7(表1)。したがって、圧電ICSIは、従来のICSIと比較して生存率と受精率を改善する可能性があります。ここで説明するピエゾICSIプロトコルの目標は、従来のICSIと比較してICSIの臨床結果を改善することです。

以下に説明するピエゾICSIのプロトコールは、亀田総合医療センターのヒト研究倫理委員会のガイドラインに従っています。

1. 設備・準備

1. 駆動部、操作ボックス、フットスイッチ、コントローラで構成されたピエゾICSIシステムをご使用ください。あらゆるタイプの倒立顕微鏡または3軸マイクロマニピュレーターを使用してください。ピエゾドライブユニットをマイクロピペットホルダーに取り付け、フットスイッチを床に置きます。操作ボックスで INTENSITY レベルを2に、 SPEED レベルを1に設定します。
2. 先端がフラットな市販のピエゾICSIマイクロピペットを使用してください。マイクロピペットに操作液(フルオロカーボンベースの液体)を20mmの長さまで充填します。操作液に気泡を混ぜないでください。液体充填装置を使用して、ピペットの背面に向かって気泡や余分な操作液を吸引します。
3. マイクロピペットをインジェクションマイクロピペットホルダーに取り付けます。インジェクションマイクロピペットホルダーにシリコンチューブがある場合は、ピペットのヘッドをシリコンチューブに約5mm挿入します。ホルダーキャップを締め、マイクロピペットをしっかりと固定します。
4. ドライブユニットをマニピュレーターに取り付け、その重量による回転を避けるためにしっかりと固定します。
5. マイクロピペットを顕微鏡フィールドに配置します。インジェクターを操作し、操作液をマイクロピペットのヘッドに押し込み、ピペットのヘッド内の空気が押し出されるようにします。ピペットのヘッド内に空気が残っていないことを、顕微鏡ではなく肉眼で確認します。
6. 図1に示すように、ガラス底の皿にICSI皿を準備します。7%ポリビニルピロリドン溶液(PVP)の2つの微小液滴を調製します:小さい方の微小液滴はマイクロピペットの調製用(5μL)で、もう1つは精子選択用(10μL)です。緩衝培地からガラス底皿の中央に作られた別の液滴を準備します。この微小液滴は卵子用で、精子注入(8μL)に使用されます。
7. マイクロピペットのヘッドを7% PVP液滴に挿入し、マイクロピペットの内壁をコーティングします。インジェクターを激しく操作し、操作液とPVPの界面境界に沿って動かします。マイクロピペットの内部をPVPでピペットのヘッドから約800μmのところですすいでください。
   1. この手順を (~3 ~ 4 回) 繰り返して、界面境界がスムーズにスライドします。

2.精子の固定化

1. 操作ボックスで INTENSITY レベルを2に、 SPEED レベルを1に設定します。フットスイッチをONにすると、マイクロピペットホルダーに取り付けられたドライブユニットからピエゾパルスを印加します。施術中にピエゾパルスを適用すると、動画の右上に「ピエゾパルス」のアイコンが表示されます。
2. 密度勾配を使用して運動性精子を収集し、収集した運動性精子を緩衝培地に保持します。ピペットを使用して、収集した運動性精子を約2〜3μL保持する緩衝培地を吸引します。次に、この培地を7%PVPマイクロ液滴の下側に注入します。400倍の倍率で精子を選択します。
   1. マイクロピペットの先端を選択した精子の尾に取り付けてから、ピエゾドライブユニットを駆動します。通常、1つの精子を固定するために3回の運転を繰り返します。精子を固定した後、最初に精子をマイクロピペットの尾に吸引します。

3. 圧電ICSI手術(伸縮性の高い膜を持つ卵子)

1. 精子の頭を、マイクロピペットの頭から約1つの全長の精子の位置に保ちます。ピエゾドライブユニットを駆動しながら(卵子1個につき約5回)、マイクロピペットを進めて透明帯を変形させることなく穿刺を行う。マイクロピペットの先端が透明帯の内層に到達し、透明帯のくり抜かれた部分がマイクロピペットに完全吸引されると、透明帯の穿刺が完了します。
2. マイクロピペット内部の透明帯のくり抜かれた部分を取り出し、同時に精子をマイクロピペットの頭部に移動します。マイクロピペットを押し込み、卵子の直径の約90%まで細胞質膜を伸ばします。
3. 十分に伸びたら、ピエゾドライブを1回起動してメンブレンを破裂させます。メンブレンがリバウンドしたことが確認された時点でメンブレンは完了です。
4. 膜が破れた後、精子の頭を卵子に注入します。精子の頭部が確実に細胞質に注入された後は、不要な液体を加えないように注意してください。

4. 圧電ICSI手術(伸縮性の低い膜を持つ卵子)

注:伸張中に自然に破裂する可能性のある低伸張能力膜を持つ卵子の対処法を説明します。

1. 細胞質膜を伸ばすところまでは伸縮能の高い膜を持つ卵子と同じ作用をします。
2. 作用中に膜が自然破裂した場合は、マイクロピペットの位置から精子の頭部をこれ以上前方に押し出さずに注入することで、精子注入後の卵子の変性を防ぎます。
3. 精子の頭部が確実に細胞質に注入された後は、不要な液体を加えないように注意してください。

上記の従来のICSIおよび圧電ICSIは、4人の胚培養士によって10,488個の成熟卵子(1,744サイクル)に対して行われました。このうち、2013年1月から2016年9月にかけて3,522個(587サイクル)が従来型顕微授精で、2016年10月から2020年12月にかけて亀田総合医療センターで6,966個(1,157サイクル)が圧電ICSIで授精されました。 表1 は、女性の平均年齢、受精率、生存率、変性率、5日目の胚盤胞率、および従来のICSIおよび圧電ICSIのサイクルあたりの凍結保存された胚盤胞の平均数を示しています。圧電ICSIの女性の平均年齢は従来の顕微授精と比較して高かったが、受精率、生存率、胚盤胞率、および圧電ICSIのサイクルあたりの凍結保存された胚盤胞の平均数は、従来の顕微授精と比較して有意に高かった(表2)。

図1:ピエゾICSIに使用したICSIディッシュ。 ここでは、微小液滴のレイアウトについて説明します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:従来のICSIと圧電ICSIの受精率の比較。 すべての報告において、圧電ICSIでは、従来のICSIと比較して有意に高い受精率が観察されました。

表2:亀田メディカルセンターの臨床結果 従来のICSIとピエゾICSIの有効性を比較した結果。 すべての比較項目において、ピエゾICSIでは従来のICSIと比較して有意に良好な結果が観察されました。

その結果、圧電ICSIの受精率、生存率、5日目の胚盤胞率、および凍結保存された胚盤胞の平均数は、従来のICSIと比較して有意に高いことが示されました。

ピエゾICSIプロトコルには2つの重要なステップがあります。最初のステップは、ピペットホルダーのホルダーキャップをしっかりとひねることです。2番目のステップは、マイクロピペットへの吸引PVP量を300マイクロメートル未満に維持することです。マイクロピペットホルダーのホルダーキャップをゆるくねじったり、PVPを300マイクロメートル(精子の1全長は約60マイクロメートル)以上マイクロピペットに吸引すると、ピエゾパワーが低下するため、精子の固定化、帯開、膜の破損が困難になります。特に、処置中はマイクロピペットに吸引されるPVPの量に常に注意を払う必要があります。これがピエゾICSIの限界です。

マイクロピペットの内部に操作液として少量の重液を入れると、ピエゾパワーが生まれます。以前のレポートでは、水銀は操作液として使用されました^2,3,4。ただし、水銀の代わりにフルオロカーボンベースの流体を使用して、安全に使用できます5,6,7,8,9,11。フロン系液体は比重1.8で、無色透明で非水溶性です。手術液は、精子を保持しているPVPと直接接触しています。PVPが手術液にさらされると、精子や卵子に悪影響を与える可能性があります。しかし、圧電顕微授精の受精率、生存率、5日目の胚盤胞の割合は、本研究の従来の顕微授精の受精率と比較して有意に高かった。手術液とPVPが直接接触することによるリスクは非常に低いと考えています。

マイクロピペットの調製時間は、以前、オイルインジェクターとエアインジェクターで測定しました。オイルインジェクターとエアインジェクターのマイクロピペット調製の平均時間は、それぞれ233秒と106秒でした(P < 0.05)⁸。エアインジェクターによるマイクロピペットの準備時間はオイルフリーのため短くなります。オイルの存在は、その粘着性のためにマイクロピペットの準備時間を延長します。マイクロピペットをピペットホルダーに挿入した後、マイクロピペット内部の油部分に気泡が混入すると、ピエゾICSIが機能しなくなるため、ピペットを廃棄する必要があります。また、マイクロピペット調製中に無駄になったマイクロピペットの数もカウントしました。オイルインジェクターとエアインジェクターの患者一人当たりの無駄なマイクロピペットの平均数は、それぞれ0.28±0.56、0±0(P<0.05)^{でした8。}しかし、ピエゾICSI⁸後の生存率(99%と99%)、受精率(89%と90%)、良質な3日目胚(61%と61%)に、オイルインジェクターとエアインジェクターの間に有意差はありませんでした。研究中、オイルインジェクター群 (90 人の患者) では、エアインジェクター群 (90 人の患者) と比較して、さらに 3.2 時間と 25 本のマイクロピペットを無駄にしました⁸.この結果は、オイルインジェクターの代わりにエアインジェクターを使用することが、ピエゾICSIの優れた改良であることを示しています。

ピエゾICSIは、マイクロピペットに細胞質吸引することなく、半自動的にメンブレンを破壊することができます。この膜破損手順は安定しており、簡単です。ピエゾICSIは、ICSIのトレーニング期間の短縮にも貢献する可能性があります。私たちは以前、若い胚培養士の生存率、受精率、胚盤胞率に対する圧電顕微授精の影響を評価しました。この若い胚培養士は、臨床ICSI治療を開始する前に、ピエゾICSIの練習を30回受けました。私たちは、若い発生学者と上級発生学者の生存率、受精率、胚盤胞率を、最初の100個の卵子について比較しました。若年および上級発生学者の生存率、受精率、胚盤胞率は、それぞれ100%および97%、87%および91%、47%および57%であった⁹。すべての比較項目において、若年発生学者と上級発生学者との間に有意差はありませんでした。これらの結果から、圧電ICSIは、若年胚培養士の顕微授精の研修期間を短縮する上で、膜破損の手技において重要であることが示された。

一部の研究者は、細胞質内形態学的に選択された精子注入 (IMSI) の臨床効率を報告しました。Settiらは、メタアナリシス研究¹⁰でICSIとIMSIの臨床転帰を比較しました。ICSI群とIMSI群の間で受精率に有意差はなかった¹⁰。しかし、IMSIグループの最高品質の胚率は、ICSIグループのそれと比較して有意に高かった¹⁰。私たちの知る限り、IMSIとピエゾICSIの組み合わせが受精と胚発生に与える影響を調べた研究はありません。精子選択倍率(400倍対1,200倍)が圧電ICSIの受精と胚発生に及ぼす影響を遡及的に調査しました。1,200倍群(92%)の受精率は、400倍群(77%)の受精率と比較して有意に高かった(P = 0.0002)¹¹。1,200x群(64%)の良質な3日目の胚発生率は、400x群(46%)と比較して有意に高かった(P = 0.0021)¹¹。精子の頭の中に液胞がない精子を1,200倍の拡大で選別してみました。この手順では、精子DNA断片化の度合いが低い精子^{を選択する場合があります12}。したがって、IMSIはピエゾICSIの新しいアプリケーションになる可能性があります。

ここでは、ヒトARTで生存可能な卵子を見逃すことなくICSIの転帰を改善できる圧電ICSIのプロトコルについて説明しました。

著者は何も開示していません。