Piezo-ICSI עבור ביציות אנושיות

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להזרקת זרע תוך ציטופלזמית לביציות אנושיות באמצעות מיקרופיפטה מונעת פייזו.

מאז שדווח על ההריונות המוצלחים הראשונים שהושגו על ידי הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI), ICSI הפכה לטכניקה חיונית בטכנולוגיית רבייה מסייעת (ART). ICSI משתמש במיקרו-פיפטות עם קצה זינוק כדי לחדור ל-zona pellucida ולממברנה. לאחר מכן, הציטופלזמה נשאבת בדרך כלל לתוך המיקרופיפטה לשבירת הממברנה (קונבנציונלי-ICSI). שיעורי ההישרדות וההפריה של ביציות עכברים לאחר ICSI קונבנציונלי היו נמוכים עד 16% ו-8%, בהתאמה. קימורה וינאגימאצ'י יישמו יחידת הנעה פייזו, כספית ומיקרופיפטה עם קצה שטוח לעכבר ICSI. ניתן לבצע את שבירת הממברנה באופן אוטומטי למחצה על ידי שילוב של ציוד מסוג זה ללא שאיפה ציטופלזמית לתוך המיקרופיפטה (piezo-ICSI). מחברים אלה דיווחו על שיעורי הישרדות והפריה גבוהים משמעותית (80% ו-78%) בהשוואה לאלו של ICSI קונבנציונלי (16% ו-8%). לכן, הפיזו-ICSI עשוי להיות יעיל לא רק עבור ביציות עכברים אלא גם עבור ביציות אנושיות ICSI. עם זאת, רק חמישה מאמרים זמינים שהעריכו את היעילות של piezo-ICSI בהשוואה ל-ICSI קונבנציונלי עבור ביציות אנושיות. כל חמשת המאמרים הללו דיווחו על שיעורי הפריה גבוהים משמעותית בהשוואה לאלו של ICSI קונבנציונלי. מטרת פרוטוקול הפיזו-ICSI המתואר כאן היא לשפר את התוצאות הקליניות של ICSI בהשוואה ל-ICSI הקונבנציונלי.

מאז שד"ר פלרמו דיווח על ההריונות המוצלחים הראשונים שהושגו על ידי הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI)¹, ICSI הפכה לטכניקה חיונית בטכנולוגיית רבייה מסייעת (ART). ICSI משתמש במיקרו-פיפטות עם קצה זינוק כדי לחדור ל-zona pellucida ולממברנה. לאחר מכן, הציטופלזמה נשאבת בדרך כלל לתוך המיקרופיפטה לשבירת הממברנה (קונבנציונלי-ICSI). שיעורי ההישרדות וההפריה של ביציות עכברים לאחר ICSI קונבנציונלי היו נמוכים עד 16% ו-8%, בהתאמה^. קימורה ויאנאגימאצ'י יישמו יחידת הנעה פייזו, כספית ומיקרופיפטה עם קצה שטוח לעכבר ICSI². שבירת הממברנה יכולה להתבצע באופן אוטומטי למחצה על ידי שילוב של ציוד מסוג זה (piezo-ICSI). מחברים אלה דיווחו על שיעורי הישרדות והפריה גבוהים משמעותית (80% ו-78%) של piezo-ICSI בהשוואה לאלו של ICSI קונבנציונלי (16% ו-8%)². אחת הסיבות לתוצאות הטובות יותר המתקבלות בפייזו-ICSI עשויה להיות תהליך שבירת הממברנה. הפיזו-ICSI יכול לשבור את הממברנה באופן יציב וחצי אוטומטי ללא שאיפה ציטופלזמית לתוך המיקרופיפטה. תוצאות אלו הציעו כי השאיפה הציטופלזמית לתוך המיקרופיפטה במהלך שבירת הממברנה היא פולשנית לביציות עכברים. לכן, הפיזו-ICSI עשוי להיות יעיל לא רק עבור ביציות עכברים אלא גם עבור ביציות אנושיות ICSI.

עם זאת, רק חמישה מאמרים זמינים העריכו את היעילות של piezo-ICSI בהשוואה ל-ICSI קונבנציונלי עבור ביציות אנושיות. כל חמשת המאמרים הללו דיווחו על שיעורי הפריה גבוהים משמעותית עם piezo-ICSI בהשוואה לשיעורי הפריה עם ICSI קונבנציונלי 3,4,5,6,7 (טבלה 1). לכן, ה-piezo-ICSI עשוי לשפר את שיעורי ההישרדות וההפריה בהשוואה ל-ICSI קונבנציונלי. מטרת פרוטוקול הפיזו-ICSI המתואר כאן היא לשפר את התוצאות הקליניות של ICSI בהשוואה ל-ICSI קונבנציונלי.

פרוטוקול הפיזו-ICSI המתואר להלן עוקב אחר הנחיות ועדת האתיקה למחקר בבני אדם במרכז הרפואי קמדה.

1. ציוד והכנה

1. השתמש במערכת piezo-ICSI המורכבת מיחידת כונן, תיבת הפעלה, מתג רגליים ובקר. השתמש בכל סוג של מיקרוסקופ הפוך או מיקרומניפולטור תלת-צירי. חבר את יחידת ההנעה של הפיזו למחזיק המיקרופיפטה, והנח את מתג הרגליים על הרצפה. הגדר את רמת ה-INTENSITY ל-2 ואת רמת ה-SPEED ל-1 בתיבת ההפעלה.
2. השתמש במיקרופיפטה פייזו-ICSI זמינה מסחרית עם קצה שטוח. מלאו מיקרופיפטה בנוזל הפעולה (נוזל על בסיס פלואורוקרבון) לאורך של 20 מ"מ. הימנע מערבוב בועות אוויר בנוזל הפעולה. שאפו בועות אוויר או נוזל פעולה עודף לכיוון החלק האחורי של הפיפטה בעזרת מכשיר מילוי הנוזלים.
3. התקן את המיקרופיפטה לתוך מחזיק המיקרופיפטה להזרקה. אם למחזיק המיקרופיפטה להזרקה יש צינור סיליקון, הכנס את ראש הפיפטה כ-5 מ"מ לתוך צינור הסיליקון. הדק את מכסה המחזיק וקבע היטב את המיקרופיפטה.
4. חבר את יחידת ההנעה למניפולטור וקבע היטב כדי למנוע כל סיבוב הנגרם ממשקלו.
5. מקם את המיקרופיפטה בשדה המיקרוסקופ. הפעל את המזרק ודחף את נוזל הפעולה לראש המיקרופיפטה כך שכל אוויר בתוך ראש הפיפטה יילחץ החוצה. ודא שלא נשאר אוויר בתוך ראש הפיפטה בעין בלתי ולא במיקרוסקופ.
6. הכן את צלחת ה-ICSI על צלחת תחתית הזכוכית כפי שמוצג באיור 1. הכינו שתי מיקרו-טיפות של תמיסת 7% פוליוויניל פירולידון (PVP): המיקרו-טיפה הקטנה יותר מיועדת להכנת מיקרופיפטה (5 מיקרוליטר) והשנייה מיועדת לבחירת זרע (10 מיקרוליטר). הכינו טיפה נוספת שנעשתה במרכז צלחת תחתית הזכוכית מהמדיום המאוחסן; מיקרו-טיפה זו מיועדת לביצית ומשמשת להזרקת זרע (8 מיקרוליטר).
7. הכניסו את ראש המיקרופיפטה לטיפה של 7% PVP וצפו את הדופן הפנימית של המיקרופיפטה. הפעל את המזרק במרץ, הזז אותו לאורך גבול הפנים בין נוזל הפעולה ל-PVP. שוטפים את החלק הפנימי של המיקרופיפטה עם PVP כ -800 מיקרומטר מראש הפיפטה.
   1. חזור על הליך זה (~3 או 4 פעמים) עד שגבול הפנים מחליק בצורה חלקה.

2. קיבוע זרע

1. הגדר את רמת ה-INTENSITY ל-2 ואת רמת ה-SPEED ל-1 בתיבת ההפעלה. הפעל את דופק הפיזו מיחידת ההנעה המחוברת למחזיק המיקרופיפטה כאשר מתג הרגל מופעל. בעת הפעלת דופק הפיזו במהלך ההליך, סמל "דופק פייזו" מופיע בפינה השמאלית העליונה של הסרטון.
2. אסוף את הזרע הנייד באמצעות שיפוע צפיפות והחזק את הזרע הנייד שנאסף לתוך המדיום הבופר. שאפו את המדיום המאגר המחזיק את הזרע הנע שנאסף כ-2-3 מיקרוליטר באמצעות פיפטה. לאחר מכן הזריק את המדיום הזה לצד התחתון של המיקרו-טיפה PVP 7%. בחר את הזרע בהגדלה של פי 400.
   1. חבר את קצה המיקרופיפטה לזנב הזרע שנבחר ולאחר מכן הניע את יחידת כונן הפיזו. בדרך כלל, חזור על הנהיגה 3 פעמים לקיבוע זרע אחד. לאחר קיבוע הזרע, שאפו תחילה את הזרע לזנב המיקרופיפטה.

3. פעולת פייזו-ICSI (ביצית בעלת יכולת מתיחה גבוהה)

1. שמור את ראש הזרע במיקום של זרע אחד באורך מלא בחזרה מראש המיקרופיפטה. תוך כדי נהיגה ביחידת ההנעה של הפיזו (בערך 5 פעמים לביצית אחת), קדם את המיקרופיפטה כדי לבצע את הפנצ'ר ללא עיוות של ה-zona pellucida. כאשר קצה המיקרופיפטה מגיע לשכבה הפנימית של ה-zona pellucida ואז החלק החלול של ה-zona pellucida נשאב לחלוטין לתוך המיקרו-פיפטה, הושלם ניקוב של zona pellucida.
2. הסר את החלק החלול של ה-zona pellucida בתוך המיקרו-פיפטה ובמקביל העביר את הזרע לראש המיקרופיפטה. דחפו את המיקרופיפטה פנימה ומתחו את הממברנה הציטופלזמית עד כ-90% מקוטר הביצית.
3. כאשר הוא נמתח מספיק, הפעל את כונן הפיזו פעם אחת כדי לקרוע את הממברנה. שבירת הממברנה מסתיימת כאשר מאושר כי הממברנה התאוששה.
4. לאחר שבירת הממברנה, יש להזריק את ראש הזרע לתוך הביצית. לאחר שראש הזרע מוזרק בוודאות לציטופלזמה, שימו לב לא להוסיף נוזל מיותר.

4. פעולת Piezo-ICSI (ביצית בעלת יכולת מתיחה נמוכה)

הערה: אנו מסבירים כיצד להתמודד עם ביצית עם קרום בעל יכולת מתיחה נמוכה שעלול להיקרע באופן ספונטני במהלך המתיחה.

1. בצע את אותה פעולה כמו הביצית עם קרום בעל יכולת מתיחה גבוהה עד למתיחת הממברנה הציטופלזמית.
2. אם הממברנה נקרעת באופן ספונטני במהלך הפעולה, יש להזריק את ראש הזרע ממיקום המיקרופיפטה מבלי לדחוף אותו קדימה כדי למנוע ניוון של ביציות לאחר הזרקת הזרע.
3. לאחר שראש הזרע מוזרק בוודאות לציטופלזמה, שימו לב לא להוסיף נוזל מיותר.

הקונבנציונליים-ICSI והפיזו-ICSI שתוארו לעיל בוצעו על 10,488 ביציות בוגרות (1,744 מחזורים) על ידי 4 אמבריולוגים. מתוכם, 3,522 ביציות (587 מחזורים) הוזרעו על ידי ICSI קונבנציונלי בין ינואר 2013 לספטמבר 2016 ו-6,966 ביציות (1,157 מחזורים) הוזרעו על ידי piezo-ICSI בין אוקטובר 2016 לדצמבר 2020 במרכז הרפואי קמדה. טבלה 1 מציגה את הגיל הממוצע של הנשים, שיעורי ההפריה, שיעורי ההישרדות, שיעורי הניוון, שיעורי הבלסטוציסט ביום החמישי והמספר הממוצע של בלסטוציסטים שמורים בהקפאה לכל מחזורים של ICSI ו-PIZO-ICSI קונבנציונליים. למרות שהגיל הממוצע של נשים של piezo-ICSI היה גבוה יותר בהשוואה לזה של ICSI קונבנציונלי, שיעורי ההפריה, ההישרדות והבלסטוציסט והמספר הממוצע של בלסטוציסטים שמורים בהקפאה למחזורים של piezo-ICSI היו גבוהים משמעותית בהשוואה לאלו של ICSI קונבנציונלי (טבלה 2).

איור 1: צלחת ICSI המשמשת עבור piezo-ICSI. פריסת המיקרו-טיפות מתוארת כאן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: השוואה בין שיעורי ההפריה בין ICSI קונבנציונלי לפייזו-ICSI. בכל הדיווחים נצפו שיעורי הפריה גבוהים משמעותית ב-piezo-ICSI בהשוואה לאלו של ה-ICSI הקונבנציונלי.

טבלה 2: תוצאות קליניות של המרכז הרפואי קמדה המשווים את היעילות של ICSI קונבנציונלי ופיזו-ICSI. בכל פריטי ההשוואה, נצפו תוצאות טובות יותר באופן משמעותי ב-piezo-ICSI בהשוואה לאלו של ה-ICSI הקונבנציונלי.

התוצאות הראו כי שיעורי ההפריה, שיעורי ההישרדות, שיעורי הבלסטוציסט ביום 5 והמספר הממוצע של בלסטוציסטים שמורים בהקפאה של הפיזו-ICSI היו גבוהים משמעותית בהשוואה לאלו של ICSI קונבנציונלי.

ישנם 2 שלבים קריטיים בפרוטוקול piezo-ICSI. השלב הראשון הוא לסובב היטב את מכסה המחזיק של מחזיק הפיפטה. השלב השני הוא לשמור על נפח ה- PVP הנשאף לתוך המיקרופיפטה פחות מ -300 מיקרומטר. סיבוב רופף של מכסה המחזיק של מחזיק המיקרופיפטה ושאיפת PVP לתוך המיקרופיפטה יותר מ-300 מיקרומטר (אורך זרע מלא אחד הוא כ-60 מיקרומטר) גורמים לקשיים בקיבוע הזרע, פתיחת האזור ושבירת הממברנה בגלל ירידת כוח הפיזו. בפרט, עלינו תמיד לשים לב לנפח ה- PVP הנשאף לתוך המיקרופיפטה במהלך ההליך. זו המגבלה של הפיזו-ICSI.

חיוני להניח כמות קטנה של נוזל כבד כנוזל פעולה בתוך המיקרופיפטה כדי ליצור את כוח הפיזו. בדוחות הקודמים, כספית שימשה כנוזל פעולה ^2,3,4. עם זאת, ניתן להשתמש בנוזל מבוסס פלואורוקרבון במקום כספית לשימוש בטוח במקום 5,6,7,8,9,11. לנוזל המבוסס על פלואורוקרבון יש משקל סגולי של 1.8, והוא חסר צבע, שקוף ואינו מסיס במים. לנוזל הניתוח יש מגע ישיר עם ה-PVP המחזיק את הזרע. לחשיפת ה-PVP לנוזל הפעולה עלולות להיות השפעות שליליות מסוימות על הזרע או הביצית. עם זאת, שיעורי ההפריה, ההישרדות, הבלסטוציסט ביום החמישי של piezo-ICSI היו גבוהים משמעותית בהשוואה לאלו של ICSI הקונבנציונלי במחקר הנוכחי. אנו מאמינים שהסיכון מהמגע הישיר בין נוזל הפעולה ל-PVP נמוך למדי.

מדדנו בעבר את זמן הכנת המיקרופיפטה עם מזרק שמן ומזרק אוויר. הזמנים הממוצעים להכנת מיקרופיפטה של מזרק השמן ומזרק האוויר היו 233 ו-106 שניות, בהתאמה (P < 0.05)⁸. זמן הכנת המיקרופיפטה עם מזרק האוויר נמוך יותר מכיוון שהוא נטול שמן. נוכחות השמן מאריכה את זמן הכנת המיקרופיפטה בגלל דביקותו. אם בועות אוויר מתערבבות באזור השמן בתוך המיקרופיפטה לאחר הכנסת המיקרופיפטה למחזיק הפיפטה, יש להשליך את הפיפטה מכיוון שהפיזו-ICSI לא יעבוד. ספרנו גם את מספר המיקרופיפטות המבוזבזות במהלך הכנת המיקרופיפטות. המספר הממוצע של מיקרופיפטות מבוזבזות למטופל עבור מזרק השמן ומזרק האוויר היה 0.28 ± 0.56 ו-0 ± 0 (P < 0.05), בהתאמה⁸. עם זאת, לא היה הבדל משמעותי בין מזרקי השמן והאוויר בשיעורי ההישרדות (99% ו-99%), ההפריה (89% ו-90%) ועוברים באיכות טובה ביום השלישי (61% ו-61%) לאחר פיזו-ICSI⁸. בזבזנו 3.2 שעות נוספות ו-25 מיקרו-פיפטות בקבוצת מזרקי השמן (90 חולים) בהשוואה לקבוצת מזרקי האוויר (90 חולים) במהלך המחקר⁸. התוצאות מצביעות על כך ששימוש במזרק אוויר במקום מזרק שמן הוא שינוי טוב של piezo-ICSI.

הפיזו-ICSI יכול לשבור את הממברנה באופן אוטומטי למחצה ללא שאיפה ציטופלזמית לתוך המיקרופיפטה. הליך שבירת קרום זה יציב וקל. הפיזו-ICSI יכול גם לתרום לקיצור תקופת ההכשרה של ICSI. בעבר הערכנו את ההשפעה של הפיזו-ICSI על שיעורי ההישרדות, ההפריה, הבלסטוציסט עבור אמבריולוג צעיר. האמבריולוג הצעיר קיבל תרגול פייזו-ICSI 30 פעמים לפני שהחל בטיפול הקליני ב-ICSI. השווינו את שיעורי ההישרדות, ההפריה והבלסטוציסט של אמבריולוגים צעירים ומבוגרים עבור 100 הביציות הראשונות שלהם. שיעורי ההישרדות, ההפריה והבלסטוציסט של האמבריולוגים הצעירים והמבוגרים היו 100% ו-97%, 87% ו-91%, 47% ו-57%, בהתאמה^. לא היה הבדל משמעותי בין האמבריולוגים הצעירים והמבוגרים בכל פריטי ההשוואה. תוצאות אלו הצביעו על כך שלפיזו-ICSI יש משמעות בהליך שבירת הממברנה שיכולה לתרום לקיצור תקופת ההכשרה של ICSI של אמבריולוג צעיר.

חלק מהחוקרים דיווחו על היעילות הקלינית של הזרקת זרע תוך ציטופלזמית שנבחרה מורפולוגית (IMSI). Setti et al. השוו את התוצאות הקליניות בין ICSI ל-IMSI במחקר מטא-אנליזה¹⁰. לא היה הבדל משמעותי בשיעורי ההפריה בין קבוצות ICSI ו-IMSI¹⁰. עם זאת, שיעור העוברים האיכותיים ביותר של קבוצת IMSI היה גבוה משמעותית בהשוואה לזה של קבוצת ICSI¹⁰. למיטב ידיעתנו, אף מחקר לא בדק את ההשפעה של IMSI בשילוב עם piezo-ICSI על הפריה והתפתחות עוברים. חקרנו רטרוספקטיבית את ההשפעות של הגדלת בחירת הזרע (פי 400 לעומת פי 1,200) על ההפריה והתפתחות העובר בפיזו-ICSI. שיעור ההפריה של קבוצת ה-1,200x (92%) היה גבוה משמעותית בהשוואה לזה של קבוצת ה-400x (77%) (P = 0.0002)¹¹. שיעור העוברים ביום השלישי באיכות טובה של קבוצת ה-1,200x (64%) היה גבוה משמעותית בהשוואה לזה של קבוצת ה-400x (46%) (P = 0.0021)¹¹. ניסינו לבחור את הזרע ללא ואקואולים בראש הזרע בהגדלה של פי 1,200. הליך זה עשוי לבחור את הזרע עם דרגה נמוכה יותר של פיצול DNA זרע¹². לכן, ה-IMSI עשוי להיות יישום חדש של piezo-ICSI.

כאן, תיארנו פרוטוקול עבור piezo-ICSI שיכול לשפר את תוצאות ה-ICSI מבלי לפספס ביציות בנות קיימא ב-ART אנושי.

למחברים אין מה לחשוף.