Пьезо-ИКСИ для ооцитов человека

Здесь мы опишем протокол интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооциты человека с помощью пьезоуправляемой микропипетки.

С тех пор, как были зарегистрированы первые успешные беременности, достигнутые с помощью интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ), ИКСИ стал важным методом вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). В ИКСИ используются микропипетки с остроконечным наконечником для проникновения в пеллюцидную зону и мембрану. Затем цитоплазма обычно отсасывается в микропипетку для разрыва мембраны (обычный ИКСИ). Выживаемость и оплодотворенность ооцитов мышей после традиционного ИКСИ составили всего 16% и 8% соответственно. Кимура и Янагимати применили пьезопривод, ртуть и микропипетку с плоским наконечником для ИКСИ мыши. Разрыв мембраны может быть выполнен в полуавтоматическом режиме путем объединения этих типов оборудования без цитоплазматической аспирации в микропипетку (пьезо-ИКСИ). Эти авторы сообщили о значительно более высоких показателях выживаемости и оплодотворения (80% и 78%) по сравнению с обычным методом ИКСИ (16% и 8%). Таким образом, пьезо-ИКСИ может быть эффективен не только для ооцитов мыши, но и для ИКСИ ооцитов человека. Тем не менее, доступно только пять работ, в которых оценивалась эффективность пьезо-ИКСИ по сравнению с обычным ИКСИ для ооцитов человека. Во всех этих пяти работах сообщалось о значительно более высоких показателях оплодотворения по сравнению с обычным ИКСИ. Целью описанного здесь протокола пьезо-ИКСИ является улучшение клинических результатов ИКСИ по сравнению с обычным ИКСИ.

С тех пор, как д-р Палермо сообщил о первых успешных беременностей, достигнутых с помощью интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ)¹, ИКСИ стал важным методом вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). В ИКСИ используются микропипетки с остроконечным наконечником для проникновения в пеллюцидную зону и мембрану. Затем цитоплазма обычно отсасывается в микропипетку для разрыва мембраны (обычный ИКСИ). Выживаемость и оплодотворение ооцитов мышей после традиционного ИКСИ составили всего 16% и 8%^{соответственно2}. Кимура и Янагимати применили пьезопривод, ртуть и микропипетку с плоским наконечником для мыши ICSI². Разрыв мембраны может быть выполнен в полуавтоматическом режиме путем комбинирования этих типов оборудования (пьезо-ИКСИ). Эти авторы сообщили о значительно более высоких показателях выживаемости и оплодотворения (80% и 78%) при пьезо-ИКСИ по сравнению с таковым при обычном ИКСИ (16% и 8%)². Одной из причин получения лучших результатов при пьезо-ИКСИ может быть процесс обрыва мембраны. Пьезо-ИКСИ может стабильно и полуавтоматически разрывать мембрану без цитоплазматической аспирации в микропипетку. Эти результаты позволяют предположить, что цитоплазматическая аспирация в микропипетку во время разрыва мембраны является инвазивной для ооцитов мыши. Таким образом, пьезо-ИКСИ может быть эффективен не только для ооцитов мыши, но и для ИКСИ ооцитов человека.

Тем не менее, только в пяти доступных работах оценивалась эффективность пьезо-ИКСИ по сравнению с обычным ИКСИ для ооцитов человека. Во всех пяти работах сообщалось о значительно более высоких показателях оплодотворения при пьезо-ИКСИ по сравнению с показателями оплодотворения при обычном ИКСИ 3,4,5,6,7 (Таблица 1). Таким образом, пьезо-ИКСИ может улучшить выживаемость и показатели оплодотворения по сравнению с обычным ИКСИ. Целью описанного здесь протокола пьезо-ИКСИ является улучшение клинических результатов ИКСИ по сравнению с обычным ИКСИ.

Протокол пьезо-ИКСИ, описанный ниже, соответствует рекомендациям комитета по этике исследований человека в медицинском центре Камеда.

1. Оборудование и подготовка

1. Используйте систему пьезо-ИКСИ, состоящую из привода, блока управления, ножного переключателя и контроллера. Используйте любой тип инвертированного микроскопа или трехосевого микроманипулятора. Прикрепите пьезопривод к держателю для микропипеток и поставьте ножной переключатель на пол. Установите уровень ИНТЕНСИВНОСТИ на 2 и уровень СКОРОСТЬ на 1 на рабочем блоке.
2. Используйте имеющуюся в продаже микропипетку пьезо-ИКСИ с плоским наконечником. Наполните микропипетку рабочей жидкостью (жидкостью на основе фторуглеродов) на длину 20 мм. Избегайте смешивания пузырьков воздуха с рабочей жидкостью. Отсасывайте пузырьки воздуха или излишки рабочей жидкости к задней части пипетки с помощью устройства для наполнения жидкостью.
3. Установите микропипетку в держатель микропипетки для инъекций. Если держатель микропипетки для инъекций имеет силиконовую трубку, вставьте головку пипетки примерно на 5 мм в силиконовую трубку. Затяните колпачок держателя и плотно зафиксируйте микропипетку.
4. Прикрепите приводной блок к манипулятору и прочно зафиксируйте, чтобы избежать вращения, вызванного его весом.
5. Расположите микропипетку в поле зрения микроскопа. Включите инжектор и протолкните рабочую жидкость к головке микропипетки так, чтобы воздух внутри головки пипетки был выдавлен. Убедитесь, что внутри головки пипетки не осталось воздуха, а невооруженным глазом, а не с помощью микроскопа.
6. Приготовьте чашку для ИКСИ на чашке со стеклянным дном, как показано на рисунке 1. Приготовьте две микрокапли 7% раствора поливинилпирролидона (ПВП): меньшая микрокапля предназначена для приготовления микропипетки (5 мкл), а другая — для отбора сперматозоидов (10 мкл). Приготовьте еще одну каплю, сделанную в центре посуды со стеклянным дном из буферизованной среды; эта микрокапля предназначена для ооцита и используется для инъекции сперматозоида (8 μл).
7. Вставьте головку микропипетки в каплю ПВП с содержанием 7% и покройте внутреннюю стенку микропипетки. Энергично работайте инжектором, перемещая его вдоль межфазной границы между рабочей жидкостью и ПВП. Промойте внутреннюю часть микропипетки ПВП на расстоянии около 800 мкм от головки пипетки.
   1. Повторяйте эту процедуру (~3 или 4 раза) до тех пор, пока межфазная граница плавно не сдвинется.

2. Иммобилизация сперматозоидов

1. Установите уровень ИНТЕНСИВНОСТИ на 2 и уровень СКОРОСТЬ на 1 на рабочем блоке. Подайте пьезоимпульс от привода, прикрепленного к держателю микропипетки, когда ножной переключатель включен. При нанесении пьезоимпульса во время процедуры в правой верхней части видео появляется значок «Пьезопульс».
2. Соберите подвижные сперматозоиды с помощью градиента плотности и удерживайте собранные подвижные сперматозоиды в буферной среде. Аспирируйте буферную среду, содержащую собранные подвижные сперматозоиды, около 2-3 мкл с помощью пипетки. Затем введите эту среду в нижнюю часть 7% микрокапли PVP. Выберите сперматозоиды с 400-кратным увеличением.
   1. Прикрепите наконечник микропипетки к хвосту выбранного сперматозоида, а затем приведите в движение пьезопривод. Как правило, для одной иммобилизации сперматозоидов повторяют загон 3 раза. После иммобилизации сперматозоидов сначала отсасывайте сперматозоиды в хвост микропипетки.

3. Операция пьезо-ИКСИ (ооцит с мембраной с высокой растягивающей способностью)

1. Держите головку сперматозоида на расстоянии примерно одной полной длины сперматозоида от головки микропипетки. Во время привода пьезопривода (около 5 раз на одну ооциту) проведите микропипетку, чтобы провести прокол без деформации пеллюцидной зоны. Когда наконечник микропипетки достигает внутреннего слоя zona pellucida, а затем выдолбленный кусочек zona pellucida полностью отсасывается в микропипетку, пункция zona pellucida завершается.
2. Удалите выдолбленный кусочек zona pellucida внутри микропипетки и одновременно переместите сперматозоиды к головке микропипетки. Введите микропипетку внутрь и растяните цитоплазматическую мембрану примерно до 90% диаметра ооцита.
3. Когда она достаточно растянется, запустите пьезопривод один раз, чтобы разорвать мембрану. Разрыв мембраны завершается, когда подтверждается, что мембрана отскочила.
4. После разрыва мембраны введите головку сперматозоида в ооцит. После того, как головка сперматозоида обязательно будет введена в цитоплазму, следите за тем, чтобы не добавить лишнюю жидкость.

4. Операция пьезо-ИКСИ (ооцит с мембраной с низкой растягивающей способностью)

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы объясняем, как работать с ооцитом с мембраной с низкой способностью к растяжению, которая может спонтанно разорваться во время растяжения.

1. Выполняют те же действия, что и ооцит с высокой способностью растягивания мембраны вплоть до растяжения цитоплазматической мембраны.
2. Если во время действия мембрана спонтанно разорвалась, введите головку сперматозоида из положения микропипетки, не продвигая ее дальше вперед, чтобы избежать дегенерации ооцитов после введения сперматозоидов.
3. После того, как головка сперматозоида обязательно будет введена в цитоплазму, следите за тем, чтобы не добавить лишнюю жидкость.

Описанные выше обычные и пьезо-ИКСИ были выполнены на 10 488 зрелых ооцитах (1 744 цикла) 4 эмбриологами. Из них 3 522 ооцита (587 циклов) были инсеминированы с помощью обычного ИКСИ в период с января 2013 года по сентябрь 2016 года и 6 966 ооцитов (1 157 циклов) были осеменены с помощью пьезо-ИКСИ в период с октября 2016 года по декабрь 2020 года в медицинском центре Камеда. В таблице 1 показан средний возраст женщин, показатели оплодотворения, показатели выживаемости, темпы дегенерации, показатели бластоцисты на 5-й день и среднее количество криоконсервированных бластоцист за циклы традиционного ИКСИ и пьезо-ИКСИ. Несмотря на то, что средний возраст женщин при пьезо-ИКСИ был выше по сравнению с обычным ИКСИ, показатели оплодотворения, выживаемости и бластоцисты, а также среднее количество криоконсервированных бластоцист за цикл пьезо-ИКСИ были значительно выше по сравнению с обычным ИКСИ (табл. 2).

Рисунок 1: Чашка ИКСИ, используемая для пьезо-ИКСИ. Расположение микрокапель описано здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Сравнение коэффициентов оплодотворения между обычным ИКСИ и пьезо-ИКСИ. Во всех отчетах наблюдались значительно более высокие показатели оплодотворения при пьезо-ИКСИ по сравнению с обычным ИКСИ.

Таблица 2: Клинические результаты медицинского центра Камеда по сравнению эффективности традиционного ИКСИ и пьезо-ИКСИ. Во всех элементах сравнения значительно лучшие результаты наблюдались при пьезо-ИКСИ по сравнению с обычным ИКСИ.

Результаты показали, что частота оплодотворения, выживаемость, частота бластоцист на 5-й день и среднее количество криоконсервированных бластоцист пьезо-ИКСИ были значительно выше по сравнению с обычными ИКСИ.

В протоколе пьезо-ИКСИ есть 2 важнейших этапа. Первым делом необходимо плотно закрутить крышку держателя держателя пипетки. Вторым шагом является поддержание объема аспирированной ПВП в микропипетке менее 300 микрометров. Неплотное закручивание колпачка держателя микропипетки и аспирация ПВП в микропипетку на глубину более 300 мкм (одна полная длина сперматозоида составляет около 60 мкм) вызывают трудности в иммобилизации сперматозоидов, раскрытии зон и разрыве мембраны из-за снижения пьезомощности. В частности, во время процедуры мы всегда должны обращать внимание на объем аспирированного ПВП в микропипетку. В этом и заключается ограничение пьезо-ИКСИ.

Для создания пьезомощности важно поместить небольшое количество тяжелой жидкости в качестве рабочей жидкости внутрь микропипетки. В предыдущих отчетах ртуть использовалась в качестве рабочей жидкости ^2,3,4. Тем не менее, жидкость на основе фторуглеродов может быть использована вместо ртути для безопасного использования вместо 5,6,7,8,9,11. Жидкость на основе фторуглеродов имеет удельный вес 1,8 и бесцветна, прозрачна и не растворяется в воде. Операционная жидкость имеет прямой контакт с ПВП, удерживающим сперматозоиды. Воздействие на ПВП рабочей жидкости может оказать некоторое негативное воздействие на сперматозоиды или ооциты. Тем не менее, показатели оплодотворения, выживаемости, бластоцисты на 5-й день пьезо-ИКСИ были значительно выше по сравнению с обычным ИКСИ в настоящем исследовании. Мы считаем, что риск от прямого контакта между рабочей жидкостью и ПВП достаточно низок.

Предварительно мы измерили время подготовки микропипетки с помощью масляного инжектора и воздушного инжектора. Среднее время подготовки микропипеток масляным инжектором и пневматическим инжектором составляло соответственно 233 и 106 секунд (P < 0,05)⁸. Время подготовки микропипетки с помощью воздушного инжектора меньше, так как она не содержит масла. Наличие масла продлевает время приготовления микропипетки из-за его липкости. Если пузырьки воздуха смешиваются в масляной области внутри микропипетки после вставки микропипетки в держатель пипетки, пипетку необходимо выбросить, поскольку пьезо-ИКСИ не будет работать. Мы также подсчитали количество потраченных впустую микропипеток во время приготовления микропипеток. Среднее количество потраченных впустую микропипеток на одного пациента для масляного инжектора и воздушного инжектора составило 0,28 ± 0,56 и 0 ± 0 (P < 0,05) соответственно⁸. Тем не менее, не было существенной разницы между масляными и воздушными инжекторами в показателях выживаемости (99% и 99%), оплодотворения (89% и 90%) и хорошего качества эмбрионов на 3-й день (61% и 61%) после пьезо-ИКСИ⁸. Мы потратили впустую дополнительные 3,2 часа и 25 микропипеток в группе масляного инжектора (90 пациентов) по сравнению с группой воздушных инжекторов (90 пациентов) во время исследования⁸. Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование пневматического инжектора вместо масляного является хорошей модификацией пьезо-ИКСИ.

Пьезо-ИКСИ может разорвать мембрану полуавтоматически без цитоплазматической аспирации в микропипетку. Эта процедура разрыва мембраны стабильна и проста. Пьезо-ИКСИ также может способствовать сокращению периода обучения ИКСИ. Ранее мы оценивали влияние пьезо-ИКСИ на показатели выживаемости, оплодотворения, бластоцисты у молодого эмбриолога. Перед началом клинического лечения ИКСИ юный эмбриолог 30 раз проходил практику пьезо-ИКСИ. Мы сравнили выживаемость, оплодотворение, показатели бластоцисты молодых и старших эмбриологов для их 1-100 ооцитов. Выживаемость, оплодотворение, показатели бластоцисты у молодых и старших эмбриологов составили 100% и 97%, 87% и 91%, 47% и 57%^{соответственно9.} Существенной разницы между молодым и старшим эмбриологами во всех пунктах сравнения не выявлено. Эти результаты показали, что пьезо-ИКСИ имеет значение в процедуре разрыва мембраны, что может способствовать сокращению периода обучения ИКСИ молодого эмбриолога.

Некоторые исследователи сообщили о клинической эффективности интрацитоплазматической морфологически отобранной инъекции сперматозоида (IMSI). Setti et al. сравнили клинические исходы между ИКСИ и ИМСИ в мета-анализе исследования¹⁰. Достоверной разницы в показателях оплодотворения между группами ИКСИ и ИМСИ¹⁰ не выявлено. Тем не менее, процент эмбрионов высшего качества в группе IMSI был значительно выше по сравнению с группой ICSI¹⁰. Насколько нам известно, ни в одном исследовании не изучалось влияние ИМСИ в сочетании с пьезоИКСИ на оплодотворение и развитие эмбриона. Мы ретроспективно исследовали влияние увеличения отбора сперматозоидов (400x против 1200x) на оплодотворение и развитие эмбрионов в пьезо-ICSI. Уровень оплодотворения в группе 1200x (92%) был значительно выше по сравнению с группой 400x (77%) (P = 0,0002)¹¹. Показатель хорошего качества эмбрионов на 3-й день в группе 1200x (64%) был значительно выше по сравнению с группой 400x (46%) (P = 0,0021)¹¹. Мы попытались отобрать сперматозоиды без вакуолей в головке сперматозоида при 1200-кратном увеличении. Эта процедура может отбирать сперматозоиды с более низкой степенью фрагментации ДНК сперматозоидов¹². Таким образом, IMSI может быть новым применением пьезо-ICSI.

В этой статье мы описали протокол пьезо-ИКСИ, который может улучшить результаты ИКСИ без пропуска жизнеспособных ооцитов в АРТ человека.

Авторам нечего раскрывать.