用于人类卵母细胞的压电 ICSI

在这里，我们描述了一种使用压电驱动的微量移液器将胞浆内精子注射到人卵母细胞中的方案。

自从报道了通过卵胞浆内单精子注射 （ICSI） 实现的首次成功怀孕以来，ICSI 已成为辅助生殖技术 （ART） 中的一项重要技术。ICSI 使用带有尖刺尖端的微量移液器穿透透明带和膜。然后，通常将细胞质吸入微量移液器中以破坏膜 （常规 ICSI）。常规 ICSI 后小鼠卵母细胞的存活率和受精率分别低至 16% 和 8%。Kimura 和 Yanagimachi 为小鼠 ICSI 应用了压电驱动单元、汞和带有平头的微量移液器。通过将这些类型的设备组合到微量移液器 （piezo-ICSI） 中，可以半自动地进行膜破裂。这些作者报告说，与传统 ICSI 相比（80% 和 78%），存活率和受精率 （16% 和 8%） 显著更高。因此，压电 ICSI 可能不仅适用于小鼠卵母细胞，而且对人卵母细胞 ICSI 也有效。然而，只有五篇论文评估了与传统 ICSI 相比压电 ICSI 对人类卵母细胞的有效性。与传统 ICSI 相比，所有这 5 篇论文都报告了显着更高的受精率。此处描述的压电 ICSI 方案的目标是与传统 ICSI 相比改善 ICSI 的临床结果。

自从 Palermo 博士报告了通过卵胞浆内单精子注射 （ICSI^{） 实现}的首次成功怀孕以来1，ICSI 已成为辅助生殖技术 （ART） 中的一项重要技术。ICSI 使用带有尖刺尖端的微量移液器穿透透明带和膜。然后，通常将细胞质吸入微量移液器中以破坏膜 （常规 ICSI）。常规 ICSI 后小鼠卵母细胞的存活率和受精率分别低至 16% 和 8%²。Kimura 和 Yanagimachi 为小鼠 ICSI² 应用了压电驱动单元、汞和带平头的微量移液器。通过组合这些类型的设备 （piezo-ICSI），可以半自动地进行膜破裂。这些作者报告说，与传统 ICSI 相比，压电 ICSI 的存活率和受精率（80% 和 78%）显著更高（16% 和 8%）²。在压电 ICSI 中获得更好结果的原因之一可能是膜破裂的过程。压电 ICSI 可以稳定地半自动打破膜，而无需将细胞质吸入微量移液器中。这些结果表明，在膜破裂过程中，细胞质吸入微量移液器对小鼠卵母细胞具有侵袭性。因此，压电 ICSI 可能不仅适用于小鼠卵母细胞，而且对人卵母细胞 ICSI 也有效。

然而，只有五篇可用的论文评估了与传统 ICSI 相比，压电 ICSI 对人类卵母细胞的有效性。所有这五篇论文都报告了与传统^ICSI 3,4,5,6,7 相比，压电 ICSI 的受精率显着更高（表 1）。因此，与传统的 ICSI 相比，压电 ICSI 可能会提高存活率和受精率。此处描述的压电 ICSI 方案的目标是与传统 ICSI 相比改善 ICSI 的临床结果。

下面描述的压电 ICSI 方案遵循龟田医疗中心人类研究伦理委员会的指导方针。

1. 设备和准备

1. 使用由驱动单元、作箱、脚踏开关和控制器组成的压电 ICSI 系统。使用任何类型的倒置显微镜或三轴显微作器。将压电驱动装置连接到微量移液器支架上，然后将脚踏开关放在地板上。在作框上将 INTENSITY 级别设置为 2，将 SPEED 级别设置为 1。
2. 使用市售的扁平尖端压电 ICSI 微量移液器。将作液（基于碳氟化合物的液体）填充微量移液器，长度为 20 mm。避免在作液中混合任何气泡。使用液体填充装置将任何气泡或多余的作液吸向移液器背面。
3. 将微量移液器安装到注射微量移液器支架中。如果注射微量移液器支架有硅胶管，请将移液器头部插入硅胶管约 5 mm。拧紧支架盖并牢固固定微量移液器。
4. 将驱动装置连接到机械手上并固定牢固，以避免其重量引起的任何旋转。
5. 将微量移液器放置在显微镜区域中。作进样器并将作液推至微量移液器的头部，以便挤出移液器头部内的任何空气。用肉眼而不是显微镜确认移液器头部内没有空气。
6. 如图 1 所示，在玻璃底培养皿上准备 ICSI 培养皿。准备两个 7% 聚乙烯吡咯烷酮溶液 （PVP） 的微滴：较小的微滴用于制备微量移液器 （5 μL），另一个用于精子选择 （10 μL）。用缓冲培养基在玻璃底培养皿的中心准备另一个液滴;该微滴用于卵母细胞，用于精子注射 （8 μL）。
7. 将微量移液器的头部插入 7% PVP 液滴中，并涂覆微量移液器的内壁。用力作喷油器，沿着作液和 PVP 之间的界面边界移动。用 PVP 冲洗微量移液器的内部，距离移液器头部约 800 μm。
   1. 重复此过程（~3 或 4 次），直到界面边界平滑滑动。

2. 精子固定

1. 在作框上将 INTENSITY 级别设置为 2，将 SPEED 级别设置为 1。当脚踏开关打开时，从连接到微量移液器支架的驱动装置施加压电脉冲。在手术过程中施加压电脉冲时，“压电脉冲”图标会出现在视频的右上角。
2. 使用密度梯度收集活动精子，并将收集的活动精子保持在缓冲培养基中。使用移液管吸出装有收集的运动精子约 2-3 μL 的缓冲培养基。然后将该培养基注入 7% PVP 微滴的下侧。在 400 倍放大镜下选择精子。
   1. 将微量移液器吸头连接到所选精子的尾部，然后驱动压电驱动装置。通常，重复驾驶 3 次以固定一个精子。精子固定后，先将精子吸入微量移液器尾部。

3. 压电 ICSI作（具有高拉伸能力膜的卵母细胞）

1. 将精子的头部保持在距离微量移液器头部大约一个全长精子的位置。在驱动压电驱动装置（每个卵母细胞约 5 次）的同时，推进微量移液管进行穿刺，而不会使透明带变形。当微量移液器尖端到达透明带的内层，然后将透明带的挖空部分完全吸入微量移液器中时，透明带的穿刺完成。
2. 去除微量移液器内透明带的挖空部分，同时将精子移动到微量移液器的头部。将微量移液管推入并拉伸细胞质膜，直至卵母细胞直径的约 90%。
3. 当它被充分拉伸时，启动压电驱动器一次以破坏膜。当确认膜已反弹时，膜破裂完成。
4. 胎膜破裂后，将精子头部注射到卵母细胞中。精子的头部肯定被注射到细胞质中后，注意不要添加不必要的液体。

4. 压电 ICSI作（具有低拉伸能力膜的卵母细胞）

注意：我们解释了如何处理具有低拉伸能力膜的卵母细胞，该膜在拉伸过程中可能会自发破裂。

1. 执行与卵母细胞相同的动作，具有高拉伸能力的膜，直至拉伸细胞质膜。
2. 如果膜在作用过程中自发破裂，请从微量移液器的位置注射精子的头部，不要进一步向前推动，以避免精子注射后卵母细胞变性。
3. 精子的头部肯定被注射到细胞质中后，注意不要添加不必要的液体。

上述常规 ICSI 和压电 ICSI 由 4 位胚胎学家对 10,488 个成熟卵母细胞 （1,744 个周期） 进行。其中，3,522 个卵母细胞（587 个周期）在 2013 年 1 月至 2016 年 9 月期间通过常规 ICSI 授精，6,966 个卵母细胞（1,157 个周期）在 2016 年 10 月至 2020 年 12 月期间在龟田医疗中心通过压电 ICSI 授精。 表 1 显示了女性的平均年龄、受精率、存活率、退化率、第 5 天囊胚率以及传统 ICSI 和压电 ICSI 每个周期冷冻保存的囊胚的平均数量。尽管与传统 ICSI 相比，压电 ICSI 女性的平均年龄更高，但与传统 ICSI 相比，压电 ICSI 的受精率、存活率和囊胚率以及每个周期冷冻保存的囊胚的平均数量显着更高（表 2）。

图 1：用于压电 ICSI 的 ICSI 培养皿。 此处描述了微液滴的布局。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：传统 ICSI 和压电 ICSI 之间的受精率比较。 在所有报告中，与传统 ICSI 相比，在压电 ICSI 中观察到的受精率显着更高。

表 2：Kameda 医疗中心比较传统 ICSI 和压电 ICSI 疗效的临床结果。 在所有比较项目中，与传统 ICSI 相比，压电 ICSI 观察到的结果显着更好。

结果表明，与传统 ICSI 相比，压电 ICSI 的受精率、存活率、第 5 天囊胚率和冷冻保存的囊胚平均数量显着升高。

压电 ICSI 协议中有 2 个关键步骤。第一步是用力扭动移液器支架的支架盖。第二步是将吸入微量移液器的 PVP 体积保持在 300 微米以下。松散地扭动微量移液器支架的支架盖并将 PVP 吸入微量移液器中超过 300 微米（一个精子的全长约为 60 微米），由于压电功率降低，会导致精子固定、带打开和膜破裂困难。特别是，在手术过程中，我们必须始终注意吸入微量移液器的 PVP 体积。这就是压电 ICSI 的局限性。

必须在微量移液器内放置少量重液体作为作液，以产生压电功率。在之前的报告中，汞被用作作液 ^2,3,4。但是，可以使用碳氟化合物基液体代替汞，以便安全使用 5,6,7,8,9,11。氟碳基液体的比重为 1.8，无色、透明、不溶于水。手术液与装有精子的 PVP 直接接触。PVP 暴露于手术液可能会对精子或卵母细胞产生一些负面影响。然而，在本研究中，压电 ICSI 的受精率、存活率、第 5 天囊胚率显着高于常规 ICSI。我们认为，作液和 PVP 之间直接接触的风险相当低。

我们之前使用注油器和空气注射器测量了微量移液器制备的时间。微量移液器制备注油器和空气注射器的平均时间分别为 233 和 106 秒 （P < 0.05）⁸。由于无油，因此使用空气注射器的微量移液器准备时间更短。由于油的粘性，油的存在延长了微量移液器的制备时间。如果将微量移液器插入移液器支架后，微量移液器内的油区混入气泡，则必须丢弃移液器，因为压电 ICSI 将不起作用。我们还计算了微量移液器制备过程中浪费的微量移液器的数量。注油器和空气注射器每名患者浪费的微量移液器的平均数量分别为 0.28 ± 0.56 和 0 ± 0 （P < 0.05）⁸。然而，压电 ICSI⁸ 后，油和空气注射器在存活率 （99% 和 99%） 、受精率 （89% 和 90%） 和高质量的第 3 天胚胎 （61% 和 61%） 方面没有显着差异。在研究期间，与空气注射器组（90 名患者）相比，我们在注油器组（90 名患者）中额外浪费了 3.2 小时和 25 个微量移液器⁸。结果表明，使用空气喷射器代替注油器是对压电 ICSI 的良好改性。

压电式 ICSI 可以半自动地打破膜，而无需将细胞质吸入微量移液器中。这种膜破裂程序稳定且简单。压电 ICSI 也有助于缩短 ICSI 培训时间。我们之前评估了压电 ICSI 对年轻胚胎学家存活率、受精率、囊胚率的影响。这位年轻的胚胎学家在开始临床 ICSI 治疗之前接受了 30 次压电 ICSI 实践。我们比较了年轻和老年胚胎学家的前 100 个卵母细胞的存活率、受精率、囊胚率。年轻和高级胚胎学家的存活率、受精率、囊胚率分别为 100% 和 97% 、 87% 和 91% 、 47% 和 57%⁹ 9。在所有比较项目中，年轻和高级胚胎学家之间没有显着差异。这些结果表明，压电 ICSI 在膜破裂过程中具有重要意义，有助于缩短年轻胚胎学家的 ICSI 培训期。

一些研究人员报告了胞浆内形态学选择的精子注射 （IMSI） 的临床效率。Setti 等人在一项荟萃分析研究中比较了 ICSI 和 IMSI 之间的临床结果¹⁰。ICSI 组和 IMSI 组之间的受精率无显著差异¹⁰。然而，IMSI 组的优质胚胎率显著高于 ICSI 组¹⁰。据我们所知，没有研究检查过 IMSI 联合压电 ICSI 对受精和胚胎发育的影响。我们回顾性研究了精子选择放大倍数 （400 倍对 1,200 倍） 对压电 ICSI 受精和胚胎发育的影响。与 400x 组 （77%） 相比，1,200x 组的受精率 （92%） 显着升高 （P = 0.0002）¹¹。与 400x 组 （46%） 相比，1,200x 组 （64%） 的优质第 3 天胚胎率显着升高 （P = 0.0021）¹¹。我们试图在 1,200 倍放大镜下选择精子头部没有液泡的精子。该程序可能会选择精子 DNA 片段化程度较低的精子¹²。因此，IMSI 可能是压电 ICSI 的新应用。

在这里，我们描述了一种压电 ICSI 方案，该方案可以改善 ICSI 结果，而不会在人类 ART 中遗漏活卵母细胞。

作者没有什么可披露的。