Tratamento de luz infravermelha não térmica de lesão de isquemia/reperfusão e subsequente análise da diferenciação de macrófagos

Descrevemos a redução da lesão de reperfusão por irradiação de 670 nm em um modelo de camundongo de isquemia e reperfusão por colocação de torniquete. Essa irradiação de 670 nm reduziu a resposta inflamatória, diminuiu o número de macrófagos pró-inflamatórios e aumentou os macrófagos protetores.

Danos teciduais e necrose por processos inflamatórios são consequência da lesão de isquemia e reperfusão (IRI). No músculo esquelético, a isquemia reduz a capacidade energética aeróbica das células musculares, levando a alterações bioquímicas adversas e inflamação. O objetivo deste estudo é mostrar que a exposição à luz infravermelha próxima (NIR) durante um período de isquemia reduz a IRI diminuindo a necrose e a inflamação, além de diminuir o M1 pró-inflamatório e aumentar os macrófagos M2 protetores. Camundongos C57 / Bl6 foram submetidos a isquemia unilateral de membros posteriores induzida por torniquete por 3 h, seguida de reperfusão por 15 ou 30 min. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em 3 grupos. O grupo 1 foi submetido à IRI com 30 min de reperfusão. O grupo 2 foi submetido à IRI com reperfusão de 15 minutos. Cada grupo consistiu de camundongos tratados com 50% sem NIR e 50% com NIR com exposição de 50 mW / cm² por 5 min / 1 h após o fechamento do torniquete. O grupo 3 foi composto por animais simulados anestesiados por 3 h, omitindo o IRI.

A imagem de fluxo com doppler a laser foi realizada em todos os camundongos para confirmar isquemia e reperfusão. Os dados de fluxo foram expressos como a razão entre o membro isquêmico e o controle contralateral. Os camundongos foram eutanasiados após a reperfusão, e o quadríceps e o gastrocnêmio foram colhidos. Imunoprecipitação e western blot dos macrófagos-marcadores CD68 (M1) e CD206 (M2) foram realizados e normalizados para a expressão de CD14. A expressão dos marcadores inflamatórios CXCL1 e CXCL5 foi significativamente reduzida pelo NIR no grupo IRI. Uma diminuição significativa no CD68 e um aumento na expressão de CD206 foi observado nos animais que receberam IR e NIR. A necrose tecidual foi diminuída pelo NIR no grupo IRI, conforme visualizado pela coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC). Os resultados demonstram que a exposição ao NIR reduziu o IRI e melhorou a sobrevivência do tecido. O NIR reduziu a inflamação, diminuiu o M1 pró-inflamatório e aumentou os macrófagos M2 protetores. A exposição ao NIR reduziu a inflamação e aumentou a regeneração, levando à proteção do tecido após a isquemia.

A lesão de isquemia-reperfusão (IRI) é um desafio clínico observado após lesões vasculares e uso prolongado de torniquetes cirúrgicos. Estudos anteriores mostraram que 60-90 min é o limite superior para o tempo de isquemia quente, além do qual podem ocorrer danos irreversíveis ao tecido. Mais do que qualquer outro fator, as limitações do tempo de isquemia quente limitam o sucesso e o salvamento do reimplante de membros disvasculares ^1,2.

No músculo esquelético, a isquemia reduz a capacidade aeróbia das células, levando à inflamação aguda e alterações bioquímicas adversas. Esses efeitos são agravados pela reperfusão, que estimula o recrutamento de neutrófilos e a produção de radicais livres, danificando ainda mais o músculo esquelético. Isso pode ocorrer a partir da oclusão vascular, seja resultado de lesão ou uso intencional de torniquete para evitar hemorragia. Alguns dos principais mediadores nesse processo são a mieloperoxidase (MPO), uma enzima expressa por neutrófilos que é parte integrante da função respiratória de explosão e produção de radicais livres³, e quimiocinas como CXCL1 e CXCL5 que servem para recrutar neutrófilos para locais de inflamação aguda⁴.

A artéria femoral não foi dissecada para mimetizar um torniquete aberto em caso de emergência. Essa abordagem também se baseia na reprodutibilidade da criação de isquemia e reperfusão, bem como em uma área livre de sangue consistente. Pesquisas anteriores demonstraram que a exposição à luz infravermelha não térmica (NIR) com comprimento de onda de 670 nm pode aumentar a colateralização vascular em um membro posterior isquêmico de camundongo com exposição NIR ao longo de dias, mitigando os efeitos do IRI⁵. Além disso, pesquisas anteriores demonstraram que a luz NIR pode induzir a polarização de macrófagos em fenótipos pró-inflamatórios (M1) ou pró-cicatrizadores (M2)⁶.

Qualquer tratamento que possa minimizar o dano tecidual e a morte celular após hipóxia e reperfusão seria benéfico para aumentar o sucesso do salvamento do membro após lesões vasculares. Portanto, o objetivo geral é melhorar o IRI introduzindo o tratamento com luz de 670 nm como uma opção viável para outras modalidades de tratamento. Este artigo baseia-se na hipótese de que a exposição à luz NIR durante um período de isquemia diminui a inflamação e a necrose tecidual, diminuindo a secreção de proteínas quimioatraentes e o influxo de células inflamatórias, induzindo os macrófagos a assumir um fenótipo M2.

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (Protocolo: AUA#1517). Todas as pesquisas envolvendo camundongos foram conduzidas em conformidade com a política do PHS.

1. Colocação do torniquete

NOTA: Um torniquete foi colocado para induzir isquemia e obter um campo cirúrgico livre de sangue.

1. Anestesiar um camundongo C57/Bl6 com isoflurano na câmara de indução a uma concentração de 3-5%.
2. Remova o mouse da câmara de indução quando ele não responder aos beliscões dos dedos dos pés. Coloque o mouse em um cone nasal para anestesia contínua a 1,5-2% em uma almofada de aquecimento com um tapete antirreflexo abaixo de um gerador de imagens doppler a laser (LDI).
3. Coloque o torniquete ao redor do membro posterior esquerdo (Figura 1).
   NOTA: Não feche o torniquete ainda. Meça primeiro o fluxo sanguíneo (consulte a seção 2).

2. Medição do fluxo sanguíneo por LDI

NOTA: O fluxo sanguíneo foi medido para confirmar a oclusão e reperfusão adequadas, conforme descrito anteriormente⁷.

1. Coloque o mouse anestesiado abaixo do LDI (26 cm) em uma almofada de aquecimento com uma superfície não reflexiva em decúbito ventral com as pernas esticadas e as patas voltadas para cima.
2. Capture imagens colocando o mouse dentro da área de captura do laser (16,1 cm x 16,1 cm).
   1. Ajuste o laser para uma velocidade de varredura de 4 ms/pixel. Capture imagens com o software proprietário pressionando o botão de gravação . Tire imagens antes, durante a oclusão e durante a reperfusão clicando no botão de gravação .
      NOTA: As imagens são imagens de mapas relacionadas ao fluxo; vermelho é bom fluxo sanguíneo; azul não é fluxo sanguíneo. Confirme na imagem que o membro posterior ocluído é azul. Da mesma forma, verifique a imagem para confirmar se o membro posterior previamente ocluído está vermelho na reperfusão. É imprescindível ter um tapete não refletivo para o LDI; caso contrário, o reflexo afetará as imagens.
3. Analise as imagens com o software fornecido, definindo uma região de interesse. Estabeleça uma relação entre as pernas isquêmicas e de controle.

3. Protocolo de isquemia e reperfusão

1. Feche o torniquete ao redor do membro posterior do camundongo anestesiado por 3 h.
   NOTA: Apertar o torniquete cria isquemia, interrompendo o fluxo sanguíneo.
2. Abra o torniquete após 3 h de oclusão; Abra e perfunda o membro posterior por 15 ou 30 min.

4. Colheita de tecidos

1. Aumente a anestesia para 5% de isoflurano para anestesiar profundamente os camundongos. Realize um pneumotórax abrindo a cavidade torácica com uma tesoura afiada para garantir a morte. Colha os músculos gastrocnêmio e quadríceps ^8,9,10.
2. Congelar o tecido recolhido em azoto líquido e conservá-lo a -80 °C para análise posterior.

5. Aplicação NIR

NOTA: O NIR é aplicado para diminuir a inflamação e reduzir a lesão de reperfusão.

1. Aplique NIR de 670 nm a uma intensidade de 100 mW por 5 min uma vez por hora durante a oclusão.
2. Mire no membro posterior com a fonte de luz de fibra óptica a uma distância de 2,5 cm entre o membro posterior e a luz. Não exponha a perna contralateral ao NIR (consulte a Figura 1 para a configuração).
3. Acenda a luz NIR por 5 min por hora durante o período isquêmico.
4. Instrumente o grupo simulado da mesma maneira. Não feche o torniquete nem aplique NIR no membro posterior.
   NOTA: A luz NIR possui um dissipador de calor. A temperatura não aumenta dentro de 5 minutos após a exposição à luz¹¹.

6. Necrose TTC

NOTA: A necrose tecidual é avaliada para visualizar a redução da necrose no tecido muscular.

1. Manchar os músculos frescos do quadríceps com TTC a 37 °C por 20-30 min em TTC a 1% em tampão fosfato 0,1 M ajustado para pH 7,4.
2. Observe o tecido vivo vermelho e corado com base na presença de um precipitado de formazan.
   NOTA: A coloração vermelha é baseada na redução do TTC pelas enzimas desidrogenase no tecido saudável. O tecido necrótico não é corado¹⁰.
3. Capture imagens de fatias coradas com TTC para análise e meça a região necrótica definindo uma região de interesse.

7. Análise ocidental para clorotirosina

1. Submeter os camundongos ao protocolo de isquemia/reperfusão (seção 3).
2. Colha tecidos (seção 4) e isole a proteína conforme descrito anteriormente¹². Determinar a concentração de proteínas pelo ensaio de Bradford¹³.
3. Use o lisado de proteína total para realizar eletroforese e borrar para 3-clorotirosina conforme descrito anteriormente¹².
4. Realize um western blot em lisados de gastrocnêmios.
   1. Adicione o tampão de amostra Laemmli contendo 5% de mercaptoetanol às amostras para obter uma concentração de 25 μg de proteína total em 40 μL.
   2. Execute as amostras em um gel estendido de trisglicina a 4-15% (consulte a Tabela de Materiais) a 50 mV por 5 min. Aumente a tensão para 100 mV por 1 h até que a frente do corante se esgote.
5. Incube o gel em 1x tampão de transferência (25 mM Tris, 190 mM de glicina, 20% de metanol; ajuste o pH para 8,3 se necessário) por 10 min.
6. Monte o sanduíche de transferência (esponja, filtro, gel, membrana de celulose, filtro, esponja). Coloque uma bolsa de gelo reutilizável no aparelho de transferência. Transfira por 30 min na câmara fria a 100 mA.
   NOTA: Certifique-se de que nenhuma bolha esteja presa no sanduíche de transferência, a mancha esteja no cátodo e o gel no ânodo.
7. Enxágue o borrão e bloqueie-o em tampão de bloqueio (consulte a Tabela de Materiais) com 0,05% de interpolação por 30 min em temperatura ambiente. Lave o borrão com solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 5% de Tween três vezes por 5 min cada antes de adicionar o anticorpo primário.
8. Incubar durante a noite com os anticorpos policlonais primários contra a 3-clorotirosina. Dilua os anticorpos no tampão de bloqueio com Tween a 0,05% (1:1.000).
9. Use IgG anti-camundongo conjugada com peroxidase de rábano (HRP) e IgG anti-cabra HRP (diluição 1:10.000) como anticorpos secundários.
10. Visualize bandas de identidade nas manchas usando o reagente de quimioluminescência aprimorada (ECL) e um sistema de imagem.
    1. Misture os componentes com base no protocolo do fabricante e incube-os com o blot por 3 min para ligar os reagentes ECL às bandas de interesse.
    2. Faça a imagem da mancha com um sistema de imagem (consulte a Tabela de Materiais). Use software de imagem como o ImageJ para medir a densidade e normalizar os valores de densidade das bandas de interesse para os das bandas de controle.

8. ELISA para CXCL1 e CXCL5

1. Isole a proteína total dos músculos gastrocnêmios conforme descrito anteriormente¹².
2. Avalie o grau de inflamação por ELISA para CXCL1 e CXCL5 conforme descrito anteriormente¹⁴ e de acordo com as instruções do fabricante.

9. Imunoprecipitação seguida de análise ocidental

1. Submeter os ratinhos ao protocolo de isquemia/reperfusão (secção 3).
2. Colha os tecidos (seção 4) e isole a proteína conforme descrito anteriormente¹². Determine a concentração de proteína pelo Ensaio de Bradford¹³.
3. Para concentrar a fração de macrófagos do lisado proteico total, realizar uma imunoprecipitação para CD14 conforme descrito anteriormente¹⁵.
4. Use o imunoprecipitado CD14 para realizar eletroforese e blot para CD206 e CD68 conforme descrito anteriormente¹².
5. Efectuar uma western blot nos lisados dos gastrocnêmios conforme descrito na secção 7.
6. Incubar os imunoprecipitados durante a noite com os anticorpos policlonais primários contra CD206 ou CD68. Diluir os anticorpos 1:200 em TBS.
7. Use IgG anti-camundongo de burro conjugado com HRP e IgG anti-cabra HRP (diluição de 1:10.000) como anticorpos secundários.
8. Aplique o reagente ECL no blot após misturar os componentes com base no protocolo do fabricante e incube por 3 min para visualizar as bandas de interesse. Visualize a mancha usando um sistema de imagem.

10. Análise estatística

1. Realizar análise estatística dos dados dentro e entre os grupos com análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas seguida da modificação do teste t de Student de Bonferroni, p ≤ 0,05.
2. Expresse os dados como média ± erro padrão da média (SEM) ou média ± desvio padrão (DP).

As medidas de fluxo confirmaram isquemia e reperfusão
A colocação da luz NIR e o protocolo experimental estão representados na Figura 1. Um modelo de isquemia murina dos membros posteriores foi desenvolvido e empregado para avaliar o efeito da exposição ao NIR na RII do músculo esquelético. Como era esperado, a imagem de fluxo com laser Doppler (Figura 2A) verificou que o torniquete foi eficaz na indu...

Este artigo descreve um dos primeiros estudos a enfocar a redução da lesão de reperfusão pelo tratamento com luz NIR, alterando a resposta inflamatória no membro posterior. A lesão de isquemia e reperfusão e o tratamento com luz NIR não são totalmente novos. Outros estudos enfocaram a reperfusão de isquemia por luz NIR. O tratamento com luz NIR tem sido usado com sucesso na redução do tamanho da infração miocárdica e na redução do dano renal após lesão de isquemia e re...

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecemos ao Departamento de Cirurgia Ortopédica pelo financiamento deste estudo. Também agradecemos a Brian Lindemer e Grant Broeckel por seu apoio técnico.