علاج ضوء الأشعة تحت الحمراء غير الحراري لإصابة نقص التروية / إعادة التروية والتحليل اللاحق لتمايز البلاعم

نصف تقليل إصابة إعادة التروية بمقدار 670 نانومتر في نموذج فأر من نقص التروية وإعادة التروية عن طريق وضع العاصبة. قلل هذا التشعيع 670 نانومتر من الاستجابة الالتهابية ، وقلل من عدد البلاعم المسببة للالتهابات ، وزاد من الضامة الواقية.

تلف الأنسجة والنخر الناتج عن العمليات الالتهابية هو نتيجة لإصابة نقص التروية (IRI). في العضلات الهيكلية ، يقلل نقص التروية من قدرة الطاقة الهوائية لخلايا العضلات ، مما يؤدي إلى تغيرات كيميائية حيوية ضارة والتهابات. الهدف من هذه الدراسة هو إظهار أن التعرض لضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) خلال فترة نقص التروية يقلل من IRI عن طريق تقليل النخر والالتهاب بالإضافة إلى تقليل M1 المسببة للالتهابات وزيادة البلاعم M2 الواقية. خضعت الفئران C57 / Bl6 لنقص تروية الأطراف الخلفية الناجم عن عاصبة أحادية الجانب لمدة 3 ساعات متبوعا بإعادة التروية لمدة 15 أو 30 دقيقة. تم تعيين الفئران بشكل عشوائي إلى 3 مجموعات. خضعت المجموعة 1 للضخ الداخلي لمدة 30 دقيقة. خضعت المجموعة 2 للريبري مع إعادة تروية لمدة 15 دقيقة. تألفت كل مجموعة من 50٪ من الفئران المعالجة بالأشعة تحت الحمراء و 50٪ من الفئران المعالجة بالأشعة تحت الحمراء مع تعرض 50 ميجاوات / سم² لمدة 5 دقائق / 1 ساعة بعد إغلاق العاصبة. كانت المجموعة 3 عبارة عن زائفة تم تخديرها لمدة 3 ساعات مع حذف IRI.

تم إجراء تصوير تدفق دوبلر بالليزر على جميع الفئران لتأكيد نقص التروية وإعادة التروية. تم التعبير عن بيانات التدفق على أنها نسبة الطرف الإقفاري والتحكم المقابل. تم القتل الرحيم للفئران بعد إعادة التروية ، وتم حصاد عضلات الفخذ والمعدة تم إجراء الترسيب المناعي واللطخة الغربية لعلامات البلاعم CD68 (M1) و CD206 (M2) وتطبيعها إلى تعبير CD14. تم تقليل التعبير عن العلامات الالتهابية CXCL1 و CXCL5 بشكل كبير بواسطة NIR في مجموعة IRI. لوحظ انخفاض كبير في CD68 وزيادة في تعبير CD206 في التي تتلقى الأشعة تحت الحمراء والأشعة تحت الحمراء NIR. تم تقليل نخر الأنسجة بواسطة NIR في مجموعة IRI ، كما هو موضح من خلال تلطيخ 2،3،5-ثلاثي فينيلترازوليوم كلوريد (TTC). تظهر النتائج أن التعرض للأشعة تحت الحمراء يقلل من IRI ويحسن بقاء الأنسجة. قلل الأشعة تحت الحمراء من الالتهاب ، وخفض M1 المسببة للالتهابات ، وزاد من الضامة M2 الواقية. أدى التعرض للأشعة تحت الحمراء إلى تقليل الالتهاب وتحسين التجدد ، مما يؤدي إلى حماية الأنسجة بعد نقص التروية.

إصابة نقص التروية (IRI) هي تحد سريري يظهر بعد إصابات الأوعية الدموية والاستخدام المطول للعاصبات الجراحية. أظهرت الدراسات السابقة أن 60-90 دقيقة هي العتبة العليا لوقت نقص التروية الدافئ ، والتي يمكن أن يحدث بعدها تلف الأنسجة الذي لا رجعة فيه. أكثر من أي عامل واحد آخر ، تحد قيود وقت نقص التروية الدافئ من نجاح وإنقاذ إعادة زرع الأطراف الوعائية^1،2.

في العضلات الهيكلية ، يقلل نقص التروية من القدرة الهوائية للخلايا ، مما يؤدي إلى التهاب حاد وتغيرات كيميائية حيوية ضارة. تتفاقم هذه التأثيرات عن طريق إعادة التروية ، مما يحفز تجنيد العدلات وإنتاج الجذور الحرة ، مما يزيد من إتلاف العضلات الهيكلية. يمكن أن يحدث هذا من انسداد الأوعية الدموية ، سواء كان نتيجة الإصابة أو الاستخدام المتعمد للعاصبة لمنع النزيف. بعض الوسطاء الرئيسيين في هذه العملية هم مايلوبيروكسيداز (MPO) ، وهو إنزيم يتم التعبير عنه بواسطة العدلات وهو جزء لا يتجزأ من وظيفة انفجار الجهاز التنفسي وإنتاج الجذور الحرة³ ، والكيموكينات مثل CXCL1 و CXCL5 التي تعمل على تجنيد العدلات في مواقع الالتهاب الحاد⁴.

لم يتم تشريح الشريان الفخذي لتقليد عاصبة مفتوحة في حالات الطوارئ. يعتمد هذا النهج أيضا على قابلية تكرار خلق نقص التروية وإعادة التروية بالإضافة إلى منطقة خالية من الدم بشكل متسق. أظهرت الأبحاث السابقة أن التعرض لضوء الأشعة تحت الحمراء غير الحرارية (NIR) بطول موجي يبلغ 670 نانومتر يمكن أن يزيد من ضمانات الأوعية الدموية في الطرف الخلفي الإقفاري للفأر مع التعرض للأشعة تحت الحمراء على مدار أيام ، مما يخفف من آثار IRI⁵. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الأبحاث السابقة أن ضوء الأشعة تحت الحمراء يمكن أن يحفز استقطاب البلاعم إما في الأنماط الظاهرية المسببة للالتهابات (M1) أو الشفاء (M2)⁶.

أي علاج يمكن أن يقلل من تلف الأنسجة والموت الخلوي بعد نقص الأكسجة وإعادة التروية سيكون مفيدا في زيادة نجاح إنقاذ الأطراف بعد إصابات الأوعية الدموية. لذلك ، فإن الهدف العام هو تحسين IRI من خلال إدخال معالجة الضوء 670 نانومتر كخيار قابل للتطبيق لطرق العلاج الأخرى. تستند هذه الورقة إلى الفرضية القائلة بأن التعرض لضوء الأشعة تحت الحمراء أثناء فترة نقص التروية يقلل من الالتهاب ونخر الأنسجة عن طريق تقليل إفراز البروتينات الجاذبة الكيميائية وتدفق الخلايا الالتهابية عن طريق تحفيز البلاعم على اتخاذ نمط ظاهري M2.

أجريت هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبر التابع للمعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (البروتوكول: AUA # 1517). أجريت جميع الأبحاث التي شملت الفئران وفقا لسياسة PHS.

1. وضع عاصبة

ملاحظة: تم وضع عاصبة للحث على نقص التروية وتحقيق مجال جراحي خال من الدم.

1. تخدير فأر C57 / Bl6 باستخدام الأيزوفلوران في غرفة الحث بتركيز 3-5٪.
2. قم بإزالة الماوس من حجرة الحث عندما لا يستجيب لقرصات أصابع القدم. ضع الفأر في مخروط الأنف لاستمرار التخدير بنسبة 1.5-2٪ على وسادة تسخين مع حصيرة غير عاكسة أسفل جهاز تصوير دوبلر بالليزر (LDI).
3. ضع العاصبة حول الطرف الخلفي الأيسر (الشكل 1).
   ملاحظة: لا تغلق العاصبة بعد. قم بقياس تدفق الدم أولا (انظر القسم 2).

2. قياس تدفق الدم بواسطة LDI

ملاحظة: تم قياس تدفق الدم لتأكيد الانسداد الصحيح وإعادة التروية كما هو موضح^{سابقا 7}.

1. ضع الفأر المخدر أسفل LDI (26 سم) على وسادة تسخين ذات سطح غير عاكس في وضع الانبطاح مع أرجل وأقدام مشدودة متجهة لأعلى.
2. التقط الصور عن طريق وضع الماوس داخل منطقة التقاط الليزر (16.1 سم × 16.1 سم).
   1. اضبط الليزر على سرعة مسح 4 مللي ثانية / بكسل. التقط الصور باستخدام البرنامج الاحتكاري بالضغط على زر التسجيل . التقط الصور قبل وأثناء الانسداد وأثناء إعادة التروية بالنقر فوق زر التسجيل .
      ملاحظة: الصور عبارة عن صور خريطة متعلقة بالتدفق. الأحمر هو تدفق الدم الجيد. الأزرق لا يتدفق الدم. تأكد في الصورة من أن الطرف الخلفي المغلق أزرق. وبالمثل ، تحقق من الصورة للتأكد من أن الطرف الخلفي المسدود سابقا أحمر عند إعادة التروية. من الضروري أن يكون لديك حصيرة غير عاكسة ل LDI. خلاف ذلك ، سيؤثر الانعكاس على الصور.
3. قم بتحليل الصور باستخدام البرنامج المقدم من خلال تحديد منطقة الاهتمام. حدد نسبة بين الساقين الإقفارية والساقين الضابطة.

3. بروتوكول نقص التروية وإعادة التروية

1. أغلق العاصبة حول الطرف الخلفي للفأر المخدر لمدة 3 ساعات.
   ملاحظة: يؤدي شد العاصبة إلى نقص تروية ، مما يؤدي إلى مقاطعة تدفق الدم.
2. افتح العاصبة بعد 3 ساعات من الانسداد ؛ افتح الطرف الخلفي وقم بفتحه لمدة 15 أو 30 دقيقة.

4. حصاد الأنسجة

1. زيادة التخدير إلى 5٪ الأيزوفلوران لتخدير الفئران بعمق. قم بإجراء استرواح الصدر عن طريق فتح تجويف الصدر بمقص حاد لضمان الموت. حصاد عضلات المعدة وعضلات الفخذ^8،9،10.
2. قم بتجميد الأنسجة المجمعة في النيتروجين السائل وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.

5. تطبيق NIR

ملاحظة: يتم تطبيق NIR لتقليل الالتهاب وتقليل إصابة إعادة التروية.

1. ضع 670 نانومتر NIR بكثافة 100 ميجاوات لمدة 5 دقائق مرة واحدة في الساعة أثناء الانسداد.
2. استهدف الطرف الخلفي بمصدر ضوء الألياف الضوئية على مسافة 2.5 سم بين الطرف الخلفي والضوء. لا تعرض الساق المقابلة للأشعة تحت الحمراء (انظر الشكل 1 للإعداد).
3. قم بإضاءة ضوء NIR لمدة 5 دقائق في الساعة طوال فترة الإقفار.
4. قم بأداة المجموعة الوهمية بنفس الطريقة. لا تغلق العاصبة أو تضع الأشعة تحت الحمراء على الطرف الخلفي.
   ملاحظة: يحتوي ضوء NIR على مشتت حراري. لا ترتفع درجة الحرارة في غضون 5 دقائق من التعرض للضوء¹¹.

6. نخر TTC

ملاحظة: يتم تقييم نخر الأنسجة لتصور انخفاض النخر في الأنسجة العضلية.

1. تلطيخ عضلات الفخذ الطازجة باستخدام TTC عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة في 1٪ TTC في محلول فوسفات 0.1 متر معدل إلى درجة الحموضة 7.4.
2. راقب الأنسجة الحية الحمراء الملطخة بناء على وجود راسب فورمازان.
   ملاحظة: يعتمد التلوين الأحمر على تقليل TTC بواسطة إنزيمات نازعة الهيدروجين في الأنسجة السليمة. الأنسجة النخرية غير ملوثة¹⁰.
3. التقط صورا للشرائح الملطخة ب TTC لتحليلها وقياس المنطقة النخرية من خلال تحديد منطقة الاهتمام.

7. التحليل الغربي للكلوروتيروزين

1. إخضاع الفئران لبروتوكول نقص التروية/إعادة التروية (القسم 3).
2. حصاد الأنسجة (القسم 4) وعزل البروتين كما هو موضح^{سابقا 12}. حدد تركيز البروتين بواسطة اختبار برادفورد¹³.
3. استخدم محللة البروتين الكلي لإجراء الرحلان الكهربائي وصمة عار ل 3-كلوروتيروزين كما هو موضح^{سابقا 12}.
4. قم بإجراء وصمة عار غربية على محللات المعدة.
   1. أضف مخزن عينة Laemmli الذي يحتوي على 5٪ mercaptoethanol إلى العينات للحصول على تركيز 25 ميكروغرام من البروتين الكلي في 40 ميكرولتر.
   2. قم بتشغيل العينات على 4-15٪ من هلام Tris-glycine الممتد (انظر جدول المواد) عند 50 مللي فولت لمدة 5 دقائق. قم بزيادة الجهد إلى 100 مللي فولت لمدة 1 ساعة حتى تنفد واجهة الصبغة.
5. احتضان الجل في مخزن مؤقت للنقل 1x (25 ملي تريس ، 190 ملي جلايسين ، 20٪ ميثانول ؛ اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.3 إذا لزم الأمر) لمدة 10 دقائق.
6. قم بتجميع شطيرة النقل (إسفنجة ، فلتر ، جل ، غشاء السليلوز ، مرشح ، إسفنج). ضع كيس ثلج قابل لإعادة الاستخدام في جهاز النقل. نقل لمدة 30 دقيقة في غرفة التبريد عند 100 مللي أمبير.
   ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات محاصرة في شطيرة النقل ، وأن اللطخة على الكاثود والهلام على الأنود.
7. اشطف اللطخة وقم بسدها في المخزن المؤقت (انظر جدول المواد) باستخدام 0.05٪ توين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل اللطخة بمحلول ملحي مخزن في تريس (TBS) الذي يحتوي على 5٪ Tween ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها قبل إضافة الجسم المضاد الأساسي.
8. احتضان بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية متعددة النسيلة ل 3-كلوروتيروزين. تمييع الأجسام المضادة في المخزن المؤقت المانع بنسبة 0.05٪ توين (1: 1,000).
9. استخدم الحمار بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) ، والحمار المضاد للفأر IgG ، و HRP-المضاد للماعز IgG (تخفيف 1: 10,000) كأجسام مضادة ثانوية.
10. تصور نطاقات الهوية في البقع باستخدام كاشف التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) ونظام التصوير.
    1. امزج المكونات بناء على بروتوكول الشركة المصنعة واحتضانها باللطخة لمدة 3 دقائق لربط كواشف ECL بالعصابات ذات الاهتمام.
    2. صور اللطخة باستخدام نظام التصوير (انظر جدول المواد). استخدم برامج التصوير مثل ImageJ لقياس الكثافة وتطبيع قيم كثافة النطاقات ذات الأهمية لنطاقات التحكم.

8. ELISA ل CXCL1 و CXCL5

1. عزل البروتين الكلي من عضلات المعدة كما هو موضح^{سابقا 12}.
2. قم بتقييم درجة الالتهاب بواسطة ELISA ل CXCL1 و CXCL5 كما هو موضح سابقا¹⁴ ووفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

9. الترسيب المناعي متبوعا بالتحليل الغربي

1. إخضاع الفئران لبروتوكول نقص التروية / إعادة التروية (القسم 3).
2. احصد الأنسجة (القسم 4) وعزل البروتين كما هو موضح سابقا¹². حدد تركيز البروتين بواسطة اختبار برادفورد¹³.
3. لتركيز جزء البلاعم من محللة البروتين الكلي ، قم بإجراء ترسيب مناعي ل CD14 كما هو موضح سابقا¹⁵.
4. استخدم الراسب المناعي CD14 لإجراء الرحلان الكهربائي ولطخة CD206 و CD68 كما هو موضح سابقا¹².
5. قم بإجراء لطخة غربية على محللات المعدة كما هو موضح في القسم 7.
6. احتضان الرواسب المناعية بين عشية وضحاها باستخدام الأجسام المضادة الأولية متعددة النسيلة ل CD206 أو CD68. تمييع الأجسام المضادة 1: 200 في TBS.
7. استخدم الحمار المترافق HRP المضاد للفأر IgG و HRP-مضاد للماعز IgG (تخفيف 1: 10,000) كأجسام مضادة ثانوية.
8. قم بتطبيق كاشف ECL على اللطخة بعد خلط المكونات بناء على بروتوكول الشركة المصنعة واحتضانه لمدة 3 دقائق لتصور نطاقات الاهتمام. صور اللطخة باستخدام نظام التصوير.

10. التحليل الإحصائي

1. إجراء تحليل إحصائي للبيانات داخل المجموعات وفيما بينها مع تحليل التباين (ANOVA) للمقاييس المتكررة متبوعا بتعديل Bonferroni لاختبار Student's t ، ص ≤ 0.05.
2. عبر عن البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) أو متوسط ± الانحراف المعياري (SD).

أكدت قياسات التدفق نقص التروية وإعادة التروية
يتم تصوير وضع ضوء NIR والبروتوكول التجريبي في الشكل 1. تم تطوير نموذج نقص تروية الأطراف الخلفية للفئران واستخدامه لتقييم تأثير التعرض للأشعة تحت الحمراء على الأشعة تحت الحمراء على العضلات الهيكلية ...

تصف هذه الورقة واحدة من أولى الدراسات التي ركزت على الحد من إصابة إعادة التروية عن طريق العلاج بضوء الأشعة تحت الحمراء عن طريق تغيير الاستجابة الالتهابية في الطرف الخلفي. إصابة نقص التروية والعلاج بضوء الأشعة تحت الحمراء ليست جديدة تماما. ركزت دراسات أخرى على إعادة تروي...

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

نشكر قسم جراحة العظام على تمويل هذه الدراسة. كما نشكر بريان ليندمر وغرانت بروكل على دعمهما الفني.