缺血/再灌注损伤的非热红外光治疗及巨噬细胞分化的后续分析

我们描述了在缺血小鼠模型中通过 670 nm 照射减少再灌注损伤，并通过止血带放置再灌注。这种 670 nm 照射减少了炎症反应，减少了促炎巨噬细胞的数量，并增加了保护性巨噬细胞。

炎症过程引起的组织损伤和坏死是缺血再灌注损伤 （IRI） 的结果。在骨骼肌中，缺血会降低肌肉细胞的有氧能量容量，导致不利的生化改变和炎症。本研究的目的是表明，在缺血期间暴露于近红外光 （NIR） 除了减少促炎性 M1 和增加保护性 M2 巨噬细胞外，还通过减少坏死和炎症来降低 IRI。C57/Bl6 小鼠接受单侧止血带诱导的后肢缺血 3 小时，然后再灌注 15 或 30 分钟。将小鼠随机分为 3 组。第 1 组接受 IRI 和 30 min 再灌注。第 2 组接受 IRI 和 15 min 再灌注。每组由 50% 无 NIR 和 50% NIR 处理的小鼠组成，止血带闭合后暴露时间为 50 mW/cm² 5 分钟/1 小时。第 3 组是麻醉 3 小时的假动物，省略 IRI。

对所有小鼠进行激光多普勒血流成像，以确认缺血和再灌注。流数据表示为缺血肢体与对侧对照的比值。再灌注后对小鼠实施安乐死，收获股四头肌和腓肠肌。进行巨噬细胞标志物 CD68 （M1） 和 CD206 （M2） 的免疫沉淀和蛋白质印迹，并归一化为 CD14 表达。IRI 组炎症标志物 CXCL1 和 CXCL5 的表达经 NIR 显著降低。在接受 IR 和 NIR 的动物中观察到 CD68 的显着降低和 CD206 表达的增加。IRI 组的 NIR 减少了组织坏死，如 2,3,5-三苯基四唑氯化物 （TTC） 染色所示。研究结果表明，暴露于 NIR 会降低 IRI 并提高组织存活率。NIR 减少了炎症，减少了促炎性 M1，并增加了保护性 M2 巨噬细胞。暴露于 NIR 可减少炎症并增强再生，从而在缺血后保护组织。

缺血再灌注损伤 （IRI） 是血管损伤和长期使用手术止血带后出现的临床挑战。既往研究表明，60-90 分钟是热缺血时间的上限，超过此阈值可能会发生不可逆的组织损伤。与任何其他单一因素相比，温缺血时间的限制限制了血管不良肢体再植入的成功和挽救 ^1,2。

在骨骼肌中，缺血会降低细胞的有氧能力，导致急性炎症和不良的生化改变。再灌注会加剧这些影响，再灌注会刺激中性粒细胞的募集和自由基的产生，进一步损害骨骼肌。这可能是由血管闭塞引起的，无论是受伤的结果还是故意使用止血带来防止出血。这个过程中的一些关键介质是髓过氧化物酶 （MPO），这是一种由中性粒细胞表达的酶，是呼吸爆发功能和自由基产生不可或缺的酶³，以及 CXCL1 和 CXCL5 等趋化因子，用于将中性粒细胞募集到急性炎症部位⁴。

股动脉没有被解剖以模拟紧急情况下的开放止血带。这种方法还基于产生缺血和再灌注的可重复性以及一致的无血区域。先前的研究表明，暴露于波长为 670 nm 的非热红外 （NIR） 光下可以在几天内增加小鼠缺血性后肢的血管侧支，从而减轻 IRI⁵ 的影响。此外，先前的研究表明，NIR 光可诱导巨噬细胞极化为促炎 （M1） 或促愈合 （M2） 表型⁶。

任何可以最大限度地减少缺氧和再灌注后组织损伤和细胞死亡的治疗方法都有助于提高血管损伤后保肢的成功率。因此，总体目标是通过将 670 nm 光治疗作为其他治疗方式的可行选择来改善 IRI。本文基于以下假设：在缺血期间暴露于 NIR 光下通过诱导巨噬细胞呈现 M2 表型来减少趋化蛋白的分泌和炎症细胞的流入，从而减少炎症和组织坏死。

这项研究严格按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。该方案得到了机构动物护理和使用委员会的批准（方案：AUA#1517）。所有涉及小鼠的研究均按照 PHS 政策进行。

1. 止血带放置

注意：放置止血带以诱导缺血并实现无血手术区域。

1. 在诱导室中用异氟醚以 3-5% 的浓度麻醉 C57/Bl6 小鼠。
2. 当鼠标对脚趾挤压没有反应时，将鼠标从感应室中取出。将鼠标放在鼻锥中，在激光多普勒成像仪 （LDI） 下方带有非反射垫的加热垫上以 1.5-2% 的速度持续麻醉。
3. 将止血带放在左后肢周围（图 1）。
   注意： 暂时不要关闭止血带。首先测量血流（参见第 2 节）。

2. 通过 LDI 测量血流

注意：测量血流以确认如前所述⁷ 的正确闭塞和再灌注。

1. 将麻醉的鼠标放在 LDI 下方（26 厘米）以下的加热垫上，以俯卧姿势进行非反射表面，伸展双腿和爪子朝上。
2. 通过将鼠标置于激光的拍摄区域 （16.1 cm x 16.1 cm） 内来捕获图像。
   1. 将激光调整为 4 毫秒/像素的扫描速度。按下 录制 按钮，使用专有软件捕获图像。在闭塞之前、闭塞期间和再灌注期间通过单击 录制 按钮拍摄图像。
      注意：这些图像是与流相关的地图图像;红色是良好的血液流动;蓝色表示没有血液流动。在图像中确认被遮挡的后肢是蓝色的。同样，检查图像以确认先前闭塞的后肢在再灌注时为红色。必须为 LDI 配备非反光垫;否则，反射将影响图像。
3. 通过定义感兴趣区域，使用提供的软件分析图像。确定缺血腿和对照腿之间的比率。

3. 缺血和再灌注方案

1. 将麻醉小鼠后肢周围的止血带闭合 3 小时。
   注意：收紧止血带会产生缺血，中断血液流动。
2. 闭塞 3 小时后打开止血带;打开并灌注后肢 15 或 30 分钟。

4. 组织收获

1. 将麻醉剂增加到 5% 异氟醚以深度麻醉小鼠。用锋利的剪刀打开胸腔进行气胸，以确保死亡。收获 gastrocnemii 和股四头肌 ^8,9,10。
2. 将收集的组织在液氮中快速冷冻并储存在 -80 °C 以供进一步分析。

5. NIR 应用

注意：NIR 用于降低炎症和减少再灌注损伤。

1. 在闭塞期间，以 100 mW 的强度应用 670 nm NIR，每小时一次，持续 5 分钟。
2. 用光纤光源在后肢和光线之间 2.5 cm 的距离处瞄准后肢。不要将对侧腿暴露在 NIR 下（设置见 图 1 ）。
3. 在缺血期间每小时照射 NIR 灯 5 分钟。
4. 以相同的方式检测假组。不要关闭止血带或将 NIR 涂抹在后肢上。
   注意：NIR 灯有一个散热器。光照后 5 分钟内温度不升高¹¹.

6. 坏死 TTC

注意：评估组织坏死以可视化肌肉组织中坏死的减少。

1. 在 37 °C 下用 TTC 在 0.1 M 磷酸盐缓冲液中，在 0.1 M 磷酸盐缓冲液中染色新鲜的股四头肌 20-30 分钟，调节至 pH 7.4。
2. 根据甲臜沉淀物的存在观察红色、染色的活组织。
   注：红色染色基于健康组织中脱氢酶对 TTC 的还原。坏死组织未染色¹⁰.
3. 捕获 TTC 染色切片的图像进行分析，并通过定义感兴趣区域来测量坏死区域。

7. 氯酪氨酸的蛋白质免疫印迹分析

1. 使小鼠接受缺血/再灌注方案（第 3 节）。
2. 如前所述收获组织（第 4 节）并分离蛋白质¹².通过 Bradford 测定法测定蛋白质浓度¹³。
3. 如前所述，使用总蛋白裂解物进行 3-氯酪氨酸的电泳和印迹¹²。
4. 对 gastrocnemii 的裂解物进行蛋白质印迹。
   1. 向样品中加入含有 5% 巯基乙醇的 Laemmli 样品缓冲液，以获得 40 μL 中 25 μg 总蛋白的浓度。
   2. 在 4-15% Tris-甘氨酸扩展凝胶（参见 材料表）上以 50 mV 运行样品 5 分钟。将电压增加到 100 mV 1 小时，直到染料前沿用完。
5. 将凝胶在 1x 转印缓冲液（25 mM Tris、190 mM 甘氨酸、20% 甲醇;必要时将 pH 值调节至 8.3）中孵育 10 分钟。
6. 组装转移三明治（海绵、过滤器、凝胶、纤维素膜、过滤器、海绵）。将可重复使用的冰袋放入转移装置中。在冷藏室中以 100 mA 转移 30 分钟。
   注：确保转移三明治中没有气泡，印迹在阴极上，凝胶在阳极上。
7. 冲洗印迹并在室温下用 0.05% 吐温的封闭缓冲液（参见 材料表）封闭 30 分钟。在添加一抗之前，用含有 5% Tween 的 Tris 缓冲盐水 （TBS） 洗涤印迹 3 次，每次 5 分钟。
8. 与 3-氯酪氨酸一抗一抗孵育过夜。在含有 0.05% Tween （1：1,000） 的封闭缓冲液中稀释抗体。
9. 使用辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联的驴抗小鼠 IgG 和 HRP-抗山羊 IgG（1：10,000 稀释度）作为二抗。
10. 使用增强型化学发光 （ECL） 试剂和成像系统可视化印迹中的身份条带。
    1. 根据制造商的方案混合组分，并将其与印迹一起孵育 3 分钟，以将 ECL 试剂与感兴趣的条带结合。
    2. 用成像系统对印迹成像（参见 材料表）。使用 ImageJ 等成像软件测量密度并将感兴趣条带的密度值归一化为对照条带的密度值。

8. CXCL1 和 CXCL5 的 ELISA 检测

1. 如前所述，从胃中分离总蛋白¹².
2. 如前所述¹⁴ 并根据制造商的说明，通过 ELISA 评估 CXCL1 和 CXCL5 的炎症程度。

9. 免疫沉淀后进行蛋白质免疫分析

1. 使小鼠接受缺血/再灌注方案（第 3 节）。
2. 收获组织（第 4 节）并如前所述分离蛋白质¹²。通过 Bradford 测定法¹³ 测定蛋白质浓度。
3. 为了浓缩总蛋白裂解物的巨噬细胞组分，如前所述对 CD14 进行免疫沉淀¹⁵。
4. 如前所述，使用 CD14 免疫沉淀对 CD206 和 CD68 进行电泳和印迹¹²。
5. 如第 7 节所述，对 gastrocnemii 的裂解物进行蛋白质印迹。
6. 将免疫沉淀物与 CD206 或 CD68 的一抗多克隆抗体孵育过夜。在 TBS 中以 1：200 稀释抗体。
7. 使用 HRP 偶联的驴抗小鼠 IgG 和 HRP 抗山羊 IgG（1：10,000 稀释度）作为二抗。
8. 根据制造商的方案混合组分后，将 ECL 试剂涂在印迹上，并孵育 3 分钟以观察感兴趣的条带。使用成像系统对印迹进行成像。

10. 统计分析

1. 对组内和组间数据进行统计分析，对重复测量进行方差分析 （ANOVA），然后进行 Bonferroni 对学生 t 检验的修改，p ≤ 0.05。
2. 将数据表示为平均值±平均值的标准误差 （SEM） 或平均值±标准差 （SD）。

流量测量证实缺血和再灌注
NIR 光放置和实验方案如图 1 所示。开发小鼠后肢缺血模型并用于评估 NIR 暴露对骨骼肌 IRI 的影响。正如预期的那样，激光多普勒通量成像（图 2A）证实了止血带可有效诱导缺血，同时 NIR 处理 （n = 6） 和未光处理的后肢 （n = 6） 的血流恢复到接近基线水平。热成像（...

本文描述了首批关注通过改变后肢炎症反应通过 NIR 光治疗减少再灌注损伤的研究之一。缺血再灌注损伤和 NIR 光治疗并不完全是新颖的。其他研究集中在 NIR 光的缺血再灌注上。NIR 光治疗已成功用于减少缺血再灌注损伤后心肌增大和减少肾损伤。Quirk 等人报道了 NIR 应用后心肌梗死面积减小和缺血再灌注减少 16,17,18。

作者没有需要声明的利益冲突。

我们感谢骨外科资助这项研究。我们还要感谢 Brian Lindemer 和 Grant Broeckel 的技术支持。