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Method Article
我们描述了在缺血小鼠模型中通过 670 nm 照射减少再灌注损伤,并通过止血带放置再灌注。这种 670 nm 照射减少了炎症反应,减少了促炎巨噬细胞的数量,并增加了保护性巨噬细胞。
炎症过程引起的组织损伤和坏死是缺血再灌注损伤 (IRI) 的结果。在骨骼肌中,缺血会降低肌肉细胞的有氧能量容量,导致不利的生化改变和炎症。本研究的目的是表明,在缺血期间暴露于近红外光 (NIR) 除了减少促炎性 M1 和增加保护性 M2 巨噬细胞外,还通过减少坏死和炎症来降低 IRI。C57/Bl6 小鼠接受单侧止血带诱导的后肢缺血 3 小时,然后再灌注 15 或 30 分钟。将小鼠随机分为 3 组。第 1 组接受 IRI 和 30 min 再灌注。第 2 组接受 IRI 和 15 min 再灌注。每组由 50% 无 NIR 和 50% NIR 处理的小鼠组成,止血带闭合后暴露时间为 50 mW/cm2 5 分钟/1 小时。第 3 组是麻醉 3 小时的假动物,省略 IRI。
对所有小鼠进行激光多普勒血流成像,以确认缺血和再灌注。流数据表示为缺血肢体与对侧对照的比值。再灌注后对小鼠实施安乐死,收获股四头肌和腓肠肌。进行巨噬细胞标志物 CD68 (M1) 和 CD206 (M2) 的免疫沉淀和蛋白质印迹,并归一化为 CD14 表达。IRI 组炎症标志物 CXCL1 和 CXCL5 的表达经 NIR 显著降低。在接受 IR 和 NIR 的动物中观察到 CD68 的显着降低和 CD206 表达的增加。IRI 组的 NIR 减少了组织坏死,如 2,3,5-三苯基四唑氯化物 (TTC) 染色所示。研究结果表明,暴露于 NIR 会降低 IRI 并提高组织存活率。NIR 减少了炎症,减少了促炎性 M1,并增加了保护性 M2 巨噬细胞。暴露于 NIR 可减少炎症并增强再生,从而在缺血后保护组织。
缺血再灌注损伤 (IRI) 是血管损伤和长期使用手术止血带后出现的临床挑战。既往研究表明,60-90 分钟是热缺血时间的上限,超过此阈值可能会发生不可逆的组织损伤。与任何其他单一因素相比,温缺血时间的限制限制了血管不良肢体再植入的成功和挽救 1,2。
在骨骼肌中,缺血会降低细胞的有氧能力,导致急性炎症和不良的生化改变。再灌注会加剧这些影响,再灌注会刺激中性粒细胞的募集和自由基的产生,进一步损害骨骼肌。这可能是由血管闭塞引起的,无论是受伤的结果还是故意使用止血带来防止出血。这个过程中的一些关键介质是髓过氧化物酶 (MPO),这是一种由中性粒细胞表达的酶,是呼吸爆发功能和自由基产生不可或缺的酶3,以及 CXCL1 和 CXCL5 等趋化因子,用于将中性粒细胞募集到急性炎症部位4。
股动脉没有被解剖以模拟紧急情况下的开放止血带。这种方法还基于产生缺血和再灌注的可重复性以及一致的无血区域。先前的研究表明,暴露于波长为 670 nm 的非热红外 (NIR) 光下可以在几天内增加小鼠缺血性后肢的血管侧支,从而减轻 IRI5 的影响。此外,先前的研究表明,NIR 光可诱导巨噬细胞极化为促炎 (M1) 或促愈合 (M2) 表型6。
任何可以最大限度地减少缺氧和再灌注后组织损伤和细胞死亡的治疗方法都有助于提高血管损伤后保肢的成功率。因此,总体目标是通过将 670 nm 光治疗作为其他治疗方式的可行选择来改善 IRI。本文基于以下假设:在缺血期间暴露于 NIR 光下通过诱导巨噬细胞呈现 M2 表型来减少趋化蛋白的分泌和炎症细胞的流入,从而减少炎症和组织坏死。
这项研究严格按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。该方案得到了机构动物护理和使用委员会的批准(方案:AUA#1517)。所有涉及小鼠的研究均按照 PHS 政策进行。
1. 止血带放置
注意:放置止血带以诱导缺血并实现无血手术区域。
2. 通过 LDI 测量血流
注意:测量血流以确认如前所述7 的正确闭塞和再灌注。
3. 缺血和再灌注方案
4. 组织收获
5. NIR 应用
注意:NIR 用于降低炎症和减少再灌注损伤。
6. 坏死 TTC
注意:评估组织坏死以可视化肌肉组织中坏死的减少。
7. 氯酪氨酸的蛋白质免疫印迹分析
8. CXCL1 和 CXCL5 的 ELISA 检测
9. 免疫沉淀后进行蛋白质免疫分析
10. 统计分析
流量测量证实缺血和再灌注
NIR 光放置和实验方案如图 1 所示。开发小鼠后肢缺血模型并用于评估 NIR 暴露对骨骼肌 IRI 的影响。正如预期的那样,激光多普勒通量成像(图 2A)证实了止血带可有效诱导缺血,同时 NIR 处理 (n = 6) 和未光处理的后肢 (n = 6) 的血流恢复到接近基线水平。热成像(...
本文描述了首批关注通过改变后肢炎症反应通过 NIR 光治疗减少再灌注损伤的研究之一。缺血再灌注损伤和 NIR 光治疗并不完全是新颖的。其他研究集中在 NIR 光的缺血再灌注上。NIR 光治疗已成功用于减少缺血再灌注损伤后心肌增大和减少肾损伤。Quirk 等人报道了 NIR 应用后心肌梗死面积减小和缺血再灌注减少 16,17,18。
作者没有需要声明的利益冲突。
我们感谢骨外科资助这项研究。我们还要感谢 Brian Lindemer 和 Grant Broeckel 的技术支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2,3,5-Triphenyltetrazolium | Sigma Aldrich | 17779-10X10ML-F | 1% solution |
4–15% Criterio TGX Stain-Free Protein Gel | BioRad | #5678084 | Tris-glycine extended gels |
4x Laemmli Sample Buffer - 1610747 | BioRad | 16110747 | |
670 nm light source | NIR Technologies | custom made | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23227 | |
BioRad ChemiDoc | Bio-Rad | Imaging system | |
Bio-Rad | |||
β-mercaptoethanol | BioRad | 1610710 | |
CXCL1 ELISA | R&D Systems | DY453-05 | |
CXCL5 ELISA | R&D Systems | DX000 | |
Forane | Baxter | 1001936040 | isoflurane inhalant |
goat anti-rabbit IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2004 | 1:10,000 dilution |
Ice Accu ice pack | |||
Laser doppler Imager | Moor | MOORLDI2-HIR | |
monoclonal CD14 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-515785 | 1:200 dilution |
monoclonal CD206 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-58986 | 1:200 dilution |
monoclonal CD68 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-20060 | 1:200 dilution |
Pierce Protein free (TBS) blocking buffer | blocking buffer | ||
polyclonal Chlorotyrosine Antibody | Hycult | HP5002 | 1:1,000 dilution |
Protein A/G PLUS-Agarose | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2003 | |
Super Signal West Femto | ThermoFisher | 34095 | enhanced chemiluminescence reagent |
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