Nicht-thermische Infrarotlichtbehandlung von Ischämie-/Reperfusionsschäden und anschließende Analyse der Makrophagendifferenzierung

Wir beschreiben die Reduktion der Reperfusionsverletzung durch 670 nm Bestrahlung in einem Mausmodell der Ischämie und der Reperfusion durch Tourniquetplatzierung. Diese 670-nm-Bestrahlung reduzierte die Entzündungsreaktion, verringerte die Anzahl der proinflammatorischen Makrophagen und erhöhte die Anzahl der schützenden Makrophagen.

Gewebeschäden und Nekrosen durch entzündliche Prozesse sind eine Folge der Ischämie-Reperfusionsschädigung (IRI). In der Skelettmuskulatur reduziert die Ischämie die aerobe Energiekapazität der Muskelzellen, was zu unerwünschten biochemischen Veränderungen und Entzündungen führt. Das Ziel dieser Studie ist es zu zeigen, dass die Exposition gegenüber Nahinfrarotlicht (NIR) während einer Periode der Ischämie die IRI reduziert, indem sie Nekrose und Entzündung verringert, zusätzlich zur Verringerung des proinflammatorischen M1 und zur Erhöhung der schützenden M2-Makrophagen. C57/Bl6-Mäuse erhielten eine einseitige Tourniquet-induzierte Ischämie der Hintergliedmaßen für 3 Stunden, gefolgt von einer Reperfusion für 15 oder 30 Minuten. Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in 3 Gruppen eingeteilt. Gruppe 1 wurde einer IRI mit 30-minütiger Reperfusion unterzogen. Gruppe 2 wurde einer IRI mit einer 15-minütigen Reperfusion unterzogen. Jede Gruppe bestand zu 50 % aus no-NIR- und zu 50 % NIR-behandelten Mäusen mit einer Exposition von 50 mW/^cm2 für 5 min/1 h nach dem Tourniquet-Verschluss. Gruppe 3 waren Scheintiere, die 3 Stunden lang ohne IRI betäubt wurden.

Bei allen Mäusen wurde eine Laser-Doppler-Flow-Bildgebung durchgeführt, um Ischämie und Reperfusion zu bestätigen. Die Flow-Daten wurden als Verhältnis von ischämischer Extremität und kontralateraler Kontrolle ausgedrückt. Die Mäuse wurden nach der Reperfusion euthanasiert, und der Quadrizeps und der Gastrocnemius wurden entnommen. Es wurden Immunpräzipitation und Western Blot der Makrophagen-Marker CD68 (M1) und CD206 (M2) durchgeführt und auf CD14-Expression normalisiert. Die Expression der Entzündungsmarker CXCL1 und CXCL5 war in der IRI-Gruppe signifikant durch NIR reduziert. Eine signifikante Abnahme der CD68-Expression und eine Zunahme der CD206-Expression wurde bei Tieren beobachtet, die IR und NIR erhielten. Die Gewebenekrose war durch NIR in der IRI-Gruppe verringert, was durch die Färbung von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) sichtbar gemacht wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass die Exposition gegenüber NIR die IRI reduzierte und das Überleben des Gewebes verbesserte. NIR reduzierte die Entzündung, verringerte das proinflammatorische M1 und erhöhte die schützenden M2-Makrophagen. Die Exposition gegenüber NIR reduzierte die Entzündung und verbesserte die Regeneration, was zu einem Gewebeschutz nach Ischämie führte.

Die Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) ist eine klinische Herausforderung, die nach Gefäßverletzungen und der längeren Anwendung von chirurgischen Tourniquets auftritt. Frühere Studien haben gezeigt, dass 60-90 min die obere Schwelle für die warme Ischämiezeit ist, ab der es zu irreversiblen Gewebeschäden kommen kann. Mehr als jeder andere Einzelfaktor schränken die Einschränkungen der warmen Ischämiezeit den Erfolg und die Rettung der Reimplantation dysvaskulärer Gliedmaßen ein ^1,2.

In der Skelettmuskulatur reduziert die Ischämie die aerobe Kapazität der Zellen, was zu akuten Entzündungen und nachteiligen biochemischen Veränderungen führt. Diese Effekte werden durch die Reperfusion verschlimmert, die die Rekrutierung von Neutrophilen und die Produktion von freien Radikalen stimuliert und die Skelettmuskulatur weiter schädigt. Dies kann durch einen Gefäßverschluss geschehen, sei es als Folge einer Verletzung oder der absichtlichen Verwendung eines Tourniquets zur Vorbeugung von Blutungen. Einige der wichtigsten Mediatoren in diesem Prozess sind die Myeloperoxidase (MPO), ein Enzym, das von Neutrophilen exprimiert wird und ein wesentlicher Bestandteil der respiratorischen Burst-Funktion und der Produktion von freien Radikalen ist³, und Chemokine wie CXCL1 und CXCL5, die dazu dienen, Neutrophile an akute Entzündungsherde zu rekrutieren⁴.

Die Oberschenkelarterie wurde nicht präpariert, um im Notfall ein offenes Tourniquet nachzuahmen. Dieser Ansatz basiert auch auf der Reproduzierbarkeit der Schaffung von Ischämie und Reperfusion sowie einem konsistenten blutfreien Bereich. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass die Exposition gegenüber nicht-thermischem Infrarotlicht (NIR) mit einer Wellenlänge von 670 nm die Gefäßkollateralisierung in einer ischämischen Hintergliedmaße der Maus mit NIR-Exposition über Tage erhöhen kann, wodurch die Auswirkungen von IRI⁵ gemildert werden. Darüber hinaus haben frühere Forschungen gezeigt, dass NIR-Licht die Polarisation von Makrophagen in proinflammatorische (M1) oder proheilende (M2) Phänotypen induzieren kann⁶.

Jede Behandlung, die Gewebeschäden und Zelltod nach Hypoxie und Reperfusion minimieren kann, wäre vorteilhaft, um den Erfolg der Rettung von Gliedmaßen nach Gefäßverletzungen zu erhöhen. Daher besteht das übergeordnete Ziel darin, die IRI zu verbessern, indem die 670-nm-Lichtbehandlung als praktikable Option für andere Behandlungsmodalitäten eingeführt wird. Diese Arbeit basiert auf der Hypothese, dass die Exposition gegenüber NIR-Licht während einer Periode der Ischämie Entzündungen und Gewebenekrosen verringert, indem die Sekretion von chemoattraktierenden Proteinen und der Einstrom von Entzündungszellen verringert wird, indem Makrophagen einen M2-Phänotyp annehmen.

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt (Protokoll: AUA#1517). Alle Forschungen mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit den PHS-Richtlinien durchgeführt.

1. Platzierung des Tourniquets

HINWEIS: Ein Tourniquet wurde gelegt, um eine Ischämie zu induzieren und ein blutfreies Operationsfeld zu erreichen.

1. Eine C57/Bl6-Maus wird in der Induktionskammer mit Isofluran in einer Konzentration von 3-5% anästhesiert.
2. Nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer, wenn sie nicht auf Zehenzwicken reagiert. Platzieren Sie die Maus in einem Nasenkonus für eine fortgesetzte Anästhesie bei 1,5-2 % auf einem Heizkissen mit einer nicht reflektierenden Matte unter einem Laser-Doppler-Imager (LDI).
3. Legen Sie das Tourniquet um die linke Hintergliedmaße (Abbildung 1).
   HINWEIS: Schließen Sie das Tourniquet noch nicht. Messen Sie zuerst den Blutfluss (siehe Abschnitt 2).

2. Blutflussmessung mittels LDI

HINWEIS: Der Blutfluss wurde gemessen, um die korrekte Okklusion und Reperfusion wie zuvor beschrieben zu bestätigen⁷.

1. Legen Sie die betäubte Maus unterhalb des LDI (26 cm) auf ein Heizkissen mit entspiegelter Oberfläche in Bauchlage mit gestreckten Beinen und Pfoten nach oben.
2. Nehmen Sie Bilder auf, indem Sie die Maus innerhalb des Aufnahmebereichs des Lasers (16,1 cm x 16,1 cm) platzieren.
   1. Stellen Sie den Laser auf eine Scangeschwindigkeit von 4 ms/Pixel ein. Nehmen Sie Bilder mit der proprietären Software auf, indem Sie die Aufnahmetaste drücken. Nehmen Sie Bilder vor, während der Okklusion und während der Reperfusion auf, indem Sie auf die Aufnahmeschaltfläche klicken.
      HINWEIS: Bei den Bildern handelt es sich um flussbezogene Kartenbilder. Rot ist eine gute Durchblutung; Blau ist kein Blutfluss. Bestätigen Sie im Bild, dass die verschlossene Hintergliedmaße blau ist. Überprüfen Sie auf ähnliche Weise das Bild, um zu bestätigen, dass die zuvor verschlossene Hintergliedmaße bei der Reperfusion rot ist. Es ist zwingend erforderlich, eine nicht reflektierende Matte für den LDI zu haben; Andernfalls wirkt sich die Reflexion auf die Bilder aus.
3. Analysieren Sie die Bilder mit der bereitgestellten Software, indem Sie einen Interessenbereich definieren. Stellen Sie ein Verhältnis zwischen dem ischämischen Bein und dem Kontrollbein her.

3. Ischämie- und Reperfusionsprotokoll

1. Schließen Sie das Tourniquet um das Hinterbein der betäubten Maus für 3 Stunden.
   HINWEIS: Das Anziehen des Tourniquets führt zu einer Ischämie, die den Blutfluss unterbricht.
2. Öffnen Sie das Tourniquet nach 3 h Okklusion; Öffnen und perfundieren Sie die Hintergliedmaße für 15 oder 30 Minuten.

4. Gewebeentnahme

1. Erhöhen Sie die Anästhesie auf 5% Isofluran, um die Mäuse tief zu betäuben. Führen Sie einen Pneumothorax durch, indem Sie die Brusthöhle mit einer scharfen Schere öffnen, um den Tod zu gewährleisten. Entnahme der Gastrocnemii und der Quadrizepsmuskulatur ^8,9,10.
2. Das gesammelte Gewebe in flüssigem Stickstoff einfrieren und zur weiteren Analyse bei -80 °C lagern.

5. NIR-Anwendung

HINWEIS: NIR wird angewendet, um Entzündungen zu verringern und Reperfusionsschäden zu reduzieren.

1. Wenden Sie während der Okklusion einmal pro Stunde 670 nm NIR mit einer Intensität von 100 mW für 5 min an.
2. Richten Sie die hintere Gliedmaße mit der faseroptischen Lichtquelle in einem Abstand von 2,5 cm zwischen der hinteren Gliedmaße und dem Licht an. Setzen Sie das kontralaterale Bein nicht NIR aus (siehe Abbildung 1 für den Aufbau).
3. Lassen Sie das NIR-Licht für die Dauer der ischämischen Periode 5 Minuten pro Stunde leuchten.
4. Instrumentieren Sie die Scheingruppe auf die gleiche Weise. Schließen Sie das Tourniquet nicht und wenden Sie NIR nicht auf die Hintergliedmaßen an.
   HINWEIS: Die NIR-Leuchte verfügt über einen Kühlkörper. Die Temperatur steigt innerhalb von 5 Minuten nach Lichteinwirkung^{nicht an 11}.

6. Nekrose TTC

HINWEIS: Die Gewebenekrose wird bewertet, um die Verringerung der Nekrose im Muskelgewebe sichtbar zu machen.

1. Färben Sie frische Quadrizepsmuskeln mit TTC bei 37 °C für 20-30 min in 1% TTC in 0,1 M Phosphatpuffer, angepasst auf pH 7,4.
2. Beobachten Sie rotes, gefärbtes lebendes Gewebe, das auf dem Vorhandensein eines Formazan-Niederschlags basiert.
   HINWEIS: Die rote Färbung basiert auf der Reduktion von TTC durch Dehydrogenase-Enzyme in gesundem Gewebe. Nekrotisches Gewebe ist unverfärbt¹⁰.
3. Erfassen Sie Bilder von TTC-gefärbten Scheiben für die Analyse und messen Sie die nekrotische Region, indem Sie eine Region von Interesse definieren.

7. Westliche Analyse auf Chlorotyrosin

1. Mäuse dem Ischämie-/Reperfusionsprotokoll unterziehen (Abschnitt 3).
2. Gewebe entnehmen (Abschnitt 4) und Protein wie zuvor beschrieben^{isolieren 12}. Die Proteinkonzentration wird mit dem Bradford-Assay¹³ bestimmt.
3. Verwenden Sie das Gesamtproteinlysat, um eine Elektrophorese durchzuführen und auf 3-Chlorotyrosin zu tupfen, wie zuvor beschrieben¹².
4. Führen Sie einen Western Blot an den Lysaten der Gastrocnemii durch.
   1. Geben Sie Laemmli Probenpuffer mit 5 % Mercaptoethanol zu den Proben, um eine Konzentration von 25 μg Gesamtprotein in 40 μl zu erhalten.
   2. Führen Sie die Proben 5 Minuten lang auf einem 4-15%igen Tris-Glycin-verlängerten Gel (siehe Materialtabelle) bei 50 mV durch. Erhöhen Sie die Spannung auf 100 mV für 1 h, bis die Farbstofffront leer ist.
5. Inkubieren Sie das Gel in 1x Transferpuffer (25 mM Tris, 190 mM Glycin, 20% Methanol; stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf auf 8,3 ein) für 10 min.
6. Montieren Sie das Transfersandwich (Schwamm, Filter, Gel, Zellulosemembran, Filter, Schwamm). Legen Sie einen wiederverwendbaren Eisbeutel in das Transfergerät. Transfer für 30 min in den Kühlraum bei 100 mA.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Blasen im Transfersandwich eingeschlossen sind, der Blot befindet sich auf der Kathode und das Gel auf der Anode.
7. Spülen Sie den Blot aus und blockieren Sie ihn in einem Blockierungspuffer (siehe Materialtabelle) mit 0,05 % Tween für 30 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Blot dreimal für jeweils 5 Minuten mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), die 5 % Tween enthält, bevor Sie den primären Antikörper hinzufügen.
8. Über Nacht mit den primären polyklonalen Antikörpern gegen 3-Chlortyrosin inkubieren. Verdünnen Sie die Antikörper in Blockpuffer mit 0,05 % Tween (1:1.000).
9. Verwenden Sie Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertes Esel-Anti-Maus-IgG und HRP-Anti-Ziegen-IgG (1:10.000 Verdünnung) als sekundäre Antikörper.
10. Visualisieren Sie Identitätsbanden in den Blots mit Hilfe eines Reagenzes für erweiterte Chemilumineszenz (ECL) und eines Bildgebungssystems.
    1. Mischen Sie Komponenten basierend auf dem Protokoll des Herstellers und inkubieren Sie sie 3 Minuten lang mit dem Blot, um die ECL-Reagenzien an die interessierenden Banden zu binden.
    2. Bilden Sie den Blot mit einem bildgebenden System ab (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine Bildgebungssoftware wie ImageJ, um die Dichte zu messen und die Dichtewerte der interessierenden Banden mit denen der Kontrollbänder zu normalisieren.

8. ELISA für CXCL1 und CXCL5

1. Isolieren Sie das Gesamtprotein aus den Gastrocnemii-Muskeln, wie zuvor beschrieben¹².
2. Der Grad der Entzündung für CXCL1 und CXCL5 ist mittels ELISA zu beurteilen, wie zuvor beschrieben¹⁴ und gemäß den Anweisungen des Herstellers.

9. Immunpräzipitation mit anschließender westlicher Analyse

1. Die Mäuse sind dem Ischämie-/Reperfusionsprotokoll zu unterziehen (Abschnitt 3).
2. Ernte des Gewebes (Abschnitt 4) und Isolierung des Proteins wie zuvor beschrieben¹². Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay¹³.
3. Um die Makrophagenfraktion des Gesamtproteinlysats zu konzentrieren, wird eine Immunpräzipitation für CD14 durchgeführt, wie zuvor^{beschrieben 15}.
4. Verwenden Sie das CD14-Immunpräzipitat, um eine Elektrophorese und einen Blot für CD206 und CD68 durchzuführen, wie zuvor beschrieben¹².
5. Führen Sie einen Western Blot an den Lysaten der Gastrocnemii durch, wie in Abschnitt 7 beschrieben.
6. Inkubieren Sie die Immunpräzipitate über Nacht mit den primären polyklonalen Antikörpern gegen CD206 oder CD68. Verdünnen Sie die Antikörper 1:200 in TBS.
7. Verwenden Sie HRP-konjugiertes Esel-Anti-Maus-IgG und HRP-Anti-Ziegen-IgG (1:10.000 Verdünnung) als Sekundärantikörper.
8. Tragen Sie das ECL-Reagenz auf den Blot auf, nachdem Sie die Komponenten basierend auf dem Protokoll des Herstellers gemischt haben, und inkubieren Sie 3 Minuten lang, um die interessierenden Banden zu visualisieren. Bilden Sie den Blot mit einem Bildgebungssystem ab.

10. Statistische Auswertung

1. Führen Sie eine statistische Analyse von Daten innerhalb und zwischen Gruppen mit Varianzanalyse (ANOVA) für wiederholte Messungen durch, gefolgt von Bonferroni's Modifikation des Student's t-Test, p ≤ 0,05.
2. Geben Sie Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) oder Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus.

Durchflussmessungen bestätigten Ischämie und Reperfusion
Die Platzierung des NIR-Lichts und das Versuchsprotokoll sind in Abbildung 1 dargestellt. Es wurde ein murines Ischämiemodell für die Hintergliedmaßen entwickelt und eingesetzt, um die Wirkung der NIR-Exposition auf die IRI der Skelettmuskulatur zu bewerten. Wie erwartet wurde durch die Bildgebung des Laser-Doppler-Flusses (Abbildung 2A) bestätigt...

Diese Arbeit beschreibt eine der ersten Studien, die sich auf die Verringerung von Reperfusionsschäden durch NIR-Lichtbehandlung durch Veränderung der Entzündungsreaktion in der Hintergliedmaße konzentrierte. Ischämie-Reperfusionsschäden und NIR-Lichtbehandlungen sind nicht völlig neu. Andere Studien konzentrierten sich auf die Ischämie-Reperfusion durch NIR-Licht. Die NIR-Lichtbehandlung wurde erfolgreich bei der Verringerung der Größe der Myokardinfrakte und der Verringerung ...

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Wir danken der Klinik für Orthopädische Chirurgie für die Finanzierung dieser Studie. Wir danken auch Brian Lindemer und Grant Broeckel für ihre technische Unterstützung.