טיפול באור אינפרא אדום לא תרמי בפגיעה באיסכמיה/רפרפוזיה וניתוח לאחר מכן של התמיינות מקרופאגים

אנו מתארים את הפחתת הפגיעה ברפרפוזיה על ידי הקרנה של 670 ננומטר במודל עכבר של איסכמיה ורפרפוזיה על ידי מיקום חוסם עורקים. הקרנה זו של 670 ננומטר הפחיתה את התגובה הדלקתית, הפחיתה את מספר המקרופאגים הפרו-דלקתיים והגדילה את המקרופאגים המגנים.

נזק לרקמות ונמק מתהליכים דלקתיים הם תוצאה של פגיעה חוזרת באיסכמיה (IRI). בשרירי השלד, איסכמיה מפחיתה את יכולת האנרגיה האירובית של תאי השריר, מה שמוביל לשינויים ביוכימיים שליליים ולדלקת. מטרת מחקר זה היא להראות כי חשיפה לאור קרוב לאינפרא אדום (NIR) במהלך תקופה של איסכמיה מפחיתה את IRI על ידי הפחתת נמק ודלקת בנוסף להפחתת M1 פרו-דלקתי והגברת מקרופאגים M2 מגנים. עכברי C57/Bl6 עברו איסכמיה חד צדדית הנגרמת על ידי חוסם עורקים בגפיים האחוריות במשך 3 שעות ואחריה רפרפוזיה למשך 15 או 30 דקות. עכברים חולקו באופן אקראי ל-3 קבוצות. קבוצה 1 עברה IRI עם 30 דקות רפרפוזיה. קבוצה 2 עברה IRI עם רפרפוזיה של 15 דקות. כל קבוצה כללה 50% עכברים ללא NIR ו-50% עכברים שטופלו ב-NIR עם חשיפה של 50 mW/cm² למשך 5 דקות/שעה לאחר סגירת חוסם העורקים. קבוצה 3 הייתה חיות דמה שהורדמו במשך 3 שעות תוך השמטת IRI.

הדמיית זרימת דופלר בלייזר בוצעה על כל העכברים כדי לאשר איסכמיה ורפרפוזיה. נתוני הזרימה באו לידי ביטוי כיחס בין הגפה האיסכמית לבקרה הנגדית. העכברים הומתו לאחר רפרפוזיה, והארבע ראשי והגסטרוקנמיוס נקצרו. משקעים חיסוניים וכתם מערבי של סמני מקרופאגים CD68 (M1) ו-CD206 (M2) בוצעו ונורמלו לביטוי CD14. הביטוי של סמני הדלקת CXCL1 ו-CXCL5 הופחת משמעותית על ידי NIR בקבוצת ה-IRI. ירידה משמעותית ב-CD68 ועלייה בביטוי CD206 נצפתה בבעלי חיים שקיבלו IR ו-NIR. נמק רקמות הופחת על ידי NIR בקבוצת ה-IRI, כפי שניתן לראות על ידי צביעה של 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC). הממצאים מראים כי חשיפה לקרינה בלתי מייננת הפחיתה את IRI ושיפרה את הישרדות הרקמות. NIR הפחית דלקת, הפחית M1 פרו-דלקתי והגדיל את המקרופאגים המגנים M2. חשיפה לקרינה בלתי מייננת הפחיתה את הדלקת והגבירה את ההתחדשות, מה שהוביל להגנה על הרקמות לאחר איסכמיה.

פגיעת איסכמיה רפרפוזיה (IRI) היא אתגר קליני הנראה בעקבות פגיעות בכלי הדם ושימוש ממושך בחוסמי עורקים כירורגיים. מחקרים קודמים הראו כי 60-90 דקות הוא הסף העליון לזמן איסכמיה חם, שמעבר לו יכול להתרחש נזק בלתי הפיך לרקמות. יותר מכל גורם יחיד אחר, המגבלות של זמן איסכמיה חמה מגבילות את ההצלחה וההצלה של השתלה מחדש של גפיים דיסוסקולריות ^1,2.

בשרירי השלד, איסכמיה מפחיתה את היכולת האירובית של התאים, מה שמוביל לדלקת חריפה ולשינויים ביוכימיים שליליים. השפעות אלו מחמירות על ידי רפרפוזיה, הממריץ את גיוס הנויטרופילים וייצור רדיקלים חופשיים, מה שפוגע עוד יותר בשריר השלד. זה יכול להתרחש מחסימת כלי דם, בין אם כתוצאה מפציעה ובין אם שימוש מכוון בחוסם עורקים למניעת דימום. חלק מהמתווכים העיקריים בתהליך זה הם מיאלופרוקסידאז (MPO), אנזים המתבטא על ידי נויטרופילים שהוא חלק בלתי נפרד מתפקוד פרץ הנשימה וייצור רדיקלים חופשיים³, וכימוקינים כגון CXCL1 ו-CXCL5 המשמשים לגיוס נויטרופילים לאתרים של דלקת חריפה⁴.

עורק הירך לא נותח כדי לחקות חוסם עורקים פתוח במקרה חירום. גישה זו מבוססת גם על יכולת השחזור של יצירת איסכמיה ורפרפוזיה כמו גם אזור עקבי ללא דם. מחקרים קודמים הראו כי חשיפה לאור אינפרא אדום לא תרמי (NIR) באורך גל של 670 ננומטר יכולה להגביר את הבטחונות של כלי הדם בגפה האחורית האיסכמית של עכבר עם חשיפה ל-NIR לאורך ימים, ולהפחית את ההשפעות של IRI⁵. בנוסף, מחקרים קודמים הראו שאור NIR יכול לגרום לקיטוב של מקרופאגים לפנוטיפים פרו-דלקתיים (M1) או פרו-ריפוי (M2)⁶.

כל טיפול שיכול למזער נזק לרקמות ומוות תאי בעקבות היפוקסיה ורפרפוזיה יועיל בהגברת ההצלחה של הצלת גפיים לאחר פגיעות בכלי הדם. לכן, המטרה הכוללת היא לשפר את IRI על ידי הכנסת טיפול באור 670 ננומטר כאופציה בת קיימא לשיטות טיפול אחרות. מאמר זה מבוסס על ההשערה שחשיפה לאור NIR במהלך תקופה של איסכמיה מפחיתה דלקת ונמק רקמות על ידי הפחתת הפרשת חלבונים כימואטרקנטיים וזרם של תאים דלקתיים על ידי גרימת מקרופאגים לקבל פנוטיפ M2.

מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (פרוטוקול: AUA#1517). כל המחקרים הכוללים עכברים נערכו בהתאם למדיניות PHS.

1. מיקום חוסמי עורקים

הערה: חוסם עורקים הונח כדי לגרום לאיסכמיה ולהשיג שדה כירורגי נטול דם.

1. להרדים עכבר C57/Bl6 עם איזופלורן בתא האינדוקציה בריכוז של 3-5%.
2. הסר את העכבר מתא האינדוקציה כאשר הוא אינו מגיב לצביטות בהונות. הנח את העכבר בקונוס אף להמשך הרדמה ב-1.5-2% על כרית חימום עם מחצלת לא רפלקטיבית מתחת להדמיית דופלר לייזר (LDI).
3. הניחו את חוסם העורקים סביב הגפה האחורית השמאלית (איור 1).
   הערה: אל תסגור את חוסם העורקים עדיין. מדוד תחילה את זרימת הדם (ראה סעיף 2).

2. מדידת זרימת דם על ידי LDI

הערה: זרימת הדם נמדדה כדי לאשר חסימה ועירוי תקינים כמתואר קודם לכן⁷.

1. הנח את העכבר המורדם מתחת ל-LDI (26 ס"מ) על כרית חימום עם משטח לא מחזיר אור במצב נוטה עם רגליים וכפות מתוחות כלפי מעלה.
2. צלם תמונות על-ידי הצבת העכבר בתוך אזור הצילום של הלייזר (16.1 ס"מ x 16.1 ס"מ).
   1. כוונן את הלייזר למהירות סריקה של 4 אלפיות השנייה לפיקסל. צלם תמונות עם התוכנה הקניינית על ידי לחיצה על כפתור ההקלטה . צלם תמונות לפני, במהלך החסימה ובמהלך הרפרפוזיה על ידי לחיצה על כפתור ההקלטה .
      הערה: התמונות הן תמונות מפה הקשורות לזרימה; אדום הוא זרימת דם טובה; כחול הוא לא זרימת דם. ודא בתמונה שהגפה האחורית החסומה כחולה. באופן דומה, בדוק את התמונה כדי לאשר שהגפה האחורית שנחסמה בעבר אדומה ב-reperfusion. הכרחי שיהיה מחצלת לא רפלקטיבית עבור ה-LDI; אחרת, ההשתקפות תשפיע על התמונות.
3. נתח את התמונות עם התוכנה המסופקת על ידי הגדרת אזור עניין. קבע יחס בין הרגליים האיסכמיות לרגלי הבקרה.

3. פרוטוקול איסכמיה ורפרפוזיה

1. סגור את חוסם העורקים סביב הגפה האחורית של העכבר המורדם למשך 3 שעות.
   הערה: הידוק חוסם העורקים יוצר איסכמיה, קוטע את זרימת הדם.
2. פתח את חוסם העורקים לאחר 3 שעות של חסימה; פתח והחלחל את הגפה האחורית למשך 15 או 30 דקות.

4. קצירת רקמות

1. הגדל את ההרדמה ל-5% איזופלורן כדי להרדים עמוק את העכברים. בצע פנאומוטורקס על ידי פתיחת חלל החזה במספריים חדים כדי להבטיח מוות. קציר את שרירי הגסטרוקנמי והארבע ראשי ^8,9,10.
2. הקפיאו את הרקמה שנאספה בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס להמשך ניתוח.

5. יישום NIR

הערה: NIR מוחל כדי להוריד דלקת ולהפחית את פגיעת הרפרפוזיה.

1. יש למרוח 670 ננומטר NIR בעוצמה של 100 mW למשך 5 דקות פעם בשעה במהלך החסימה.
2. כוון את הגפה האחורית עם מקור האור של הסיבים האופטיים במרחק של 2.5 ס"מ בין הגפה האחורית לאור. אל תחשוף את הרגל הנגדית ל-NIR (ראה איור 1 להגדרה).
3. האירו את אור ה-NIR למשך 5 דקות לשעה למשך התקופה האיסכמית.
4. כלי את קבוצת הדמה באותו אופן. אין לסגור את חוסם העורקים או למרוח NIR על הגפה האחורית.
   הערה: לנורת ה-NIR יש גוף קירור. הטמפרטורה אינה עולה תוך 5 דקות מחשיפה לאור¹¹.

6. נמק TTC

הערה: נמק רקמות מוערך כדי לדמיין את הפחתת הנמק ברקמת השריר.

1. מכתים שרירי ארבע ראשי טריים עם TTC ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות ב-1% TTC במאגר פוספט 0.1 M מותאם ל-pH 7.4.
2. התבונן ברקמה חיה אדומה ומוכתמת על סמך נוכחות של משקע פורמזן.
   הערה: הצביעה האדומה מבוססת על הפחתת TTC על ידי אנזימי דהידרוגנאז ברקמה בריאה. רקמה נמקית אינה מוכתמת¹⁰.
3. צלם תמונות של פרוסות מוכתמות ב-TTC לניתוח ומדוד את האזור הנמק על ידי הגדרת אזור עניין.

7. ניתוח מערבי לכלורוטירוזין

1. הכניסו עכברים לפרוטוקול איסכמיה/רפרפוזיה (סעיף 3).
2. קצירת רקמות (סעיף 4) ובידוד חלבון כפי שתואר קודם לכן¹². קבע את ריכוז החלבון על ידי מבחן ברדפורד¹³.
3. השתמש בליזאט החלבון הכולל כדי לבצע אלקטרופורזה וכתם עבור 3-כלורוטירוזין כפי שתואר קודם לכן¹².
4. בצע כתם מערבי על ליזאטים של הגסטרוקנמי.
   1. הוסף לדגימות מאגר דגימת Laemmli המכיל 5% מרקפטואתנול כדי לקבל ריכוז של 25 מיקרוגרם של חלבון כולל ב-40 מיקרוליטר.
   2. הפעל את הדגימות על ג'ל מורחב של 4-15% טריס-גליצין (ראה טבלת החומרים) ב-50 mV למשך 5 דקות. הגדל את המתח ל-100 mV למשך שעה אחת עד שחזית הצבע נגמרת.
5. דגרו את הג'ל במאגר העברה 1x (25 מ"מ טריס, 190 מ"מ גליצין, 20% מתנול; התאם את ה-pH ל-8.3 במידת הצורך) למשך 10 דקות.
6. הרכיבו את כריך ההעברה (ספוג, פילטר, ג'ל, קרום תאית, פילטר, ספוג). הנח שקית קרח רב פעמית במנגנון ההעברה. מעבירים למשך 30 דקות בחדר הקירור בטמפרטורה של 100 מ"א.
   הערה: ודא שלא נלכדות בועות בכריך ההעברה, הכתם נמצא על הקתודה והג'ל על האנודה.
7. שטפו את הכתם וחסמו אותו במאגר חוסם (ראה טבלת החומרים) עם 0.05% טווין למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את הכתם עם תמיסת מלח Tris-buffered (TBS) המכילה 5% טווין שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת לפני הוספת הנוגדן העיקרי.
8. דגירה למשך הלילה עם הנוגדנים הפוליקלונליים העיקריים ל-3-כלורוטירוזין. לדלל את הנוגדנים במאגר חוסם עם 0.05% טווין (1:1,000).
9. השתמש ב-IgG מצומד של חמור פרוקסידאז (HRP) נגד עכברים ו-IgG נגד עזים (דילול של 1:10,000) כנוגדנים משניים.
10. דמיין רצועות זהות בכתמים באמצעות מגיב כימילומינסנציה משופר (ECL) ומערכת הדמיה.
    1. מערבבים רכיבים על סמך פרוטוקול היצרן ודוגרים אותם עם הכתם למשך 3 דקות כדי לקשור את ריאגנטים ECL לרצועות המעניינות.
    2. דמיין את הכתם עם מערכת הדמיה (ראה טבלת החומרים). השתמש בתוכנת הדמיה כגון ImageJ כדי למדוד את הצפיפות ולנרמל את ערכי הצפיפות של הרצועות המעניינות לאלו של רצועות הבקרה.

8. ELISA עבור CXCL1 ו-CXCL5

1. בודד חלבון כולל משרירי הגסטרוקנמי כפי שתואר קודם לכן¹².
2. העריכו את מידת הדלקת על ידי ELISA עבור CXCL1 ו-CXCL5 כפי שתואר קודם לכן¹⁴ ובהתאם להוראות היצרן.

9. משקעים חיסוניים ואחריהם ניתוח מערבי

1. הכניסו את העכברים לפרוטוקול איסכמיה/רפרפוזיה (סעיף 3).
2. קצור את הרקמות (סעיף 4) ובודד חלבון כפי שתואר קודם לכן¹². קבע את ריכוז החלבון על ידי מבחן ברדפורד¹³.
3. כדי לרכז את חלק המקרופאגים של ליזאט החלבון הכולל, בצע משקעים חיסוניים עבור CD14 כפי שתואר קודם לכן¹⁵.
4. השתמש ב-CD14 immunoprecipitate כדי לבצע אלקטרופורזה וכתם עבור CD206 ו-CD68 כפי שתואר קודם לכן¹².
5. בצע כתם מערבי על ליזאטים של הגסטרוקנמי כמתואר בסעיף 7.
6. דגרו על המשקעים החיסוניים למשך הלילה עם הנוגדנים הפוליקלונליים העיקריים ל-CD206 או CD68. לדלל את הנוגדנים ביחס של 1:200 ב-TBS.
7. השתמש ב-IgG מצומד חמור נגד עכבר וב-IgG נגד עזים (דילול 1:10,000) כנוגדנים משניים.
8. מרחו מגיב ECL על הכתם לאחר ערבוב רכיבים על סמך פרוטוקול היצרן ודגרו למשך 3 דקות כדי לדמיין את הרצועות המעניינות. דמיין את הכתם באמצעות מערכת הדמיה.

10. ניתוח סטטיסטי

1. בצע ניתוח סטטיסטי של נתונים בתוך ובין קבוצות עם ניתוח שונות (ANOVA) למדידות חוזרות ואחריו שינוי של Bonferroni במבחן t של הסטודנט, עמ' ≤ 0.05.
2. בטא נתונים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM) או ממוצע ± סטיית תקן (SD).

מדידות זרימה אישרו איסכמיה ורפרפוזיה
מיקום אור NIR ופרוטוקול הניסוי מתוארים באיור 1. מודל איסכמיה של הגפיים האחוריות של עכברים פותח והופעל כדי להעריך את ההשפעה של חשיפה ל-NIR על IRI של שרירי השלד. כצפוי, הדמיית שטף דופלר בלייזר (איור 2A

מאמר זה מתאר את אחד המחקרים הראשונים שהתמקדו בהפחתת פגיעת רפרפוזיה על ידי טיפול באור NIR על ידי שינוי התגובה הדלקתית בגפה האחורית. איסכמיה, פגיעת רפרפוזיה וטיפול באור NIR אינם חדשים לחלוטין. מחקרים אחרים התמקדו באיסכמיה על ידי אור NIR. טיפול באור NIR שימש בהצלחה בהפחתת גודל שב?...

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

אנו מודים למחלקה לכירורגיה אורתופדית על מימון מחקר זה. אנו מודים גם לבריאן לינדמר וגרנט ברוקל על תמיכתם הטכנית.