虚血/再灌流障害の非熱赤外光治療とその後のマクロファージ分化の解析

虚血のマウスモデルにおける670nm照射による再灌流障害の減少と止血帯の配置による再灌流について説明します。この670nmの照射は、炎症反応を減少させ、炎症誘発性マクロファージの数を減少させ、保護マクロファージを増加させた。

炎症過程による組織損傷と壊死は、虚血再灌流障害(IRI)の結果です。骨格筋では、虚血は筋肉細胞の有酸素エネルギー容量を減少させ、有害な生化学的変化や炎症を引き起こします。この研究の目標は、虚血期間中の近赤外光 (NIR) への曝露が、炎症誘発性 M1 の減少と保護 M2 マクロファージの増加に加えて、壊死と炎症を減少させることにより IRI を減少させることを示すことです。C57/Bl6マウスは、片側止血帯誘発性後肢虚血を3時間受けた後、15分または30分の再灌流を行った。マウスを3つのグループにランダムに割り当てました。グループ 1 は 30 分間の再灌流で IRI を受けました。グループ 2 は 15 分間の再灌流で IRI を受けました。各グループは、止血帯閉鎖後50 mW / cm 2の50 mW / cm² の曝露で、50%の非NIRマウスと50%NIR処理マウスで構成されていました。グループ 3 は、IRI を省略して 3 時間麻酔された偽動物でした。

レーザードップラーフローイメージングを全マウスで行い、虚血と再灌流を確認しました。血流データは、虚血性四肢と対側制御の比率として表されました。マウスは再灌流後に安楽死させ、大腿四頭筋と腓腹筋を採取しました。マクロファージマーカーCD68(M1)およびCD206(M2)の免疫沈降およびウェスタンブロットを実施し、CD14発現に標準化した。炎症マーカーCXCL1およびCXCL5の発現は、IRIグループでNIRによって有意に減少しました。CD68の有意な減少およびCD206発現の増加は、IRおよびNIRを投与された動物で観察された。組織壊死は、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色によって視覚化されるように、IRIグループのNIRによって減少しました。この知見は、NIRへの曝露がIRIを減少させ、組織の生存率を改善したことを示しています。NIRは炎症を抑制し、炎症誘発性M1を減少させ、保護的なM2マクロファージを増加させました。NIRへの曝露は炎症を軽減し、再生を促進し、虚血後の組織保護につながります。

虚血再灌流障害(IRI)は、血管損傷および外科的止血帯の長期使用後に見られる臨床課題です。以前の研究では、60〜90分が温虚血時間の上限しきい値であり、それを超えると不可逆的な組織損傷が発生する可能性があることが示されています。他のどの単一要因よりも、温性虚血の時間制限は、血管障害肢の再移植の成功と救済を制限します^1,2。

骨格筋では、虚血は細胞の好気性能力を低下させ、急性炎症と有害な生化学的変化を引き起こします。これらの影響は、好中球の動員とフリーラジカルの生成を刺激する再灌流によって悪化し、骨格筋をさらに損傷します。これは、怪我の結果であろうと、出血を防ぐための止血帯の意図的な使用であろうと、血管閉塞から発生する可能性があります。このプロセスにおける主要なメディエーターには、好中球によって発現する酵素であり、呼吸バースト機能とフリーラジカルの産生に不可欠であるミエロペルオキシダーゼ(MPO)^3と、急性炎症部位に好中球を動員する役割を果たすCXCL1やCXCL5などのケモカイン4^{があります。}

大腿動脈は、緊急時に開いた止血帯を模倣するために解剖されませんでした。このアプローチは、虚血と再灌流の再現性、および一貫した無血領域にも基づいています。これまでの研究では、波長670nmの非熱赤外(NIR)光への曝露により、NIR曝露によるマウス虚血性後肢の血管側副化が数日にわたって増加し、IRI⁵の影響が緩和されることが実証されています。さらに、先行研究により、NIR光がマクロファージの分極を炎症誘発性(M1)または治癒促進性(M2)表現型に誘導できることが示されている⁶。

低酸素症および再灌流後の組織損傷および細胞死を最小限に抑えることができる治療法は、血管損傷後の四肢温存の成功率を高めるのに有益である。したがって、全体的な目標は、他の治療法の実行可能なオプションとして670nm光治療を導入することにより、IRIを改善することです。この論文は、虚血期間中にNIR光に曝露すると、化学誘引性タンパク質の分泌が減少し、マクロファージがM2表現型を取るように誘導することにより炎症細胞の流入が減少することにより、炎症と組織壊死が減少するという仮説に基づいています。

この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施されました。この議定書は、動物施設管理委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)によって承認されました(議定書:AUA#1517)。マウスを用いた研究は、すべてPHSの方針に則って行われました。

1.止血帯の配置

注:止血帯は、虚血を誘発し、無血の手術野を達成するために配置されました。

1. C57/Bl6マウスをイソフルランで3〜5%の濃度で誘導チャンバー内で麻酔します。
2. マウスがつま先のつま先に反応しない場合は、マウスを誘導チャンバーから取り外します。マウスをノーズコーンに置き、レーザードップラーイメージャー(LDI)の下に無反射マットを敷いた加熱パッドに1.5〜2%の麻酔を続けます。
3. 止血帯を左後肢の周りに置きます(図1)。
   注意: 止血帯はまだ閉じないでください。最初に血流を測定します(セクション2を参照)。

2. LDIによる血流計測

注:血流は、前述のように適切な閉塞と再灌流を確認するために測定されました⁷。

1. 麻酔をかけたマウスをLDI(26 cm)の下に置き、反射しない面を腹臥位にして、脚と足を上に向けています。
2. レーザーのキャプチャ領域(16.1 cm x 16.1 cm)内にマウスを置いて画像をキャプチャします。
   1. レーザーのスキャン速度を4 ms /ピクセルに調整します。 録画 ボタンを押すことにより、独自のソフトウェアで画像をキャプチャします。オクルージョン前、オクルージョン中、再灌流中に 、録画 ボタンをクリックして画像を撮影します。
      注: 画像はフロー関連のマップ イメージです。赤は血流が良いです。青は血流がない。閉塞した後肢が青色であることを画像で確認します。同様に、画像をチェックして、以前に閉塞した後肢が再灌流時に赤くなっていることを確認します。LDI用の無反射マットを用意することが不可欠です。そうしないと、反射が画像に影響を与えます。
3. 付属のソフトウェアを使用して、関心領域を定義することにより、画像を分析します。虚血性脚とコントロール脚の比率を確立します。

3. 虚血および再灌流プロトコール

1. 麻酔をかけたマウスの後肢の周りの止血帯を3時間閉じます。
   注:止血帯を締めると虚血が発生し、血流が遮断されます。
2. 閉塞の3時間後に止血帯を開きます。後肢を開いて15分または30分間灌流します。

4.ティッシュハーベスト

1. 麻酔を5%イソフルランに増やして、マウスに深く麻酔をかけます。死を確実にするために鋭利なハサミで胸腔を開くことによって気胸を行います。gastrocnemiiと大腿四頭筋^8,9,10を収穫します。
2. 採取した組織を液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存してさらに分析します。

5. NIRアプリケーション

注:NIRは、炎症を抑え、再灌流障害を軽減するために適用されます。

1. 閉塞中に1時間に1回、100mWの強度で670nmのNIRを5分間印加します。
2. 後肢と光の間に2.5cmの距離にある光ファイバー光源で後肢をターゲットにします。反対側の脚をNIRにさらさないでください(セットアップについては 図1 を参照)。
3. 虚血期の間、NIRライトを1時間あたり5分間照らします。
4. 同じ方法で偽のグループをインストルメント化します。止血帯を閉じたり、後肢にNIRを適用したりしないでください。
   メモ: NIR ライトにはヒートシンクがあります。光にさらされてから5分以内に温度は上昇しません¹¹。

6. 壊死TTC

注: 組織壊死は、筋肉組織の壊死の減少を視覚化するために評価されます。

1. pH 7.4に調整した0.1 Mリン酸緩衝液中の1% TTC中で、37°CのTTCで20〜30分間、新鮮な大腿四頭筋をTTCで染色します。
2. ホルマザン沈殿物の存在に基づいて、赤色に染色された生組織を観察します。
   注:赤色染色は、健康な組織におけるデヒドロゲナーゼ酵素によるTTCの減少に基づいています。壊死組織は未染色である¹⁰.
3. TTC染色されたスライスの画像をキャプチャして分析し、関心領域を定義することで壊死領域を測定します。

7. クロロチロシンのウェスタン分析

1. マウスを虚血/再灌流プロトコル(セクション3)にさらします。
2. 組織を採取し(セクション4)、前述のようにタンパク質を単離します¹²。Bradfordアッセイ¹³によりタンパク質濃度を決定する。
3. 全タンパク質溶解物を使用して電気泳動を行い、前述のように3-クロロチロシンをブロットします¹²。
4. gastrocnemiiのライセートでウェスタンブロットを行います。
   1. 5% メルカプトエタノールを含むLaemmli サンプルバッファーをサンプルに添加して、40 μL 中に 25 μg の総タンパク質濃度を得ます。
   2. 4-15% Tris-glycine 拡張ゲル( 材料表を参照)でサンプルを 50 mV で 5 分間分析します。染料のフロントがなくなるまで、電圧を100mVに1時間上げます。
5. ゲルを1xトランスファーバッファー(25 mM Tris、190 mM Glycine、20% methanol、必要に応じてpHを8.3に調整)で10分間インキュベートします。
6. トランスファーサンドイッチ(スポンジ、フィルター、ゲル、セルロースメンブレン、フィルター、スポンジ)を組み立てます。再利用可能なアイスパックを移送装置に入れます。冷蔵室で100mAで30分間移送します。
   注:トランスファーサンドイッチに気泡が閉じ込められていないこと、ブロットがカソードに、ゲルがアノードに付着していることを確認してください。
7. ブロットをすすぎ、ブロッキングバッファー( 材料表を参照)で0.05%Tweenで室温で30分間ブロックします。ブロットを5% Tweenを含むTris緩衝生理食塩水(TBS)で5分間ずつ3回洗浄してから、一次抗体を添加します。
8. 3-クロロチロシンに対する一次ポリクローナル抗体と一晩インキュベートします。ブロッキングバッファー中で抗体を0.05%Tween(1:1,000)で希釈します。
9. 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ロバ抗マウスIgGおよびHRP抗ヤギIgG(1:10,000希釈)を二次抗体として使用します。
10. 増強化学発光(ECL)試薬とイメージングシステムを使用して、ブロット中の同定バンドを可視化します。
    1. メーカーのプロトコールに基づいて成分を混合し、ブロットと3分間インキュベートして、ECL試薬を目的のバンドに結合させます。
    2. イメージングシステムでブロットをイメージングします( 材料の表を参照)。ImageJ などのイメージング ソフトウェアを使用して密度を測定し、対象のバンドの密度値をコントロール バンドの密度値に正規化します。

8. CXCL1およびCXCL5のELISA

1. 前に説明したように、腓腹筋から全タンパク質を分離します¹²。
2. CXCL1およびCXCL5のELISAによる炎症の程度を、前述の¹⁴ に従って、製造元の指示に従って評価します。

9. 免疫沈降とそれに続くウェスタン分析

1. マウスを虚血/再灌流プロトコルにさらします(セクション3)。
2. 組織を採取し(セクション4)、前に説明した¹²のようにタンパク質を単離します。Bradford Assay¹³によりタンパク質濃度を測定します。
3. 全タンパク質溶解物のマクロファージ画分を濃縮するために、前述したようにCD14の免疫沈降を行う¹⁵。
4. CD14免疫沈降物を使用して、前述の¹²と同様にCD206およびCD68の電気泳動およびブロットを行う。
5. セクション7で説明したように、gastrocnemiiのライセートに対してウェスタンブロットを行います。
6. 免疫沈降物をCD206またはCD68に対する一次ポリクローナル抗体と一晩インキュベートします。抗体をTBSで1:200に希釈します。
7. 二次抗体として、HRP標識ロバ抗マウスIgGおよびHRP抗ヤギIgG(1:10,000希釈)を使用します。
8. メーカーのプロトコールに基づいて成分を混合した後、ECL試薬をブロットに塗布し、3分間インキュベートして目的のバンドを視覚化します。イメージングシステムを使用してブロットをイメージングします。

10. 統計解析

1. 反復測定の分散分析 (ANOVA) を使用して、グループ内およびグループ間のデータの統計分析を実行し、その後、スチューデントの t 検定 p ≤ 0.05 を Bonferroni で修正します。
2. データを平均の平均±標準誤差(SEM)または平均±標準偏差(SD)として表します。

流量測定により虚血と再灌流が確認されました
近赤外光の配置と実験プロトコルを 図1に示します。マウスの後肢虚血モデルが開発され、骨格筋IRIに対するNIR曝露の影響を評価するために採用されました。予想通り、レーザードップラーフラックスイメージング(図2A)により、止血帯が虚血を誘発し、NIR処理...

この論文は、後肢の炎症反応を変化させることによるNIR光治療による再灌流障害の軽減に焦点を当てた最初の研究の1つについて説明しています。虚血再灌流障害とNIR光治療は、まったく新しいものではありません。他の研究では、NIR光による虚血再灌流に焦点を当てていました。NIR光治療は、心筋の縮小と虚血再灌流損傷後の腎障害の軽減に使用されています。Quirk...

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

この研究に資金を提供してくださった整形外科に感謝します。また、技術サポートを提供してくださった Brian Lindemer 氏と Grant Broeckel 氏にも感謝します。