허혈/재관류 손상의 비열적 적외선 치료 및 대식세포 분화의 후속 분석

우리는 허혈 및 지혈대 배치에 의한 재관류의 마우스 모델에서 670nm 조사에 의한 재관류 손상의 감소를 설명합니다. 이 670nm 방사선 조사는 염증 반응을 감소시키고 전염증성 대식세포의 수를 감소시키며 보호 대식세포를 증가시켰습니다.

염증 과정으로 인한 조직 손상 및 괴사는 허혈 재관류 손상(IRI)의 결과입니다. 골격근에서 허혈은 근육 세포의 유산소 에너지 용량을 감소시켜 부정적인 생화학적 변화와 염증을 유발합니다. 이 연구의 목표는 허혈 기간 동안 근적외선(NIR)에 노출되면 전염증성 M1이 감소하고 보호 M2 대식세포가 증가하는 것 외에도 괴사와 염증이 감소하여 IRI가 감소한다는 것을 보여주는 것입니다. C57/Bl6 마우스는 3시간 동안 편측 지혈대에 의한 뒷다리 허혈을 받은 후 15분 또는 30분 동안 재관류를 받았습니다. 마우스는 3개의 그룹에 무작위로 할당되었습니다. 그룹 1은 30분 재관류와 함께 IRI를 받았습니다. 그룹 2는 15분 재관류와 함께 IRI를 받았습니다. 각 그룹은 지혈대 폐쇄 후 5분/1시간 동안 50mW/cm² 에 노출된 50%의 NIR 처리 마우스와 50%의 NIR 처리 마우스로 구성되었습니다. 그룹 3은 IRI를 생략하고 3시간 동안 마취한 가짜 동물이었습니다.

허혈 및 재관류를 확인하기 위해 모든 마우스에서 레이저 도플러 흐름 이미징을 수행했습니다. 흐름 데이터는 허혈성 사지(ischemic limb)와 반대쪽 대조군(contralateral control)의 비율로 표현되었습니다. 쥐는 재관류 후 안락사시켰고, 대퇴사두근과 비복근을 수확했습니다. 대식세포 마커 CD68(M1) 및 CD206(M2)의 면역침전 및 웨스턴 블롯을 수행하고 CD14 발현으로 정규화했습니다. 염증 마커 CXCL1 및 CXCL5의 발현은 IRI 그룹에서 NIR에 의해 현저히 감소했습니다. IR 및 NIR을 투여받은 동물에서 CD68의 현저한 감소와 CD206 발현의 증가가 관찰되었습니다. 조직 괴사는 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색으로 시각화된 바와 같이 IRI 그룹에서 NIR에 의해 감소되었습니다. 이 연구 결과는 NIR에 대한 노출이 IRI를 감소시키고 조직 생존을 향상시킨다는 것을 보여줍니다. NIR은 염증을 감소시키고, 전염증성 M1을 감소시키며, 보호 M2 대식세포를 증가시켰습니다. NIR에 노출되면 염증이 감소하고 재생이 향상되어 허혈 후 조직이 보호됩니다.

허혈 재관류 손상(IRI)은 혈관 손상 및 수술용 지혈대의 장기간 사용에 따라 나타나는 임상적 과제입니다. 이전 연구에서는 60-90분이 온열 허혈 시간의 상한 임계값이며, 그 이상이면 돌이킬 수 없는 조직 손상이 발생할 수 있음을 보여주었습니다. 다른 어떤 단일 요인보다도, 온열 허혈 시간의 한계는 혈관곤란 사지의 재이식의 성공과 구제를 제한한다 ^1,2.

골격근에서 허혈은 세포의 유산소 능력을 감소시켜 급성 염증과 부정적인 생화학적 변화를 유발합니다. 이러한 효과는 재관류에 의해 악화되는데, 재관류는 호중구의 동원과 활성산소의 생성을 자극하여 골격근을 더욱 손상시킵니다. 이것은 부상의 결과이든 출혈을 방지하기 위해 지혈대를 의도적으로 사용하는 결과이든 혈관 폐색으로 인해 발생할 수 있습니다. 이 과정의 주요 매개체로는 호중구에서 발현되는 효소인 골수과산화효소(MPO)가 있으며,³ 급성 염증 부위로 호중구를 모집하는 역할을 하는 CXCL1 및 CXCL5와 같은 케모카인이 있습니다⁴.

대퇴 동맥은 응급 상황에서 열린 지혈대를 모방하기 위해 절개되지 않았습니다. 이 접근법은 또한 허혈 및 재관류를 생성하는 재현성뿐만 아니라 일관된 무혈 영역을 기반으로 합니다. 이전 연구에서는 670nm 파장의 비열 적외선(NIR)에 노출되면 며칠 동안 NIR에 노출된 쥐 허혈성 뒷다리의 혈관 담보를 증가시켜 IRI⁵의 영향을 완화할 수 있음을 입증했습니다. 또한 이전 연구에서는 NIR 광선이 대식세포의 편광을 전염증성(M1) 또는 촉진성(M2) 표현형으로 유도할 수 있음을 입증했습니다⁶.

저산소증과 재관류 후 조직 손상과 세포 사멸을 최소화할 수 있는 모든 치료법은 혈관 손상 후 사지 회수의 성공률을 높이는 데 도움이 될 것입니다. 따라서 전반적인 목표는 다른 치료 방식에 대한 실행 가능한 옵션으로 670nm 광선 처리를 도입하여 IRI를 개선하는 것입니다. 본 논문은 허혈 기간 동안 NIR 광선에 노출되면 대식세포가 M2 표현형을 갖도록 유도하여 화학유인 단백질의 분비와 염증 세포의 유입을 감소시켜 염증 및 조직 괴사를 감소시킨다는 가설에 근거하고 있습니다.

이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)의 권장 사항에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 이 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다(프로토콜: AUA#1517). 생쥐를 대상으로 한 모든 연구는 PHS 정책에 따라 수행되었습니다.

1. 지혈대 배치

참고: 허혈을 유도하고 무혈 수술 부위를 달성하기 위해 지혈대를 배치했습니다.

1. 유도 챔버에서 C57/Bl6 마우스를 이소플루란으로 3-5% 농도로 마취합니다.
2. 발가락 꼬집음에 반응하지 않을 때 유도 챔버에서 마우스를 제거합니다. 레이저 도플러 이미저(LDI) 아래에 무반사 매트가 있는 가열 패드에서 1.5-2%의 지속적인 마취를 위해 마우스를 콧방울에 놓습니다.
3. 지혈대를 왼쪽 뒷다리 주위에 놓습니다(그림 1).
   알림: 아직 지혈대를 닫지 마십시오. 먼저 혈류를 측정합니다(섹션 2 참조).

2. LDI에 의한 혈류 측정

참고: 앞서 설명한 바와 같이 적절한 폐색과 재관류를 확인하기 위해 혈류를 측정했습니다⁷.

1. LDI(26cm) 아래에 마취된 마우스를 다리와 발이 위를 향하도록 엎드린 자세로 표면이 반사되지 않는 가열 패드에 놓습니다.
2. 레이저의 캡처 영역(16.1cm x 16.1cm) 내에 마우스를 놓아 이미지를 캡처합니다.
   1. 레이저를 4ms/픽셀의 스캔 속도로 조정합니다. 기록 버튼을 눌러 독점 소프트웨어로 이미지를 캡처합니다. 오클루젼 전, 오클루젼 중, 재관류 중에 녹화 버튼을 클릭하여 이미지를 촬영합니다.
      참고: 이미지는 흐름과 관련된 맵 이미지입니다. 빨간색은 혈류가 좋다는 것입니다. 파란색은 혈류가 없습니다. 이미지에서 가려진 뒷다리가 파란색인지 확인합니다. 마찬가지로, 이미지를 확인하여 이전에 가려진 뒷다리가 재관류 시 빨간색인지 확인합니다. LDI를 위한 비반사 매트가 있어야 합니다. 그렇지 않으면 반사가 이미지에 영향을 미칩니다.
3. 관심 영역을 정의하여 제공된 소프트웨어로 이미지를 분석합니다. 허혈성 다리와 대조군 다리 사이의 비율을 설정합니다.

3. 허혈 및 재관류 프로토콜

1. 마취된 마우스의 뒷다리 주위의 지혈대를 3시간 동안 닫습니다.
   알림: 지혈대를 조이면 허혈이 발생하여 혈류가 중단됩니다.
2. 폐색 3시간 후 지혈대를 엽니다. 뒷다리를 열고 15분 또는 30분 동안 관류합니다.

4. 조직 수확

1. 마취를 5% 이소플루란으로 증가시켜 마우스를 심층 마취합니다. 날카로운 가위로 흉강을 열어 기흉을 시술하여 죽음을 확신한다. 비복근과 대퇴사두근 ^8,9,10을 수확합니다.
2. 수집된 조직을 액체 질소에 급속 동결하고 추가 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다.

5. NIR 응용 프로그램

참고: NIR은 염증을 낮추고 재관류 손상을 줄이기 위해 적용됩니다.

1. 폐색 중 한 시간에 한 번씩 100mW의 강도로 100mW의 강도로 5nm NIR을 적용합니다.
2. 뒷다리와 빛 사이의 2.5cm 거리에서 광섬유 광원으로 뒷다리를 조준합니다. 반대쪽 다리를 NIR에 노출시키지 마십시오(설정은 그림 1 참조).
3. 허혈 기간 동안 시간당 5분 동안 NIR 조명을 비춥니다.
4. 가짜 그룹을 같은 방식으로 계측합니다. 지혈대를 닫거나 뒷다리에 NIR을 적용하지 마십시오.
   알림: NIR 조명에는 방열판이 있습니다. 빛에 노출된 후 5분 이내에 온도가 상승하지 않음¹¹.

6. 괴사 TTC

참고: 조직 괴사는 근육 조직의 괴사 감소를 시각화하기 위해 평가됩니다.

1. pH 7.4로 조정된 0.1M 인산염 완충액에서 1% TTC로 37°C에서 20-30분 동안 TTC로 새로운 대퇴사두근을 염색합니다.
2. 포르마잔 침전물의 존재를 기반으로 붉게 염색된 살아있는 조직을 관찰합니다.
   참고: 적색 염색은 건강한 조직에서 탈수소효소에 의한 TTC 감소를 기반으로 합니다. 괴사성 조직이 염색되지 않음¹⁰.
3. 분석을 위해 TTC 염색 슬라이스의 이미지를 캡처하고 관심 영역을 정의하여 괴사 영역을 측정합니다.

7. 클로로티로신을 위한 서쪽 분석

1. 허혈/재관류 프로토콜(섹션 3)을 투여합니다.
2. 조직을 수확하고(섹션 4) 앞서 설명한 대로 단백질을 분리합니다¹². Bradford assay¹³으로 단백질 농도를 측정합니다.
3. 총 단백질 용해물을 사용하여 앞서 설명한 대로 전기영동을 수행하고 3-클로로티로신을 블롯합니다¹².
4. 비복근의 용해물에 서쪽 블롯을 수행합니다.
   1. 5% 메르캅토에탄올이 함유된 Laemmli 샘플 버퍼를 샘플에 추가하여 40μL에서 총 단백질 25μg의 농도를 얻습니다.
   2. 4-15% Tris-glycine 확장 겔( 재료 표 참조)에서 50mV에서 5분 동안 샘플을 실행합니다. 염료 프런트가 다 떨어질 때까지 1시간 동안 전압을 100mV로 높입니다.
5. 1x 전달 완충액(25mM Tris, 190mM 글리신, 20% 메탄올, 필요한 경우 pH 8.3으로 조정)에서 10분 동안 겔을 배양합니다.
6. 전사 샌드위치(스펀지, 필터, 젤, 셀룰로오스 멤브레인, 필터, 스폰지)를 조립합니다. 이송 장치에 재사용 가능한 얼음 팩을 놓습니다. 30mA로 저장실에서 100분 동안 전송합니다.
   알림: 전사 샌드위치에 기포가 갇혀 있지 않은지, 블롯이 음극에 있는지, 젤이 양극에 있는지 확인하십시오.
7. 블롯을 헹구고 실온에서 30분 동안 0.05% 트윈으로 블로킹 버퍼( 재료 표 참조)로 차단합니다. 1차 항체를 추가하기 전에 5% Tween이 함유된 Tris-buffered saline(TBS)으로 블롯을 5분씩 3회 세척합니다.
8. 3-클로로티로신에 대한 1차 다클론 항체로 밤새 배양합니다. 차단 버퍼의 항체를 0.05% Tween(1:1,000)으로 희석합니다.
9. 2차 항체로 horseradish peroxidase(HRP) 접합 당나귀 항-마우스 IgG 및 HRP-항-염소 IgG(1:10,000 희석)를 사용합니다.
10. 향상된 화학발광(ECL) 시약과 이미징 시스템을 사용하여 블롯의 동일성 띠를 시각화합니다.
    1. 제조업체의 프로토콜에 따라 성분을 혼합하고 3분 동안 블롯으로 배양하여 ECL 시약을 관심 밴드에 결합합니다.
    2. 이미징 시스템으로 블랏을 이미지화합니다( 재료 표 참조). ImageJ와 같은 이미징 소프트웨어를 사용하여 밀도를 측정하고 관심 대역의 밀도 값을 제어 대역의 밀도 값으로 정규화합니다.

8. CXCL1 및 CXCL5용 ELISA

1. 앞서 설명한 바와 같이 비복근에서 총 단백질을 분리한다¹².
2. 앞서 설명한 바와 같이 CXCL1 및 CXCL5에 대한 ELISA의 염증 정도를 평가하고,¹⁴ 및 제조업체의 지침에 따라 평가합니다.

9. 면역침전수에 이은 서양 분석

1. 마우스에 허혈/재관류 프로토콜(섹션 3)을 적용합니다.
2. 조직을 수확하고(섹션 4) 앞서 설명한 대로 단백질을 분리합니다¹². Bradford Assay¹³으로 단백질 농도를 측정합니다.
3. 총 단백질 용해물의 대식세포 분획을 농축하려면 앞서 설명한 대로 CD14에 대한 면역침전을 수행합니다¹⁵.
4. CD14 면역침전물을 사용하여 앞서 설명한 대로 CD206 및 CD68에 대한 전기영동 및 블롯을 수행합니다¹².
5. 섹션 7에 설명된 대로 비복근의 용해물에 웨스턴 블롯을 수행합니다.
6. CD206 또는 CD68에 대한 1차 다클론 항체와 함께 면역침전물을 하룻밤 동안 배양합니다. TBS에서 항체를 1:200으로 희석합니다.
7. HRP-conjugated donkey anti-mouse IgG 및 HRP-anti-goat IgG(1:10,000 희석)를 2차 항체로 사용합니다.
8. 제조업체의 프로토콜에 따라 성분을 혼합한 후 ECL 시약을 블롯에 적용하고 3분 동안 배양하여 관심 밴드를 시각화합니다. 이미징 시스템을 사용하여 블롯을 이미지화합니다.

10. 통계 분석

1. Bonferroni의 스튜던 트 t-검정 수정, p ≤ 0.05에 이어 반복 측정에 대한 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 그룹 내 및 그룹 간 데이터의 통계 분석을 수행합니다.
2. 데이터를 평균 ± 표준 오차(SEM) 또는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현합니다.

유량 측정으로 허혈 및 재관류 확인
NIR 광 배치 및 실험 프로토콜은 그림 1에 나와 있습니다. 쥐 뒷다리 허혈 모델이 개발되어 골격근 IRI에 대한 NIR 노출의 영향을 평가하기 위해 사용되었습니다. 예상했던 대로, 레이저 도플러 플럭스 영상(그림 2A)은 지혈대가 NIR 처리(n = 6)와 빛 처리되지 않은 뒷다리(n = 6) 모두?...

이 논문은 뒷다리의 염증 반응을 변화시켜 NIR 광선 치료에 의한 재관류 손상 감소에 초점을 맞춘 최초의 연구 중 하나를 설명합니다. 허혈, 재관류 손상 및 NIR 광선 치료는 완전히 새로운 것은 아닙니다. 다른 연구는 NIR 광선에 의한 허혈 재관류에 초점을 맞췄습니다. NIR 광선 치료는 허혈 재관류 손상 후 심근 굴절 크기 감소 및 신장 손상 감소에 성공적으로 사용되었습니...

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

이 연구에 자금을 지원해 주신 정형외과에 감사드립니다. 또한 기술 지원을 제공해 주신 Brian Lindemer와 Grant Broeckel에게도 감사드립니다.