Trattamento con luce infrarossa non termica del danno da ischemia/riperfusione e successiva analisi della differenziazione dei macrofagi

Descriviamo la riduzione del danno da riperfusione mediante irradiazione a 670 nm in un modello murino di ischemia e riperfusione mediante posizionamento del laccio emostatico. Questa irradiazione di 670 nm ha ridotto la risposta infiammatoria, diminuito il numero di macrofagi proinfiammatori e aumentato i macrofagi protettivi.

Il danno tissutale e la necrosi da processi infiammatori sono una conseguenza del danno da ischemia e riperfusione (IRI). Nel muscolo scheletrico, l'ischemia riduce la capacità energetica aerobica delle cellule muscolari, portando ad alterazioni biochimiche avverse e infiammazione. L'obiettivo di questo studio è dimostrare che l'esposizione alla luce nel vicino infrarosso (NIR) durante un periodo di ischemia riduce l'IRI diminuendo la necrosi e l'infiammazione, oltre a diminuire l'M1 proinfiammatorio e aumentare i macrofagi M2 protettivi. I topi C57/Bl6 sono stati sottoposti a ischemia degli arti posteriori indotta da laccio emostatico unilaterale per 3 ore, seguita da riperfusione per 15 o 30 minuti. I topi sono stati assegnati in modo casuale a 3 gruppi. Il gruppo 1 è stato sottoposto a IRI con riperfusione di 30 minuti. Il gruppo 2 è stato sottoposto a IRI con una riperfusione di 15 minuti. Ogni gruppo era composto per il 50% da topi trattati con NO-NIR e per il 50% da topi trattati con NIR con esposizione di 50 mW/^cm2 per 5 min/1 h dopo la chiusura del laccio emostatico. Il gruppo 3 era costituito da animali fittizi anestetizzati per 3 ore omettendo l'IRI.

L'imaging a flusso laser doppler è stato eseguito su tutti i topi per confermare l'ischemia e la riperfusione. I dati di flusso sono stati espressi come rapporto tra l'arto ischemico e il controllo controlaterale. I topi sono stati soppressi dopo la riperfusione e sono stati prelevati i quadricipiti e il gastrocnemio. L'immunoprecipitazione e il western blot dei marcatori macrofagici CD68 (M1) e CD206 (M2) sono stati eseguiti e normalizzati all'espressione di CD14. L'espressione dei marcatori infiammatori CXCL1 e CXCL5 è stata significativamente ridotta dalla NIR nel gruppo IRI. Una diminuzione significativa di CD68 e un aumento dell'espressione di CD206 sono stati osservati negli animali trattati con IR e NIR. La necrosi tissutale è stata ridotta dalla NIR nel gruppo IRI, come visualizzato dalla colorazione con 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC). I risultati dimostrano che l'esposizione alla NIR ha ridotto l'IRI e migliorato la sopravvivenza dei tessuti. La NIR ha ridotto l'infiammazione, diminuito l'M1 proinfiammatorio e aumentato i macrofagi M2 protettivi. L'esposizione alla NIR ha ridotto l'infiammazione e migliorato la rigenerazione, portando alla protezione dei tessuti dopo l'ischemia.

Il danno da ischemia e riperfusione (IRI) è una sfida clinica osservata in seguito a lesioni vascolari e all'uso prolungato di lacci emostatici chirurgici. Studi precedenti hanno dimostrato che 60-90 minuti è la soglia superiore per il tempo di ischemia calda, oltre il quale può verificarsi un danno tissutale irreversibile. Più di ogni altro singolo fattore, i limiti del tempo di ischemia calda limitano il successo e il salvataggio del reimpianto degli arti disvascolari ^1,2.

Nel muscolo scheletrico, l'ischemia riduce la capacità aerobica delle cellule, portando a infiammazione acuta e alterazioni biochimiche avverse. Questi effetti sono aggravati dalla riperfusione, che stimola il reclutamento di neutrofili e la produzione di radicali liberi, danneggiando ulteriormente il muscolo scheletrico. Ciò può verificarsi dall'occlusione vascolare, sia a seguito di una lesione che dell'uso intenzionale di un laccio emostatico per prevenire l'emorragia. Alcuni dei mediatori chiave in questo processo sono la mieloperossidasi (MPO), un enzima espresso dai neutrofili che è parte integrante della funzione respiratoria e della produzione di radicali liberi³, e le chemochine come CXCL1 e CXCL5 che servono a reclutare i neutrofili nei siti di infiammazione acuta⁴.

L'arteria femorale non è stata sezionata per imitare un laccio emostatico aperto in caso di emergenza. Questo approccio si basa anche sulla riproducibilità della creazione di ischemia e riperfusione, nonché su un'area priva di sangue coerente. Ricerche precedenti hanno dimostrato che l'esposizione a luce infrarossa non termica (NIR) con una lunghezza d'onda di 670 nm può aumentare la collateralizzazione vascolare in un arto posteriore ischemico di topo con esposizione NIR per giorni, mitigando gli effetti di IRI⁵. Inoltre, ricerche precedenti hanno dimostrato che la luce NIR può indurre la polarizzazione dei macrofagi in fenotipi proinfiammatori (M1) o procicatrizzanti (M2)⁶.

Qualsiasi trattamento in grado di ridurre al minimo il danno tissutale e la morte cellulare a seguito di ipossia e riperfusione sarebbe utile per aumentare il successo del salvataggio degli arti a seguito di lesioni vascolari. Pertanto, l'obiettivo generale è quello di migliorare l'IRI introducendo il trattamento con luce a 670 nm come opzione praticabile per altre modalità di trattamento. Questo articolo si basa sull'ipotesi che l'esposizione alla luce NIR durante un periodo di ischemia diminuisca l'infiammazione e la necrosi tissutale diminuendo la secrezione di proteine chemioattrattive e l'afflusso di cellule infiammatorie inducendo i macrofagi ad assumere un fenotipo M2.

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (Protocollo: AUA#1517). Tutte le ricerche sui topi sono state condotte in conformità con la politica PHS.

1. Posizionamento del laccio emostatico

NOTA: È stato posizionato un laccio emostatico per indurre l'ischemia e ottenere un campo chirurgico privo di sangue.

1. Anestetizzare un topo C57/Bl6 con isoflurano nella camera di induzione a una concentrazione del 3-5%.
2. Rimuovere il mouse dalla camera di induzione quando non risponde ai pizzicamenti delle dita. Posizionare il mouse in un cono nasale per un'anestesia continua all'1,5-2% su un termoforo con un tappetino non riflettente sotto un laser doppler imager (LDI).
3. Posizionare il laccio emostatico attorno all'arto posteriore sinistro (Figura 1).
   NOTA: Non chiudere ancora il laccio emostatico. Misurare prima il flusso sanguigno (vedere paragrafo 2).

2. Misurazione del flusso sanguigno mediante LDI

NOTA: Il flusso sanguigno è stato misurato per confermare la corretta occlusione e riperfusione come descritto in precedenza⁷.

1. Posizionare il mouse anestetizzato sotto l'LDI (26 cm) su un termoforo con superficie non riflettente in posizione prona con le gambe tese e le zampe rivolte verso l'alto.
2. Acquisisci immagini posizionando il mouse all'interno dell'area di acquisizione del laser (16,1 cm x 16,1 cm).
   1. Regolare il laser su una velocità di scansione di 4 ms/pixel. Cattura le immagini con il software proprietario premendo il pulsante di registrazione . Scatta immagini prima, durante l'occlusione e durante la riperfusione facendo clic sul pulsante di registrazione .
      NOTA: le immagini sono immagini di mappe relative al flusso; il rosso è un buon flusso sanguigno; Il blu non è flusso sanguigno. Conferma nell'immagine che l'arto posteriore occluso è blu. Allo stesso modo, controlla l'immagine per confermare che l'arto posteriore precedentemente occluso è rosso alla riperfusione. È imperativo avere un tappetino non riflettente per l'LDI; In caso contrario, il riflesso influenzerà le immagini.
3. Analizza le immagini con il software fornito definendo una regione di interesse. Stabilire un rapporto tra le gambe ischemiche e quelle di controllo.

3. Protocollo di ischemia e riperfusione

1. Chiudere il laccio emostatico attorno all'arto posteriore del topo anestetizzato per 3 ore.
   NOTA: Stringere il laccio emostatico crea ischemia, interrompendo il flusso sanguigno.
2. Aprire il laccio emostatico dopo 3 h di occlusione; Aprire e perfondere l'arto posteriore per 15 o 30 minuti.

4. Prelievo di tessuti

1. Aumentare l'anestesia al 5% di isoflurano per anestetizzare profondamente i topi. Esegui uno pneumotorace aprendo la cavità toracica con forbici affilate per garantire la morte. Raccogliere i muscoli gastrocnemi e quadricipiti ^8,9,10.
2. Congelare il tessuto raccolto in azoto liquido e conservarlo a -80 °C per ulteriori analisi.

5. Applicazione NIR

NOTA: Il NIR viene applicato per ridurre l'infiammazione e ridurre il danno da riperfusione.

1. Applicare 670 nm NIR a un'intensità di 100 mW per 5 minuti una volta all'ora durante l'occlusione.
2. Puntare l'arto posteriore con la sorgente luminosa a fibre ottiche a una distanza di 2,5 cm tra l'arto posteriore e la luce. Non esporre la gamba controlaterale al NIR (vedere la Figura 1 per la configurazione).
3. Illuminare la luce NIR per 5 minuti all'ora per tutta la durata del periodo ischemico.
4. Strumentalizza il gruppo fittizio allo stesso modo. Non chiudere il laccio emostatico né applicare NIR sull'arto posteriore.
   NOTA: La luce NIR è dotata di un dissipatore di calore. La temperatura non aumenta entro 5 minuti dall'esposizione alla luce¹¹.

6. Necrosi TTC

NOTA: La necrosi tissutale viene valutata per visualizzare la riduzione della necrosi nel tessuto muscolare.

1. Colorare i muscoli del quadricipite freschi con TTC a 37 °C per 20-30 minuti in TTC all'1% in tampone fosfato 0,1 M regolato a pH 7,4.
2. Osservare il tessuto vivo rosso e colorato in base alla presenza di un precipitato di formazan.
   NOTA: La colorazione rossa si basa sulla riduzione del TTC da parte degli enzimi deidrogenasi nei tessuti sani. Il tessuto necrotico non è colorato¹⁰.
3. Acquisisci immagini di fette colorate con TTC per l'analisi e misura la regione necrotica definendo una regione di interesse.

7. Analisi Western per la clorotirosina

1. Sottoporre i topi al protocollo di ischemia/riperfusione (sezione 3).
2. Raccogliere i tessuti (sezione 4) e isolare le proteine come descritto in precedenza¹². Determinare la concentrazione proteica mediante il saggio di Bradford¹³.
3. Utilizzare il lisato proteico totale per eseguire l'elettroforesi e il blot per la 3-clorotirosina come descritto in precedenza¹².
4. Eseguire un western blot sui lisati dei gastrocnemi.
   1. Aggiungere ai campioni il tampone campione Laemmli contenente il 5% di mercaptoetanolo per ottenere una concentrazione di 25 μg di proteine totali in 40 μl.
   2. Eseguire i campioni su un gel esteso di tris-glicina al 4-15% (vedere la Tabella dei materiali) a 50 mV per 5 minuti. Aumentare la tensione a 100 mV per 1 ora fino all'esaurimento del fronte del colorante.
5. Incubare il gel in 1 tampone di trasferimento (25 mM di Tris, 190 mM di glicina, 20% di metanolo; regolare il pH a 8,3 se necessario) per 10 minuti.
6. Assemblare il sandwich di trasferimento (spugna, filtro, gel, membrana di cellulosa, filtro, spugna). Inserire un impacco di ghiaccio riutilizzabile nell'apparecchio di trasferimento. Trasferimento per 30 minuti in cella frigorifera a 100 mA.
   NOTA: Assicurarsi che non vi siano bolle intrappolate nel sandwich di trasferimento, che la macchia sia sul catodo e che il gel sia sull'anodo.
7. Sciacquare la macchia e bloccarla nel tampone bloccante (vedere la Tabella dei materiali) con Tween allo 0,05% per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare il blot con soluzione salina tamponata con Tris (TBS) contenente il 5% di Tween tre volte per 5 minuti ciascuna prima di aggiungere l'anticorpo primario.
8. Incubare per una notte con gli anticorpi policlonali primari contro la 3-clorotirosina. Diluire gli anticorpi nel tampone bloccante con Tween allo 0,05% (1:1.000).
9. Utilizzare come anticorpi secondari le IgG anti-topo coniugate con perossidasi di rafano (HRP) e le IgG anti-capra HRP-anti-capra (diluizione 1:10.000).
10. Visualizzare le bande di identità nei blot utilizzando il reagente a chemiluminescenza potenziata (ECL) e un sistema di imaging.
    1. Miscelare i componenti in base al protocollo del produttore e incubarli con il blot per 3 minuti per legare i reagenti ECL alle bande di interesse.
    2. Visualizzare la macchia con un sistema di imaging (vedere la Tabella dei materiali). Utilizzare software di imaging come ImageJ per misurare la densità e normalizzare i valori di densità delle bande di interesse con quelli delle bande di controllo.

8. ELISA per CXCL1 e CXCL5

1. Isolare le proteine totali dai muscoli gastrocnemii come descritto in precedenza¹².
2. Valutare il grado di infiammazione mediante ELISA per CXCL1 e CXCL5 come precedentemente descritto¹⁴ e secondo le istruzioni del produttore.

9. Immunoprecipitazione seguita da analisi western

1. Sottoporre i topi al protocollo di ischemia/riperfusione (sezione 3).
2. Raccogliere i tessuti (sezione 4) e isolare le proteine come descritto in precedenza¹². Determinare la concentrazione proteica mediante il Bradford Assay¹³.
3. Per concentrare la frazione macrofagica del lisato proteico totale, eseguire un'immunoprecipitazione per CD14 come descritto in precedenza¹⁵.
4. Utilizzare l'immunoprecipitato CD14 per eseguire l'elettroforesi e il blot per CD206 e CD68 come descritto in precedenza¹².
5. Eseguire un western blot sui lisati dei gastrocnemi come descritto nel paragrafo 7.
6. Incubare gli immunoprecipitati durante la notte con gli anticorpi policlonali primari contro CD206 o CD68. Diluire gli anticorpi 1:200 in TBS.
7. Utilizzare le IgG anti-topo d'asino coniugate HRP e le IgG anti-capra HRP (diluizione 1:10.000) come anticorpi secondari.
8. Applicare il reagente ECL al blot dopo aver miscelato i componenti in base al protocollo del produttore e incubare per 3 minuti per visualizzare le bande di interesse. Visualizzare la macchia utilizzando un sistema di imaging.

10. Analisi statistica

1. Eseguire l'analisi statistica dei dati all'interno e tra i gruppi con analisi della varianza (ANOVA) per misure ripetute seguite dalla modifica di Bonferroni del t-test di Student, p ≤ 0,05.
2. Esprimere i dati come media ± errore standard della media (SEM) o media ± deviazione standard (SD).

Le misurazioni del flusso hanno confermato l'ischemia e la riperfusione
Il posizionamento della luce NIR e il protocollo sperimentale sono illustrati nella Figura 1. È stato sviluppato e utilizzato un modello murino di ischemia degli arti posteriori per valutare l'effetto dell'esposizione al NIR sull'IRI del muscolo scheletrico. Come previsto, l'imaging laser doppler a flusso (Figura 2A) ha verificato che il...

Questo articolo descrive uno dei primi studi a concentrarsi sulla riduzione del danno da riperfusione mediante trattamento con luce NIR modificando la risposta infiammatoria nell'arto posteriore. Il danno da ischemia-riperfusione e il trattamento con luce NIR non sono del tutto nuovi. Altri studi si sono concentrati sulla riperfusione ischemica mediante luce NIR. Il trattamento con luce NIR è stato utilizzato con successo nella riduzione delle dimensioni dell'infract miocardico e nella ...

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamo il Dipartimento di Chirurgia Ortopedica per aver finanziato questo studio. Ringraziamo anche Brian Lindemer e Grant Broeckel per il loro supporto tecnico.